復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學(xué)研究2300字

1、復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學(xué)研究2300 字【摘要】目的：建立復(fù)方五仁醇膠囊血清藥理學(xué)研究方法。 方法：建立CC14誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷模型，大鼠為含 藥血清供體，以含藥血清對損傷肝細(xì)胞增殖(MTT法)及丙氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶(ALT)泄漏的影響兩個指標(biāo)，結(jié)合含藥血清中五味子乙素的 含量測定，分別采用單因素考察、多因素的正交試驗(yàn)，優(yōu)選含藥 血清的制備方法，并確定體系中血清添加量。結(jié)果：每天以成人 等效劑量10倍的甲醇提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給 藥，連續(xù)3天，末次給藥后2h采血制備含藥血清比較合理，體系 中加入10%該條件下制備的含藥血清能明顯提高損傷肝細(xì)胞的增殖 能力、降低

2、細(xì)胞ALT泄漏。結(jié)論：適宜條件下制備的復(fù)方五仁醇 膠囊含藥血清對肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，血清藥理學(xué)研 究方法可以用于該制劑的藥效評價?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)方五仁醇膠囊； 保肝作用；含藥血清；血清藥理學(xué)中藥“血清藥理學(xué)”是指在動物 經(jīng)口服給藥一段時間后采血分離血清，用此含藥血清進(jìn)行體外藥 理實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法，該方法作為中藥研究的新思路和新方法 而倍受推崇。復(fù)方五仁醇膠囊是我院研制的以五味子為君藥的治 療慢性肝炎的科研制劑，我們對該制劑進(jìn)行了 “血清藥理學(xué)”研 究的方法學(xué)探討。1材料與方法1.1材料1.1. 1動物SD大鼠，SPF 級，體重23019. 8g,雌雄不拘，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提 供

3、。1. 1.2試劑與試藥輕乙基哌嗪乙磺酸（香港FARCO公司）；乙二 醇雙（2-氨基乙瞇）四乙酸（美國AMRESCO公司分裝）；膠原酶IV （美 國Sigma公司分裝）；胰蛋白酶（美國Sigma公司分裝）；DMEM培養(yǎng)基 （美國GIBCO公司）；新西蘭新生小牛血清（美國IlyClone公司）；四 氯化碳（宜興市第二化學(xué)試劑廠）；漠化3-（4,5-二甲基囈哇）-2,5- 二苯基四氮哩藍(lán)（MTT, AMRESCO公司）；五味子乙素（中藥固體制劑 制造技術(shù)國家工程研究中心）；復(fù)方五仁醇膠囊（本院自制）o 1.1.3 儀器IIERAcellC02培養(yǎng)箱（德國GmbH公司）；BIO-TEK340酶標(biāo)儀（

4、美 國Sigma公司）；日立7170全自動生化分析儀（日本日立公 司）；AgilentllOOSeries高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。1.2方法1.2. 1大鼠灌胃用藥物的處理取復(fù)方五仁醇膠囊內(nèi)容物， 加0. 5%CMC-Na制成混懸液。另取復(fù)方五仁醇膠囊內(nèi)容物，甲醇回 流提取，加0. 5%CMC-Na制成混懸液。1.2.2肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 按文獻(xiàn)1方法分離大鼠肝細(xì)胞，并以lX105/cm2接種于96孔及 48孔培養(yǎng)板中，置C02培養(yǎng)箱（5%CO2）37C培養(yǎng)。1.2.3含藥血清 制備方法考察I給藥形式及劑量考察取SD大鼠20只，隨機(jī)分成5 組（制劑原形組，提取物小劑量、中劑量

5、、大劑量組和空白組）， 每組4只，禁食12h。制劑原組組每天按照成人臨床等效劑量的 10倍分兩次灌胃制劑混懸液，提取物小劑量、中劑量和大劑量組 同法分別灌胃5、10和20的提取物混懸液，連續(xù)給藥3天，末次 給藥后lh頸總動脈取血，41過夜，分離血清，空白組每天 0. 5%CMC-Na灌胃,同法制備空白血清。取培養(yǎng)24小時的肝細(xì)胞, 吸棄上清液，隨機(jī)分成6組（正常對照組，模型對照組，制劑原形 組，提取物小劑量、中劑量、大劑量組），每組設(shè)6個復(fù)孔。除正 常對照組外，每孔加入含CC14的DMEM及相應(yīng)含藥血清（模型對照 組為空白血清），CC14和血清的終濃度分別為10mmol/L和10%, 正常組相

6、應(yīng)加入DMEM培養(yǎng)液和空白血清。作用24h后，收集48 孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALTo 96孔板中每孔加入5mg/ml的MTT液 20 nl,繼續(xù)孵育4h,每孔再加入DMS0200 U1,振蕩后，用酶標(biāo) 儀于波長570nm測吸光值A(chǔ)o 1.2. 4含藥血清制備方法考察II其他 條件的正交試驗(yàn)考察以動物是否造模、給藥間隔時間、取血時 間、取血成分為考察因素，每個因素設(shè)2個水平（見表1）,選用 L8（27）正交表安排試驗(yàn)。取SD大鼠32只，隨機(jī)分成8組，每組4 只，其中肝損傷模型大鼠給藥前24h腹腔注射CC141. 0ml/kg。各 組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃提取物混懸液， 末次頸

7、總動脈取血，血漿組血液立即離心分離血漿，血清組血液 41過夜，分離血清。取培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞，吸棄上清液，隨機(jī)分 成8組，分別用以上制得的含藥血清（血漿）按1.2.3相應(yīng)方法處 理，測定ALT及吸光值A(chǔ)。按文獻(xiàn)方法2制備對照品及含藥血清 （血漿）供試品溶液，注入液相色譜儀，測定五味子乙素含量。1. 2. 5體系中含藥血清添加量考察取培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞，棄上清 液，隨機(jī)分成6組（正常對照組，模型對照組，5%、10%、20%、 40%含藥血清組），每組設(shè)6個復(fù)孔。模型對照組和各含藥血清組 更換為加入CC1410mmol/L的DMEM培養(yǎng)液，正常對照組相應(yīng)加入 DMEM培養(yǎng)基，正常對照組和模型對照組加入