酶的分離和純化課件

1、1 第二章第二章 酶的分離和純化酶的分離和純化 Isolation and Purification of enzyme n方法概括方法概括 n原料處理：包括組織破碎、緩沖液抽原料處理：包括組織破碎、緩沖液抽 n粗分級：一般采用硫銨沉淀、乙醇沉淀粗分級：一般采用硫銨沉淀、乙醇沉淀 或其他方法或其他方法 n細(xì)分級：一般采用離子交換層析、凝膠細(xì)分級：一般采用離子交換層析、凝膠 層析、親和層析和電泳層析、親和層析和電泳 2 3 第一節(jié)第一節(jié) 原料選擇及預(yù)處理原料選擇及預(yù)處理 n動物原料動物原料：動物組織或臟器（活體取出）：動物組織或臟器（活體取出） 充充 分脫血分脫血 -10 -50保存保存 n植物

2、原料植物原料：植物原料：植物原料 磨碎磨碎 加入緩沖液抽加入緩沖液抽 提提 n植物原料特點：植物原料特點：1）纖維含量高）纖維含量高 2）酚酶活力）酚酶活力 高高 3）緩沖液）緩沖液pH易被細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)改變易被細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)改變 n微生物原料微生物原料：菌體培養(yǎng)：菌體培養(yǎng) 做酶活做酶活時間曲線時間曲線 確定最大酶活時間確定最大酶活時間 4 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 n微生物細(xì)胞破碎一般采用微生物細(xì)胞破碎一般采用 n1）化學(xué)法：堿；去垢劑；有機溶劑；酶解；冰凍化學(xué)法：堿；去垢劑；有機溶劑；酶解；冰凍 復(fù)融復(fù)融 n2）物理法：熱處理；滲透壓；減壓；聲波振蕩物理法：熱處理；滲透壓；減壓；聲波振蕩 n3）機械法：加

3、磨料；研磨；擠壓機械法：加磨料；研磨；擠壓 n4）緩沖液抽提緩沖液抽提 n抽提緩沖液的加入要少量多次，植物酶抽提時可加抽提緩沖液的加入要少量多次，植物酶抽提時可加 5mM的的Vc 5 第二節(jié)第二節(jié) 酶的粗提酶的粗提 n沉淀沉淀 n核酸沉淀：核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸、硫酸 魚精蛋白、鏈霉素可使核酸魚精蛋白、鏈霉素可使核酸 沉淀，離心除掉沉淀，離心除掉 （b）加入核）加入核 酸酶將其降解酸酶將其降解 n雜蛋白沉淀：根據(jù)目的酶的雜蛋白沉淀：根據(jù)目的酶的 特性方法各異特性方法各異 n選擇性沉淀（鹽析）：最常選擇性沉淀（鹽析）：最常 用的方法用的方法 6 n沉淀過程中隨時監(jiān)測蛋白濃度和酶活力沉淀過

4、程中隨時監(jiān)測蛋白濃度和酶活力 n 討論：討論： n（a）鹽的加入速度合適）鹽的加入速度合適 n（b）蛋白質(zhì)開始沉淀處的硫銨濃度與蛋白濃度有關(guān)）蛋白質(zhì)開始沉淀處的硫銨濃度與蛋白濃度有關(guān) n（c）硫銨濃度表示法；飽和度）硫銨濃度表示法；飽和度254.1M n（d）硫銨飽和溶液）硫銨飽和溶液pH7，若目的酶易酸變性必須用，若目的酶易酸變性必須用 緩沖液緩沖液 n（e）硫銨溶液密度較高（）硫銨溶液密度較高（1.24），故需較大離心力），故需較大離心力 n此步可除去此步可除去75%以上的雜蛋白，且可使蛋白濃縮以上的雜蛋白，且可使蛋白濃縮 7 透析與濃縮透析與濃縮 n1）透析袋處理：透析袋處理： n透析袋

