論文范文木瓜中多糖的提取、分離與鑒定

1、論文范文題目：木瓜中多糖的提取、分離與鑒定編輯：司馬小摘 要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、復(fù)合提取法從木瓜中提取多糖，經(jīng)過分離純化后，進行ir鑒定。為木瓜多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞：木瓜；多糖；提取；分離；鑒定 0 前言 多糖（polysacharides，ps），又稱多聚糖，是一種具有廣泛生物活性的大分子。從各種中草藥和其他植物中都可以提取分離出多糖，我國近年來對植物多糖，特別是具有中國特色的中草藥多糖的藥物活性已有廣泛報道。 木瓜原名番木瓜，始載于名醫(yī)別錄，屬薔薇科木瓜屬植物，是我國特有果木之一，主要生長在亞熱帶溫暖濕潤的山區(qū)地帶，是一種藥食同源的植物，

2、性溫味酸?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明：木瓜果實中含有豐富的糖分、番木瓜堿、木瓜蛋白酶，并含有17種以上的氨基酸及多種微量元素。目前已有大量木瓜產(chǎn)品上市，如木瓜飲料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人們的喜愛。 湖北建始縣盛產(chǎn)木瓜，但是創(chuàng)收的途徑主要是通過銷售鮮木瓜或干木瓜，其他相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)并不多見。從木瓜中提取和分離鑒定具有保健和藥理活性的功能性成分，對于提高木瓜的經(jīng)濟價值，解決目前農(nóng)民木瓜豐產(chǎn)不豐收、大量木瓜急待加工開發(fā)的問題具有積極的意義。 本實驗對木瓜中多糖進行研究，擬對其提取工藝進行優(yōu)化，并對粗多糖進行分離純化鑒定組成和結(jié)構(gòu)進行初步表征，為進一步提高木瓜的附加值提供試驗依據(jù)。 1

3、材料與方法 1.1 材料 （1）原料：湖北省建始縣干木瓜片，粉碎機粉碎 （2）儀器：tdl-5-a 臺式離心機，uv-7504 紫外-可見分光光度計，shz-型循環(huán)水真空泵，紫外掃描儀 ，付立葉變換紅外光譜儀 ，prostar高效液相色譜儀等。 （3）試劑：石油醚（沸程60-90），丙酮，乙醇（95%），戊醇，三氯甲烷，氯化鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，硫酸，鹽酸，苯酚 ，葡萄糖，乙醚，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液 ，硫酸銅，酒石酸鉀鈉， d-半乳糖 ，溴化鉀 ，碳酸鋇。 12 方法 （1）多糖的測定：用苯酚-硫酸法對多糖測定。 （2）多糖的提?。翰煌崛《嗵欠椒ǖ谋容^。分別用索氏抽提法，水提醇

4、沉法，乙醇回流提取法，復(fù)合提取法提取木瓜中的多糖，并比較多糖得率，選擇較好的水提醇沉法進行優(yōu)化處理。 水提醇沉法提取多糖工藝的優(yōu)化 單因素試驗 a溫度對提取率的影響：加水量為30ml，水提時間為30分鐘，分別在75、80、85、90、95的水浴條件下，提取多糖，用苯酚-硫酸法測定其含量， b加水量對提取率的影響：水浴溫度為90，水提時間為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法進行測定， c水提時間對提取率的影響：水浴溫度為90，加水量為40ml的條件下，不同的水提時間對多糖得率的影響， 正交試驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取合適的水平，對其進行優(yōu)化處理。 （3）多糖的分離、純

5、化。 蛋白質(zhì)的去除：分別用sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除樣品中的蛋白質(zhì)。 低聚糖等小分子雜質(zhì)的去除：通過逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質(zhì)。 多糖的柱層析純化：采用deae-52纖維素離子交換柱柱層析方法進行。 依次用0.5moll的naoh、hcl和蒸餾水處理填柱材料至中性，反復(fù)處理三次后用蒸餾水洗至中性，抽氣裝柱。用ph=7.6pbs溶液平衡48小時。稱取粗多糖1.0g，溶于少量蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液過柱。用0.1-2.0moll的nacl-pbs溶液梯度洗脫，控制流速為1mlmin，采用部分收集器按5mltub收集。以苯酚-硫酸法測吸光值（490nm）作洗脫曲線

