登革熱檢測規(guī)程

1、登革熱（一）登革病毒感染與機體免疫反應(yīng)登革病毒感染后，潛伏期為314天，通常47天，潛伏期內(nèi)采集的患者標本尚不能檢 出登革病毒或相應(yīng)的機體免疫反應(yīng)。發(fā)病后，病毒在血液中存在的時間（病毒血癥期）約為 7 天，病毒NS1抗原在血液存在的時間略長。發(fā)病后 45天內(nèi)，可在病人的血清、血漿、白細胞、 腦脊液和尸檢組織標本中分離到病毒，病毒核酸及NS1抗原在這個時期的檢出率高。病人血液中抗體水平，因個體免疫狀態(tài)不同而具有顯著差異。若以前沒有感染過登革病毒或其他黃病毒， 或接種過黃病毒疫苗（如：乙腦、黃熱等），病人首次感染抗體免疫反應(yīng)呈現(xiàn)為特異性抗體水 平緩慢升高，IgM抗體出現(xiàn)最早，隨后出現(xiàn)的是IgA和I

2、gG抗體。在發(fā)病后35天的患者中 IgM抗體檢出率約為50%發(fā)病后第5天的患者中檢出率約為80%而在發(fā)病后第10天患者中， 約99%勺患者可檢出。IgM抗體水平在發(fā)病后2周達高峰，然后逐步下降，可保持 23個月。 IgA抗體出現(xiàn)略晚于IgM抗體，可保持約45天。在發(fā)病一周后，可在血液標本中檢出較低滴度 的IgG抗體，之后抗體滴度緩慢升高，可持續(xù)存在多月甚至終生。如果病人屬于再次感染登革 病毒（登革病毒感染者以前曾感染過登革病毒，有時可能是曾接種其他黃病毒疫苗或感染過其 他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病毒產(chǎn)生反應(yīng)。主要為高水平的IgG抗體，在急性期即可檢出，可持續(xù)存在10個月以上，甚

3、至終生。IgA抗體也可在急性期標本中檢出。再 次感染登革病毒的病人恢復(fù)期早期的IgM抗體滴度明顯低于首次感染，甚至無法檢出，通過計 算IgM/IgG抗體比例，可以區(qū)分首次或再次登革病毒感染。IgA抗體檢測試劑在臨床診斷中的應(yīng) 用尚處于評價階段。登革病毒 IgM/IgG 抗體檢測規(guī)程【方法】膠體金法【預(yù)期用途】登革熱（ Dengue Fever ）是 一種由登革病毒引起的急性傳染病，主要流行于熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)。登革 病毒為單股正鏈 RNA 病毒，在分類學(xué)上屬于黃病毒科，黃病毒屬（ flavivirus ）。病毒核心為 RNA 與蛋白質(zhì)組 成的 20 面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組

4、成的包膜，包膜含有型和群特異性抗原。病毒基因編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白 C,膜蛋白M,包膜蛋白E）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（ NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5 ）。登革病毒感染可導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生病毒特異性的抗 體。初次感染者，發(fā)病后 3 5 天可在血液中檢出病毒 IgM 抗體，發(fā)病 2 周后達到高峰，可維持 2 3 個月， 發(fā)病 1 周后可檢出病毒 IgG 抗體， IgG 抗體可維持數(shù)年甚至終生。檢測臨床登革熱癥狀的病人樣本中登革病毒 抗體，有助于登革熱的輔助診斷?！緳z驗原理 】 采用膠體金免疫層析技術(shù)，在玻璃纖維上預(yù)包被膠體金標記的登革病毒抗原（Au-De

5、ngue-Ag ）和羊IgG（Au- 羊 IgG） ，在硝酸纖維素膜上 IgG 檢測線， IgM 檢測線和對照線處分別包被鼠抗人 IgG 單克隆抗體，鼠 抗人 IgM 單克隆抗體和鼠抗羊 IgG 單克隆抗體。檢測陽性標本時，樣本中登革熱病毒 IgG 抗體（或 IgM 抗體） 與 Au-Dengue-Ag 結(jié)合形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿紙條向前移動，經(jīng)過IgG 檢測線（或 IgM 檢測線）時與預(yù)包被的鼠抗人 IgG 單抗（或鼠抗人 IgM 單抗）形成“ Au-Dengue-Ag Dengue 病毒抗體鼠抗 人 IgG 單抗（或鼠抗人 IgM 單抗）固相材料”夾心物而富集顯色，膠體金標記羊