5、透析袋 0.5M EDTA煮半小時煮半小時 蒸餾水煮半小時蒸餾水煮半小時 反復(fù)八次反復(fù)八次 帶橡皮手套用鑷子拿取帶橡皮手套用鑷子拿取 n2）透析除鹽：透析除鹽：200倍于被透析物；倍于被透析物；4小時換一次透小時換一次透 析液；監(jiān)測電導(dǎo)值析液；監(jiān)測電導(dǎo)值 nSephadex G25 除鹽：柱長除鹽：柱長50cm；上樣小于床；上樣小于床 體積的體積的20% n3）濃縮：濃縮：a）火棉膠）火棉膠 b）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG） n c）超濾（）超濾（3-5kg/cm2） d）凍干）凍干 8 透析技術(shù)原理圖透析技術(shù)原理圖 9 超濾技術(shù)原理圖超濾技術(shù)原理圖 10 第三節(jié)第三節(jié) 酶的精制酶的精制 一

6、、層析技術(shù)（一、層析技術(shù)（chromatography） 1）分配層析分配層析：物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同：物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同 a）紙層）紙層 b）薄層）薄層(比紙層靈敏比紙層靈敏100倍但剝板困難倍但剝板困難) c）柱層）柱層 2）吸附層析吸附層析（absorption chromatography）：吸附劑對：吸附劑對 通過它的物質(zhì)吸附力不同，吸附力包括離子引力、疏通過它的物質(zhì)吸附力不同，吸附力包括離子引力、疏 水作用、范德華力和氫鍵水作用、范德華力和氫鍵 a）薄層）薄層 b）柱層）柱層 n填料一般為硅膠、氧化鋁、磷酸鈣、活性白土和羥基填料一般為硅膠、氧化鋁、磷酸鈣、活性白土和羥基

7、 磷灰石；常用羥基磷灰石磷灰石；常用羥基磷灰石;帶正電帶正電, 穩(wěn)定范圍穩(wěn)定范圍pH5.5- 10, 吸附量吸附量1mg/g濕劑濕劑 11 紙層紙層 12 薄層薄層 13 3）離子交換層析離子交換層析（ion exchange chromatography） ： 交換劑上帶電荷，可根據(jù)樣品的電荷予以分離交換劑上帶電荷，可根據(jù)樣品的電荷予以分離 na）陽離子交換層析）陽離子交換層析 b）陰離子交換層析）陰離子交換層析 nc）離子交換劑的類型：離子交換樹脂、離子交換纖）離子交換劑的類型：離子交換樹脂、離子交換纖 維素、離子交換凝膠維素、離子交換凝膠 nd）實驗室常用的離子交換劑：陰離子交換劑）實驗

8、室常用的離子交換劑：陰離子交換劑DEAE- Cellulose、DEAE-Sephadex；陽離子交換劑；陽離子交換劑CM- Cellulose、CM- Sephadex ne）離子交換劑的預(yù)處理：去雜質(zhì)；溶脹；除小顆粒；）離子交換劑的預(yù)處理：去雜質(zhì)；溶脹；除小顆粒； 改型改型 n陽離子交換劑：陽離子交換劑： 堿堿水水酸酸水水平衡平衡 n陰離子交換劑：陰離子交換劑： 酸酸水水堿堿水水平衡平衡 14 nf）柱層析：床體積等于）柱層析：床體積等于2-5倍束縛樣品需倍束縛樣品需 要量；要量； 徑徑 高高 = 1 15 ； 上樣量不超過上樣量不超過 柱體積的柱體積的10%（*注意上樣方法）；洗脫注意上

