專題課題DNA的粗提取與鑒定

1、一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) （一）提取生物大分子的基本思路：（一）提取生物大分子的基本思路： 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理 或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。 （二）（二）DNADNA的粗提取的粗提取 1 1、基本思路：、基本思路： 利用利用DNADNA與與RNARNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和 化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNADNA，去除其他成分。，去除其他成分。 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) （二）（二）DNADNA的粗提取的粗提取 2 2、DNADNA的特點(diǎn)：的特點(diǎn)： （1）溶解性）溶

2、解性 uDNA和蛋白質(zhì)等其他成分在和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度不同濃度NaCl溶溶 液中的溶解度不同液中的溶解度不同。 uDNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì) 則溶于酒精。則溶于酒精。 當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃 度為度為 2 mol2 molL L時(shí)，時(shí)，DNADNA的的 溶解度最大，濃度為溶解度最大，濃度為 0.14 0.14 molmolL L時(shí)，時(shí)，DNADNA的溶解度的溶解度 最低。利用這一原理，可最低。利用這一原理，可 以使以使DNADNA在鹽溶液中溶解在鹽溶液中溶解 或析出?；蛭龀?。 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) （二）（二）D

3、NADNA的粗提取的粗提取 2 2、DNADNA的特點(diǎn)：的特點(diǎn)： （2）耐受性）耐受性 u蛋白酶能水解蛋白質(zhì)蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但不能水解但不能水解DNA。 u大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080C的高溫，而的高溫，而 DNA在在80C以上才會(huì)變性。以上才會(huì)變性。 u洗滌劑可以瓦解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)洗滌劑可以瓦解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì), 但對但對DNA沒有影響。沒有影響。 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) （三）（三）DNADNA的鑒定的鑒定 u在沸水浴的條件下，在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。 u材料：材料：菜花、菜花、洋蔥洋蔥等。等。 二、實(shí)

4、驗(yàn)設(shè)計(jì)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) u選擇選擇原則原則： 含有含有DNADNA且且DNADNA含量相對較高含量相對較高的生物材料的生物材料。 （一）實(shí)驗(yàn)材料的選擇（一）實(shí)驗(yàn)材料的選擇 1 1、 雞是真核生物，真核生物的雞是真核生物，真核生物的DNADNA主要在染色體上。主要在染色體上。 2 2、鳥類的血細(xì)胞核大，、鳥類的血細(xì)胞核大，DNADNA多。多。 3 3、不需要破除細(xì)胞壁。、不需要破除細(xì)胞壁。 選擇雞血的原因：選擇雞血的原因： 問題問題1 1：有什么比較簡便但是可行的方法可以有什么比較簡便但是可行的方法可以 破碎破碎（如雞血細(xì)胞）的（如雞血細(xì)胞）的細(xì)胞膜細(xì)胞膜 （二）破碎細(xì)胞，獲取含（二）破碎細(xì)胞，獲取

5、含DNA的濾液的濾液 討論：為什么加討論：為什么加 入蒸餾水能使雞入蒸餾水能使雞 血細(xì)胞破裂？血細(xì)胞破裂？ 問題問題2 2：如果選擇植物材料，還可以通過加入如果選擇植物材料，還可以通過加入 一定量的蒸餾水來漲破細(xì)胞呢一定量的蒸餾水來漲破細(xì)胞呢 （二）破碎細(xì)胞，獲取含（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液的濾液 植物細(xì)胞需要先用一定的植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑洗滌劑和和食鹽食鹽溶解細(xì)胞溶解細(xì)胞 膜。膜。 實(shí)例：實(shí)例：提取洋蔥提取洋蔥DNADNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一 定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾 后收集研磨液。后