6、IgG 則在對照線與鼠抗羊 IgG 單克隆抗體結(jié)合富集顯色，陰性標本則僅在對照線處顯色。【試劑組成成分 】1 ，登革病毒 IgM/IgG 抗體試劑檢測線：鼠抗人 IgM 抗體、鼠抗人 IgG 抗體 對照線：鼠抗羊 IgG 抗體結(jié)合墊：膠體金標記登革病毒抗原和膠體金標記羊 IgG2 ，梓品稀釋液3 ， 2uL 吸管【樣本要求 】1 ， 檢測樣本為血清或血漿，避免溶血。2，血漿可用肝素、檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝。3 ， 采集后的標本及時檢測，2 8C 密封保存 7 天，長期保存需冷凍 -20C ，忌反復(fù)凍融?！?檢驗方法 】 檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復(fù)至室溫1 ， 處理好樣本，取出試劑檢

7、測卡，水平放置并作好標記。2 ,用移液器吸取樣本 2uL，或以試劑配置吸管吸取樣本至 2uL刻線，滴加在檢測卡樣本孔（S1孔）。3 ， 在檢測卡稀釋液孔（ S 孔）滴加 2 滴（ 70-100uL ）樣品稀釋液。4 ，20 分鐘同觀察記錄結(jié)果?！窘Y(jié)果報告 】陽性：質(zhì)控線（C）和檢測線（G）、檢測線（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒 IgM/IgG抗體。 質(zhì)控線（C）和檢測線（G）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒 IgG抗體。質(zhì)控線（C）和檢測線（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgM抗體。陰性：僅在質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測區(qū)（ M ）、檢測區(qū)（G）未

8、出現(xiàn)紫紅色條 帶，表示樣品中沒有登革病 毒抗體或抗體濃度低于試劑的檢出水平。無效：質(zhì)控線（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表示操作不當或者試劑失效，應(yīng)重新檢測?！緢蟾娣绞?】檢測線（G）、檢測線（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶登革熱病毒 IgM/IgG 抗體測定：IgM 陽性（ +） IgG 陽性（ +）【注意事項 】1 ， 檢測按照傳染病實驗管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定操作，實驗后按傳染性廢物處理。2 ， 操作應(yīng)嚴格按說明書進行。3 ， 保持良好的實驗室環(huán)境。4， 嚴格控制在 20 分鐘內(nèi)觀察結(jié)果， 20 分鐘后觀察結(jié)果無效 ?！緜魅拘?廢物處理】1 ， 所有實驗室工作人員應(yīng)熟知并遵守本制度；由專職清潔人員負

9、責(zé)實驗廢棄物處理。 實驗室放置裝有垃圾袋的有蓋污物桶，并貼有明顯標識。2 ， 每天實驗結(jié)束后，及時清理并妥善包裹廢棄物，送出實驗室并作好實驗室廢棄物處理記錄。3 ， 不具有傳染性的實驗室廢棄物（如產(chǎn)品包裝材料和廢紙等辦公垃圾），應(yīng)與傳染性廢棄物區(qū)分開來，作為普通廢棄物單獨送醫(yī)療廢物集中處理中心統(tǒng)一處理。4 ， 血袋、裝血液的試管、離心管、吸頭等由科室洗滌人員用有效氯濃度0.3 的愛爾施消毒液充分浸泡（60120分鐘），進行初步消毒處理。5 ， 進行初步消毒處理的血袋、試管和與受血液污染的棉球、紙片、一次性口罩、帽子等傳染性或可疑傳染性廢棄物一起放入黃色膠袋中，由廢物集中處理中心無害化處理中心封

10、 閉運輸至焚燒中心進行無害化焚燒處理。6， 每天實驗前，在清洗盆中加入半盆有效氯濃度 0.3 %的愛爾施消毒液，實驗中將玻片、離心管、吸管、吸頭等回收物品充分浸泡（ 60120 分鐘），進行初步消毒處理。7 ， 收集一天的污染物品用流動水沖洗，然后進行高壓滅菌處理。登革熱 NS1 抗原檢測規(guī)程【方法】膠體金法【預(yù)期用途】本試劑采用免疫層析技術(shù)，定性檢測人血清、血漿或者全血中的登革熱 NS1 抗原。適用于登革病毒感染的早 期輔助診斷和篩查。登革熱是由登革病毒（分 4 個血清型， DENV 1 4）引起的，通過伊蚊傳播的急性傳染病，多見于熱帶和亞 熱帶地區(qū)。臨床類型可分為登革熱、登革熱出血熱和登革