9、樣方法）；洗脫 方法有兩種方法有兩種不連續(xù)梯度洗脫和連續(xù)梯不連續(xù)梯度洗脫和連續(xù)梯 度洗脫；分布收集器收集每管度洗脫；分布收集器收集每管2-3ml ng）交換劑后處理：飽和）交換劑后處理：飽和NaCl水水酸或酸或 堿堿水水平衡平衡 15 連續(xù)梯度洗脫連續(xù)梯度洗脫 n梯度混合器 16 離子交換層析離子交換層析 n陽離子交換劑陽離子交換劑 n陰離子交換劑陰離子交換劑 17 Anion exchange chromatography 18 4）凝膠層析（分子篩層析）（凝膠層析（分子篩層析）（gel filtration gel filtration chromatographychromatograp

10、hy）：根據(jù)分子量大小予以分離：根據(jù)分子量大小予以分離 na）凝膠預(yù)處理：凝膠）凝膠預(yù)處理：凝膠浸入洗脫液浸入洗脫液輕輕攪拌輕輕攪拌 n n 加熱加熱90-100（水浴加熱）（水浴加熱） nb）層析柱準(zhǔn)備：）層析柱準(zhǔn)備：2.5100柱；柱； 稠膠灌柱；稠膠灌柱； 2-3個個 床體積的緩沖液平衡；床體積的緩沖液平衡； 流速流速16-18ml/h nc）層析：蘭葡聚糖（分子量）層析：蘭葡聚糖（分子量2106）驗柱并求外水）驗柱并求外水 體積（體積（V0）；上樣量）；上樣量1-5% ； n恒壓洗脫；恒壓洗脫； 流速流速16-18ml/h nd）凝膠后處理：）凝膠后處理：0.5N NaOH+0.5N

11、NaCl處理后處理后4 保存保存 n長時間不用可采用乙醇脫水保存或低溫干燥保存長時間不用可采用乙醇脫水保存或低溫干燥保存 19 凝膠過濾層析原理圖凝膠過濾層析原理圖 20 Gel filtration chromatography 21 5）親和層析親和層析（affinity chromatography） 特異性結(jié)合特異性結(jié)合 na）關(guān)鍵：配體；配體與支持物的連接方法；吸附、洗脫條件）關(guān)鍵：配體；配體與支持物的連接方法；吸附、洗脫條件 nb）支持物的選擇：非特異性吸附作用低；液體流動性好；較寬）支持物的選擇：非特異性吸附作用低；液體流動性好；較寬 的的pH、離子強度；豐富的化學(xué)基團(tuán)；有效的多

12、孔性、離子強度；豐富的化學(xué)基團(tuán)；有效的多孔性 常用瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球常用瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球 nc）配體的選擇：有親和力但不易過大）配體的選擇：有親和力但不易過大 nd）配體與支持物的連接：載體結(jié)合法；物理吸附法；交聯(lián)法；）配體與支持物的連接：載體結(jié)合法；物理吸附法；交聯(lián)法； 包埋法（先活化支持物上的功能基團(tuán)再將配體連上去）包埋法（先活化支持物上的功能基團(tuán)再將配體連上去） ne） 吸附劑的衍生物：支持物吸附劑的衍生物：支持物+空間臂空間臂 nf） 層析條件的選擇：蛋白質(zhì)層析條件的選擇：蛋白質(zhì)+配體配體 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物配體復(fù)合物 起初配體濃度恒定，

13、隨蛋白濃度增加平衡右移（逐漸保留特性），起初配體濃度恒定，隨蛋白濃度增加平衡右移（逐漸保留特性）， 故親和力較低也能成功的親和。故親和力較低也能成功的親和。 g）洗脫：更高親和力的物質(zhì)置換；劇烈改變環(huán)境條件）洗脫：更高親和力的物質(zhì)置換；劇烈改變環(huán)境條件 22 親和層析原理親和層析原理 23 Affinity chromatography 24 二、超離心技術(shù)超離心技術(shù) 利用物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、利用物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、 浮力因子等方面的差別用強離心力進(jìn)行分離浮力因子等方面的差別用強離心力進(jìn)行分離 nF = w w2r （F 相對離心力相對離心力RCF；RCF以以g的倍數(shù)表的倍數(shù)表 示）示）

14、n RCF = w w2r/980 w = w = ( (轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)數(shù)/ /分）分）/ 30/ 30 n RCF = 1.11910-5 r(轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)數(shù)/分分)2 n離心機：離心機： na) 桌式：桌式：3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 紅血球、酵母細(xì)胞等粗沉淀物紅血球、酵母細(xì)胞等粗沉淀物 nb) 高速離心機：高速離心機：20000 25000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 一般實驗使一般實驗使 用但病毒、小細(xì)胞器或單個分子不能沉降用但病毒、小細(xì)胞器或單個分子不能沉降 nc) 超速離心機：超速離心機：75000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 分子生物學(xué)必備；能分分子生物學(xué)必備；能分 級只有在電鏡下才能看得見的亞細(xì)胞器級只有在電鏡下才能看得見的亞細(xì)胞器

15、25 二、電泳（二、電泳（electrophoresiselectrophoresis）技術(shù)）技術(shù) n1）原理：原理：M =d L / E t M: 遷移率遷移率 L: 顆粒泳動距離顆粒泳動距離 t: 通電時間通電時間 E: 電勢差電勢差 n遷移率與下列因素有關(guān)：遷移率與下列因素有關(guān)：a）樣品帶電狀態(tài)、分子形狀）樣品帶電狀態(tài)、分子形狀 與大小與大小 b）電場強度）電場強度 c）緩沖液）緩沖液pH的和離子強度的和離子強度 d）支持介質(zhì)的阻力、吸附作用）支持介質(zhì)的阻力、吸附作用 n2）電泳類型：）電泳類型：a）紙電泳）紙電泳 b）醋酸纖維薄膜電泳）醋酸纖維薄膜電泳 c）瓊脂糖電泳）瓊脂糖電泳 d）

16、聚丙烯酰胺凝膠電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳 26 PAGE和和SDS-PAGE n聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%； 過硫酸胺過硫酸胺,0.01-0.03%； n等電聚焦等電聚焦(isoelectric focusing)：兩性電解質(zhì)在電場作：兩性電解質(zhì)在電場作 用下建立一個用下建立一個pH梯度分離蛋白質(zhì)梯度分離蛋白質(zhì) n電泳檢測：電泳檢測：a）考馬斯亮蘭（氨基黑）染色法）考馬斯亮蘭（氨基黑）染色法 nb）熒光染色法）熒光染色法 c）特異酶檢測）特異酶檢測 d）其他染色法）其他染色法 27 盤狀電泳（盤狀電泳（A）和平板電泳（）和平板電泳（B） 28 第

17、四節(jié)第四節(jié) 提純過程中的定量提純過程中的定量 n蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度：1）雙縮脲法：）雙縮脲法：Cu+與肽鍵及酪氨酸殘基絡(luò)合顯與肽鍵及酪氨酸殘基絡(luò)合顯 色；測定濃度色；測定濃度0.5-10mg/ml n2）Lowry法：雙縮脲法的改進(jìn)，法：雙縮脲法的改進(jìn)，Cu+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中與蛋白質(zhì)在堿性溶液中 絡(luò)合，此絡(luò)合物還原絡(luò)合，此絡(luò)合物還原Folin試劑，測定濃度試劑，測定濃度20-400g/ml n3)紫外吸收法：紫外吸收法：Tyr、Trp、 Phe在在280nm有最大光吸收，此有最大光吸收，此 方法因上述三種氨基酸含量不同測定結(jié)果有誤差方法因上述三種氨基酸含量不同測定結(jié)果有誤差 測定濃度測