6、收集研磨液。 u洗滌劑洗滌劑的作用：的作用： 洗滌劑也分為親水基團(tuán)和親洗滌劑也分為親水基團(tuán)和親 脂基團(tuán)，可以與細(xì)胞膜中的蛋白脂基團(tuán)，可以與細(xì)胞膜中的蛋白 質(zhì)結(jié)合，使之溶解，進(jìn)而瓦解細(xì)質(zhì)結(jié)合，使之溶解，進(jìn)而瓦解細(xì) 胞膜。胞膜。 u食鹽食鹽的作用：的作用： 食鹽中主要含有食鹽中主要含有NaClNaCl，有利，有利 于于DNADNA的溶解。的溶解。 思考思考：洗滌劑和食鹽的作用是什么洗滌劑和食鹽的作用是什么 問題問題3 3：這時(shí)的濾液可能含有哪些細(xì)胞這時(shí)的濾液可能含有哪些細(xì)胞 成分？成分？ 主要有主要有DNADNA、RNARNA、核蛋白、多糖、核蛋白、多糖等等 我們應(yīng)該如何將我們應(yīng)該如何將DNADN

7、A單獨(dú)分離出來？單獨(dú)分離出來？ （三）去除濾液中的雜質(zhì)（三）去除濾液中的雜質(zhì) 方案一方案一 在濾液中加入在濾液中加入NaClNaCl，使，使NaClNaCl溶液濃度為溶液濃度為2mol/L2mol/L，過濾，過濾 除去除去不溶的雜質(zhì)不溶的雜質(zhì)，再加入蒸餾水，調(diào)節(jié)，再加入蒸餾水，調(diào)節(jié)NaClNaCl溶液濃度為溶液濃度為 0.14mol/L0.14mol/L，析出，析出DNADNA，過濾除去，過濾除去溶液中的雜質(zhì)溶液中的雜質(zhì)，再再用用2mol/L2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA。 為什么反復(fù)地溶解與析為什么反復(fù)地溶解與析 出出DNADNA，能夠去除雜質(zhì)？，能夠去除雜質(zhì)

8、？ u用用高濃度的鹽溶液溶解高濃度的鹽溶液溶解 DNADNA，能除去在高鹽中不，能除去在高鹽中不 能溶解的雜質(zhì)能溶解的雜質(zhì)。 u用用低濃度低濃度的的鹽鹽溶液溶液使使DNADNA 析出析出，能除去溶解在低鹽，能除去溶解在低鹽 溶液中的雜質(zhì)溶液中的雜質(zhì)。 （三）去除濾液中的雜質(zhì)（三）去除濾液中的雜質(zhì) 方案二方案二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng) 1015min1015min，其中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。，其中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。 方案三方案三：將濾液放在將濾液放在60756075C C的恒溫水浴箱的恒溫水浴箱 中保溫中保溫1015min 1015min 。 原

9、理：原理：蛋白酶能分解雜質(zhì)蛋白，但對蛋白酶能分解雜質(zhì)蛋白，但對DNADNA沒有影響，沒有影響， 從而使提取的從而使提取的DNADNA與蛋白質(zhì)分開。與蛋白質(zhì)分開。 原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60608080C C的高溫而的高溫而 變性，而變性，而DNADNA在在8080C C以上才會(huì)變性。以上才會(huì)變性。 貼壁緩慢地向?yàn)V液中加入與濾液等體積的、貼壁緩慢地向?yàn)V液中加入與濾液等體積的、冷卻冷卻的的酒酒 精溶液（精溶液（體積分?jǐn)?shù)為體積分?jǐn)?shù)為95%95%），靜置，靜置23min23min，溶液中出現(xiàn)白，溶液中出現(xiàn)白 色絲狀物后，用玻璃棒色絲狀物后，用玻璃棒沿沿一個(gè)方向緩慢、均勻地

10、攪拌一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢?，用玻，用?璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。 思考：白色絲狀物是什么？思考：白色絲狀物是什么？ DNA （四）（四）DNA的析出與鑒定的析出與鑒定 原理：原理：DNADNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì) 則可以溶于酒精。從而將則可以溶于酒精。從而將DNADNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。 1 1、DNADNA的析出：的析出： 2 2、DNADNA的鑒定的鑒定 （四）（四）DNA的析出與鑒定的析出與鑒定 試管一試管一試管二試管二 2 2mol/L NaClmol