11、休克綜合征三種，該病傳播迅速，主要臨床表現(xiàn)包 括發(fā)熱、頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)疼痛、極度乏力、皮疹、淋巴結(jié)腫大、白細胞減少。初次感染登革熱病毒患者， 一般臨床表現(xiàn)較輕，可表現(xiàn)為無癥狀隱性感染，或輕型、典型登革熱；再次感染異型登革病毒時，病情較為 嚴重，臨床上出現(xiàn)登革出血熱和休克綜合征的概率增加，病死率高，是一種具有嚴重危害性的傳染病?！緳z驗原理 】 本試劑方法采用免疫層析法，應(yīng)用雙抗體夾心法定性檢測登革熱NS1 抗原。登革熱NS1抗原測試條的硝酸纖維素膜檢測區(qū)（ T）上包被有抗登革熱病毒 NS1蛋白單克隆抗體，質(zhì)控區(qū)（C） 上包被有抗鼠 IgG 多克隆抗體，當樣本中含有登革病毒 NS1 抗原且濃度高

12、于最低檢出限時，標記有膠體金的 抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體下血清、血漿或全血中的登革病毒 NS1 抗原結(jié)合形成反應(yīng)復(fù)合物，在層析作 用下復(fù)合物沒著硝酸纖維素膜向前移動，與硝酸纖維素膜上檢測區(qū)（T）預(yù)先包被的抗登革熱 NS1抗原單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并最終形成一條肉眼可見的紅色反應(yīng)線，此時的結(jié)果為陽性。相反，當樣本中不含有 登革病毒NS1抗原且濃度低于最低檢出限時，則檢測區(qū)（ T）無紅色反應(yīng)線出現(xiàn)，此時結(jié)果為陰性。無論樣本 中是否有NSI抗原，在質(zhì)控區(qū)（C）都會形成一條紅色反應(yīng)線?！局饕M成成份 】 試劑盒由測試卡和吸管組成。測試條由硝酸纖維素膜、樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、 PVC 板

13、等其他支持物組。硝酸纖維素膜包被有抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體和抗鼠 IgG 多克隆抗體，結(jié)合墊含 有膠 體金標記的抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體?！緲颖疽?】1 ， 血清、血槳、全血樣本均可用于測試。2 ， 全血樣本采集后盡可能立即使用，如不能立即檢測可蔣樣本放置于 2-8C 冷藏，全血樣本需在 3 天內(nèi)完成檢測。3， 血清 /血槳如不能及時測試應(yīng)放置于 2-8C 冷藏，可保存兩周，如需長期保存應(yīng)置 -20C 冷凍保存，測 試前注意恢復(fù)至室溫。4， 注意高濃度的黃疸樣本、高度溶血樣本、或肉眼可見多絮狀沉積的乳糜血樣本，將對檢測結(jié)果的干擾， 因此在使用樣本前注意樣本的外觀?！?檢驗

14、方法 】檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復(fù)至室溫1 ，取出測試卡平放于臺上，并做好標記2 ，有吸管吸取樣本血清 / 血槳/ 全血樣本，垂直加入 2-3 滴（約 60-80uL ）于加樣孔中，3， 15-20 分鐘觀察顯示結(jié)果， 30 分鐘后顯示結(jié)果無臨床意義?！窘Y(jié)果報告 】NS1抗原陽性：兩條紅色線，即在檢測區(qū)（ T）及質(zhì)控區(qū)（C）各出現(xiàn)一條紅色線。NS1抗原陽性：一條紅色線，即在質(zhì)控區(qū)（ C）出現(xiàn)一條紅色。無效：即在質(zhì)控區(qū)（C）無紅色反應(yīng)線出現(xiàn)。此時建義重測?！緳z驗方法局限性 】1 ， 當測試樣本中登革病毒 NS1 抗原低于最低檢出限或在感染的某個階段不存在將會出現(xiàn)陰性結(jié)果，陰性結(jié)果不能排除

15、近期感染的可能性。2 ， 測試時必須嚴格按說明操作，否則可能分產(chǎn)生錯誤結(jié)果，樣本若存在個別特藥或操作技術(shù)上的原因會造成結(jié)果出錯，若結(jié)果可凝，請重新測試。3 ， 本試劑僅對樣本的登革病毒 NS1 提供定性檢測，需要檢測某一指標的具體含量請借助相關(guān)儀器。4 ， 本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參孝，不應(yīng)作為臨床診治唯一依據(jù)，對患者的臨床管理應(yīng)結(jié)合其癥狀 / 體征，病史，其他實驗檢查，治療反應(yīng)及流行病學(xué)等信息綜合考慮。僅供個人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung,