全血RNA快速提取試劑盒

1、全血RNA快速提取試劑盒目錄號(hào)：R016v 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存20次(R016-20)50次(R016-50)10X紅細(xì)胞裂解液RLB室溫10 ml25 ml裂解液RLT室溫20 ml50 ml去蛋白液RW1室溫15 ml40 ml漂洗液RW室溫5 ml 10 ml第一次使用前按說明加指定量乙醇RNase-free H2O室溫10 ml10 ml70%乙醇室溫4ml RNase-free H2O 9ml RNase-free H2O第一次使用前按說明加指定量乙醇RNase-free吸附柱RA和收集管室溫20套50套本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。儲(chǔ)存事項(xiàng)：1.

2、所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。2. 不合適的儲(chǔ)存于低溫（4或者20）會(huì)造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下（1525）進(jìn)行。3. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。v 產(chǎn)品介紹：紅細(xì)胞裂解液選擇性裂解紅細(xì)胞,然后獨(dú)特的裂解液/-巰基乙醇迅速裂解白細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的RNa

3、se free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。v 產(chǎn)品特點(diǎn)：1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。3. 反復(fù)優(yōu)化的紅細(xì)胞裂解液配方,裂解效果快速完全。4. 快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在40分鐘內(nèi)完成。5. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.92.0，基本無DNA殘留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實(shí)驗(yàn)。v 注意事項(xiàng)1. 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙

4、醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!2. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13，000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。3. 需要自備乙醇, -巰基乙醇,一次性注射器,研缽。4. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。5. 預(yù)防RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：2. 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase 污染。3. 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。4. RNA 在裂解液RLT 中時(shí)不

5、會(huì)被RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4 小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。5. 配制溶液應(yīng)使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37放置過夜，高壓滅菌。）6. 關(guān)于DNA 的微量殘留：一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的RNA提取產(chǎn)品，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大多數(shù)RT-PCR 擴(kuò)增過程中極其微量的DNA殘留（一般電泳EB

6、染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大, 如果要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析如熒光定量PCR,我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：2. 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。3. 選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。4. 將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup),請(qǐng)聯(lián)系我們索取具體操作說明書。5. 在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進(jìn)行DNase I處理。請(qǐng)聯(lián)系我們索取具體操作說明書。7. RNA 純度及濃度檢測(cè)：完整性： RNA

7、可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5TBE電泳緩沖液；150v，15 分鐘)檢測(cè)完整性。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA 條帶。動(dòng)物rRNA 大小分別約為5 kb 和2kb，分別相當(dāng)于28S 和18S rRNA。動(dòng)物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應(yīng)為次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴(yán)重降解。純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間。O

8、D260/OD280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的pH 值影響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測(cè)出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260, OD280 測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的計(jì)算：終濃度（ng/l）= (OD260)(稀釋倍數(shù)n)40v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）提示： 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量

9、無水乙醇! 使用前將10X紅細(xì)胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。 操作前在裂解液RLT中加入-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10l -巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4可放置一個(gè)月。1. 在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 (顛倒混勻后)和3體積的紅細(xì)胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確?；靹颉?. 室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞）。如果RNA降解嚴(yán)重,可在冰上裂解,但是時(shí)間可長(zhǎng)一些以充分裂解。3. 12,000 rpm離心20秒，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清

10、（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)。 離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟2，3。上清盡可能的吸棄,殘留過多會(huì)稀釋裂解液,造成裂解結(jié)合異常,產(chǎn)量純度降低。4. 渦旋或者輕彈管壁將白細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加入350l（0.5 ml全血）或者600l（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。病人血樣中白細(xì)胞數(shù)量可能大幅增加,應(yīng)該適當(dāng)減少處理量?；蛘甙凑?50l（0.5 ml或者2x106白細(xì)胞,加30-50l RNase free water重復(fù)步驟11,合并兩