11、/L NaCl 溶液溶液5 5 mL mL 2 2mol/L NaClmol/L NaCl 溶液溶液5 5 mL mL 絲狀物絲狀物 玻璃棒攪拌玻璃棒攪拌 加入加入 加入加入 再加入再加入 加入加入4mL4mL的的二苯胺試劑二苯胺試劑。 混合均勻后，混合均勻后，沸水浴沸水浴5min5min。 觀察溶液顏色是否觀察溶液顏色是否變藍(lán)變藍(lán) 自變量 鑒定時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中鑒定時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān)。的含量多少有關(guān)。 2 2、DNADNA的鑒定的鑒定 u用用甲基綠甲基綠溶液直接滴在有溶液直接滴在有DNADNA絲狀物絲狀物 的載玻片或的載玻片或玻璃玻璃棒上，呈棒上，呈綠色反應(yīng)綠色反應(yīng)。

12、 除了可以使用二苯胺除了可以使用二苯胺 法，還有什么方法可法，還有什么方法可 以鑒定以鑒定DNADNA？ u電泳法電泳法 u紫外燈照射法紫外燈照射法 17 實(shí)驗(yàn)操作小結(jié)實(shí)驗(yàn)操作小結(jié) 第一次第一次加蒸餾水，同一方向快速加蒸餾水，同一方向快速攪拌攪拌 加加檸檬酸鈉抗凝檸檬酸鈉抗凝，靜置或離心，然后過濾。靜置或離心，然后過濾。 過濾，除去細(xì)胞膜、核膜等核外物質(zhì)過濾，除去細(xì)胞膜、核膜等核外物質(zhì) 加加2mol/L 2mol/L NaClNaCl溶液溶液，同一方向，同一方向緩慢攪拌緩慢攪拌 冷卻酒精混合，析出白色絲狀物冷卻酒精混合，析出白色絲狀物 除去核蛋白、除去核蛋白、RNARNA、多糖等。、多糖等。

13、第二次第二次加加蒸餾水蒸餾水，稀釋至稀釋至0.14mol/L0.14mol/L，過，過 濾，再溶解到濾，再溶解到2mol/L 2mol/L NaClNaCl溶液。溶液。 除掉除除掉除DNADNA外的其他核內(nèi)物質(zhì)（如核蛋白）外的其他核內(nèi)物質(zhì)（如核蛋白） 二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色 1 1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要加入、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要加入檸檬酸鈉檸檬酸鈉，防止，防止 血液凝固，靜置后上層是血清，下層為所需要的血血液凝固，靜置后上層是血清，下層為所需要的血 細(xì)胞。細(xì)胞。 2 2、加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)、加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn) 生

14、大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精 和玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要和玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩輕緩，以免加劇以免加劇DNADNA分子分子 的斷裂的斷裂，導(dǎo)致，導(dǎo)致DNADNA分子不能形成絮狀沉淀。分子不能形成絮狀沉淀。 3 3、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。 操作提示操作提示 1 1、整個(gè)實(shí)驗(yàn)中加入、整個(gè)實(shí)驗(yàn)中加入“兩次蒸餾水，三次兩次蒸餾水，三次NaClNaCl溶液，一次酒精溶液，一次酒精” 兩次加蒸餾水的目的不同，一是漲破細(xì)胞，二是稀釋溶液。兩次加蒸餾水的目的不同，一是漲破細(xì)胞，二是稀釋溶

15、液。 酒精最好用酒精最好用95%95%的冷酒精的冷酒精; ; 操作提示操作提示 課后練習(xí)課后練習(xí) 1 1提取提取DNADNA的的第一步是材料的選取第一步是材料的選取，其目的是一定要選，其目的是一定要選 取取DNADNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或 多或少的損失而造成檢測的困難；多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是第二步是DNADNA的釋放的釋放 和溶解和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì) 胞內(nèi)的胞內(nèi)的DNADNA全部溶解；全部溶解；第三步是第三步是DNADNA的純化的純化，即根據(jù)，即

16、根據(jù)DNADNA 的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大 限度地將限度地將DNADNA與雜質(zhì)分開；與雜質(zhì)分開；最后一步是對最后一步是對DNADNA進(jìn)行鑒定進(jìn)行鑒定， 這是對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。這是對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。 2 2提取蛋白質(zhì)比提取提取蛋白質(zhì)比提取DNADNA的難度大的難度大。這是因?yàn)?，與。這是因?yàn)?，與 DNADNA相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃度、相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃度、pHpH等條件要敏感等條件要敏感 得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣， 理化性質(zhì)各不相同，使得

17、蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一 的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件， 設(shè)計(jì)特定的方法。設(shè)計(jì)特定的方法。 課后練習(xí)課后練習(xí) 23 C 0.14 DNA 析出量析出量 0.14 0.14 0.14 DNA 析出量析出量 DNA 析出量析出量 DNA 析出量析出量 AB D NaCl濃度濃度 NaCl濃度濃度 NaCl濃度濃度 NaCl濃度濃度 1、下列圖示中能反映、下列圖示中能反映DNA析出量與析出量與NaCl溶液濃度溶液濃度 (mol/L)之間的關(guān)系的是之間的關(guān)系的是 （ ） B 溶解度與析出量的

18、關(guān)系是溶解度與析出量的關(guān)系是相反相反 2 2、在、在“DNADNA粗提取與鑒定粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的 DNADNA絲狀物分別放入體積為絲狀物分別放入體積為2mL2mL的四種溶液中，經(jīng)攪拌后的四種溶液中，經(jīng)攪拌后 過濾，獲得過濾，獲得4 4種濾液，含種濾液，含DNADNA較少的是較少的是 A A濾液濾液E BE B濾液濾液F F C C濾液濾液G DG D濾液濾液H H 1 蒸餾水中蒸餾水中攪拌后過濾攪拌后過濾濾液濾液E 2 2molL的的NaCl溶液溶液攪拌后過濾攪拌后過濾濾液濾液F 3 O.14molL的的NaCl溶液中溶液中攪拌后過濾攪拌后過濾濾液濾

19、液G 4 冷卻的冷卻的95的酒精溶液中的酒精溶液中攪拌后過濾攪拌后過濾濾液濾液H CD 3 3、欲使溶有、欲使溶有DNADNA的的2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出，最有析出，最有 效的辦法是效的辦法是 A A 加蒸餾水加蒸餾水 B B 加礦泉水加礦泉水 C C 加清水加清水 D D 加生理鹽水加生理鹽水 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) （三）（三）DNADNA的鑒定的鑒定 u在沸水浴的條件下，在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。 u材料：材料：菜花、菜花、洋蔥洋蔥等。等。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) u選擇選擇原則原則： 含有

20、含有DNADNA且且DNADNA含量相對較高含量相對較高的生物材料的生物材料。 （一）實(shí)驗(yàn)材料的選擇（一）實(shí)驗(yàn)材料的選擇 1 1、 雞是真核生物，真核生物的雞是真核生物，真核生物的DNADNA主要在染色體上。主要在染色體上。 2 2、鳥類的血細(xì)胞核大，、鳥類的血細(xì)胞核大，DNADNA多。多。 3 3、不需要破除細(xì)胞壁。、不需要破除細(xì)胞壁。 選擇雞血的原因：選擇雞血的原因： 問題問題1 1：有什么比較簡便但是可行的方法可以有什么比較簡便但是可行的方法可以 破碎破碎（如雞血細(xì)胞）的（如雞血細(xì)胞）的細(xì)胞膜細(xì)胞膜 （二）破碎細(xì)胞，獲取含（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液的濾液 討論：為什么加討論：為什么加 入蒸餾水能使雞入蒸餾水能使雞 血細(xì)胞破裂？血細(xì)胞破裂？ 自變量