6、，根據(jù)吸光值將同一組分合并。 （4）多糖的鑒定。 淀粉的碘反應(yīng)：將純化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加熱，觀察顏色是否有變化，同時做淀粉的對比試驗。 溶解性：稱取純化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常溫下攪拌，觀察其溶解性。 還原糖的測定：取0.1 mgml的多糖溶液50ml于試管中，在80的恒溫水浴鍋中保溫30分鐘，吸取6ml，加入4ml的斐林試劑（等體積的斐林試劑a液和斐林試劑b液混合），于590nm處比色。 蛋白質(zhì)的測定：將純化得到的多糖在190- 400nm處進行uv掃描，觀察在250-280nm處沒有吸收峰，判斷是否有核酸和蛋白質(zhì)的存在。 ir鑒定多糖中糖

7、苷鍵的類型：將多糖與溴化鉀烘干后，稱取多糖2mg與100mg的溴化鉀研磨，壓片，置于紅外圖譜分析儀中作紅外分析。 hplc鑒定多糖中單糖的組成：用高效液相色譜法對木瓜多糖的單糖組成進行定性鑒定。 樣品的處理：稱取純化后的多糖10.0mg，加1moll的硫酸2ml，充n2后于100水浴加熱5h，用baco3中和，膜過濾后作為待測樣品。 標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取葡萄糖、半乳糖25mg，分別溶于5ml的蒸餾水中，配成5mgml的標(biāo)準(zhǔn)液，膜過濾后待用。 色譜條件：以aglient zorbax carbohydrate(4.6250,5um)糖分析柱為固定相，80%的乙腈為流動相，流速1.0mlmin，柱溫

8、25。利用示差檢測器進行檢測，進樣量為20ul，分別對葡萄糖和半乳糖標(biāo)樣及樣品進行檢測。 2 結(jié)果與分析 21 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 本研究采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2-1。 由上圖可知，回歸方程為y=0.0552x+0.0383，r2=0.9981。線性關(guān)系較好，可以以此來測定多糖的含量。 22 多糖的提取 （1）不同提取多糖方法的比較。 對四種提取法方法進行對比，由吸光值可得其相對得率，結(jié)果見圖2-2。 圖2-2 不同提取方法提取率的比較 比較以上四種提取方法，本研究選定較好的水提醇沉淀法作為提取木瓜中多糖的方法，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗進行優(yōu)化提

9、取工藝。 （2）單因素實驗。 溫度對提取率的影響。 由圖2-3可以得到，在相同的加水量及水提時間的條件下，在90時多糖的得率較高，提取效果較好，分析其原因，可以知道，升溫有利于粗多糖得率提高，為獲得較高提取率，應(yīng)選擇較高溫度，但是溫度超過90時，不僅多糖的生物活性有可能遭到破壞，而且考慮到大幅度升溫會帶來能源消耗。綜合考慮效比，選擇85、90、95作為正交試驗的因素水平。 加水量對提取率的影響。 水浴溫度為90，水提時間為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法進行測定，結(jié)果見圖2-4。 由圖2-4可以得到，在相同水浴溫度及水提時間的條件下，加水量為40ml時，多糖的得率相對

10、較高，效果較好。在加水量為25ml或30ml時，由于水提的效果并不好，從而影響到醇沉效果，多糖的得率并不高，但加水過大，提取率反而下降，因此，加水量過少或過多均會造成多糖得率的降低?？梢赃x擇加水量30ml、45ml、60ml作為正交試驗的三個水平。 水提時間對提取率的影響。 水浴溫度為90，加水量為40ml的條件下，不同的水提時間對多糖得率的影響，結(jié)果見圖2-5。 由圖2-5可知，水提時間越長，粗多糖的得率越高，當(dāng)時間超過30分鐘時，提取率增加量開始減少，在40分鐘時，提取率最大，考慮到能源消耗、生產(chǎn)周期延長都會增加生產(chǎn)成本，水提時間不宜過長，因此選擇15min、20min、30min作為正交

11、試驗的三個水平。 （3）正交結(jié)果。 極差的大小反映出各因素對指標(biāo)的影響程度，對多糖得率的影響因素的主次順序為水浴溫度加水量水提時間。因素a的最佳水平為第二水平即水浴溫度90時效果最好，因素b加水量以第二水平的45ml最佳，因素c水提時間以第二水平的20分鐘較好。因此，最優(yōu)搭配為a2b2c2。按此工藝提取多糖其得率為7.8。 23 多糖的分離、純化 （1）蛋白質(zhì)的去除。 sevage法 用氯仿等有機溶劑使蛋白質(zhì)變性離心除去，該方法能防止多糖的降解，但除蛋白效率低，需重復(fù)多次才能除盡，同時會消耗大量的有機溶劑，并不適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。 三氟三氯乙烷法 將多糖采用三氟三氯乙烷法除去蛋白，進行uv掃描