18、定濃度 0.1-0.5mg/ml n4 ） B r a d f o r d 法法 : 該 法 是 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 與 考 馬 斯 亮 藍(lán)該 法 是 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 與 考 馬 斯 亮 藍(lán) （coomassie brilliant blue）結(jié)合產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)在）結(jié)合產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)在 595nm有最大光吸收來測定蛋白質(zhì)濃度的。該方法簡單、快有最大光吸收來測定蛋白質(zhì)濃度的。該方法簡單、快 速、可靠、靈敏度高，可測定速、可靠、靈敏度高，可測定1-10m mg的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 n酶活力：檢測目的酶的活力酶活力：檢測目的酶的活力 n目的蛋白（非酶）檢測較困難目的蛋白（非酶）檢測較困難 29

19、第一次比活力 每次比活力 純化倍數(shù) = 回收率% = 100 第一次總活力 每次總活力 30 酶的提純過程記錄格式酶的提純過程記錄格式 步驟步驟 總體積總體積 （ml） 蛋白總蛋白總 量量 （mg） 總活總活 力（力（u） 比活比活 力力 （ u/m g） 回收回收 率率 （% ） 提提 純純 倍倍 數(shù)數(shù) 粗抽提液粗抽提液 50熱變性除雜熱變性除雜 硫銨分級沉淀（硫銨分級沉淀（ 30%-50%） DEAE-纖維素纖維素 離子交換離子交換 凝膠過濾凝膠過濾 SephadexG- 100 1000 1000 250 25 10 12000 8000 750 35 9.2 5000 48000 27

20、30 1820 1700 0.416 0.80 3.67 52 185 100 96 55 36.4 34 1.00 1.44 8.83 125 444 31 第五節(jié)第五節(jié) 酶蛋白分子量的測定 n滲透壓滲透壓法法 n超速離心法超速離心法 n凝膠層析凝膠層析法法 nSDS- -聚丙烯酰胺電泳聚丙烯酰胺電泳法 32 滲透壓法滲透壓法 nM為蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量（分子量），為蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量（分子量），R 為氣體常數(shù)（為氣體常數(shù)（0.082升升大氣壓大氣壓/摩爾摩爾/ 度），度），T為絕對溫度。為了測定蛋白質(zhì)為絕對溫度。為了測定蛋白質(zhì) 的分子量，分別取幾個不同的蛋白質(zhì)濃的分子量，分別取幾個不同的蛋白質(zhì)濃

21、 度度c，測出對應(yīng)的滲透壓，測出對應(yīng)的滲透壓，然后以，然后以/c 對對c作圖，并作延長線外推至作圖，并作延長線外推至c=0，得，得 到的到的y軸截距即為軸截距即為lim/c的值，代入上的值，代入上 式可求得分子量式可求得分子量M。 n滲 透 壓 法 適 合 測 定 分 子 量 范 圍 在滲 透 壓 法 適 合 測 定 分 子 量 范 圍 在 10,000100,000的蛋白質(zhì)。其優(yōu)點的蛋白質(zhì)。其優(yōu)點 是實驗裝置簡單，測定也較為準(zhǔn)確；缺是實驗裝置簡單，測定也較為準(zhǔn)確；缺 點是要求蛋白樣品純度高，否則測出的點是要求蛋白樣品純度高，否則測出的 將是溶液中各種蛋白的平均分子量。將是溶液中各種蛋白的平均分子量。 33 超速離心法超速離心法 )1 ( = D SRT M nM：分子量：分子量 S： 沉降系數(shù)沉降系數(shù) R：氣：氣 體常數(shù)體常數(shù) T：絕對：絕對 溫度溫度 D：擴散系：擴散系 數(shù)數(shù) ：溶質(zhì)分子：溶質(zhì)分子 微分比容微分比容 ：介：介 質(zhì)密度質(zhì)密度 34 SDS-聚丙烯酰胺電泳法聚丙烯酰胺電泳法 M 被測蛋白分子量被測蛋白分子量 a，b 常數(shù)，用已知分子量蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線求得常數(shù)，用已知分子量蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線求得 de 酶蛋白的泳動距離酶蛋白的泳動距離 do 小分子染料的泳動距離小分子染料的泳動距