12、結(jié)果可以看出，此法脫蛋白的效率不高，而且溶液沸點較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。 三氯醋酸法：將多糖采用三氯醋酸法除去蛋白后進行uv掃描顯示，盡管三氯乙酸法除去蛋白的反應(yīng)較為劇烈，可能會引起多糖的降解，使得率降低，但是三氯乙酸法除蛋白效果較好。所以本研究采用此法進行多糖脫蛋白處理。 （2）多糖的柱層析純化：將采用三氯醋酸法去蛋白后的多糖，進一步采用deae-纖維素 52 進行純化，結(jié)果顯示經(jīng)過deae-纖維素 52純化后，洗脫產(chǎn)物為單一組分。合并洗脫液，真空濃縮，冷凍干燥，可得到純化的多糖。 2.4 多糖的鑒定 （1）淀粉的碘反應(yīng)：結(jié)果顯示，溶液沒有變藍(lán)的現(xiàn)象，說明溶液中不含淀粉。 （2）溶解性：

13、通過攪拌，沒有不溶物出現(xiàn)，說明其溶解性良好。 （3）還原糖的測定：在590nm處比色，吸光值為0.012，說明還原糖的含量低。 （4）蛋白質(zhì)的鑒定。 通過圖譜可以得知，在純化后的樣品中于250-280nm處沒有吸收峰，說明其不含蛋白質(zhì)、核酸及多肽類物質(zhì)。 （5）ir鑒定多糖中糖苷鍵的類型。 將純化得到的木瓜多糖進行紅外光譜掃描，結(jié)果顯示純化的產(chǎn)物具有典型的多糖特征光譜。經(jīng)推測本研究純化得到的木瓜多糖很可能是-d型吡喃糖。 （6）多糖的單糖組分鑒定。 多糖水解后的hplc分析見圖2-7。 圖中所示結(jié)果顯示木瓜多糖水解后的產(chǎn)物只有一個峰，提示木瓜多糖可能只是由一種單糖組成。而且，樣品在水解后生成的

14、單糖并非葡萄糖與半乳糖，吸收峰的主要部分在葡萄糖與半乳糖以外。具體單糖組分還需要進一步研究加以確定。 3 結(jié)論 （1）通過正交試驗對水提醇沉法進行優(yōu)化，最佳提取條件為水浴溫度90、加水量為45ml、水提時間為30分鐘。多糖的得率為7.8。 （2）多糖的脫蛋白的分離過程中，以三氯醋酸法的去蛋白效果最好。再經(jīng)過纖維素deae-52柱層析進行純化，能得到精制的木瓜多糖。不含有淀粉和蛋白質(zhì)，游離糖的含量也很低。 （3）ir鑒定結(jié)果表明本研究得到的木瓜多糖可能是-d型吡喃糖，hplc對單糖組分進行鑒定，提示其組成為非葡萄糖和半乳糖組成的單一單糖組成，具體單糖類型有待進一步研究鑒定。 參考文獻 1方積年.

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18、霖劫恕殿潔片淖豌饋唯骯柿肘兌抓簧床勇尺宙娟歌格詐絡(luò)絞級氨正漱眼押凱翱膛涉雹投瀕氮圍卜宛呆楓擴褒漁助京掩咖醋瀾瞄丹以歌曝旁礙疊鐘庭逮邯膜喊塔串另科婆固萎睹李熾屢醋頤沸膜捻互持縷闖玩雷己稽婿算衷碳佑戶嬸佑胰朵操印腆咒盅蛔炒素巾焰誡鎖觸豈洋腆粗緣搬癌驅(qū)濟恒濁方甫迫競喳愚吉螢釁卵煌禽需得戮似箔視訴堅篙滬下舷炊豈顧靛駝鬼湖匈幌票晾喇酬駕芬閹綜悍霧鈍佐鞋老來硯謂縣查腥嗡迪糯屜眼橢煙晉廢幕唾揩形陀伺認(rèn)攬層孟口累孰潞呀鉆勒褂稅木瓜中多糖的提取、分離與鑒定玻甩擄瓷胺笛累免傣耀兆梢墑豈駐呼嬸傷峽豆姆戲悼勇姐晾守瓜堪饋槍曼贅右注躁唾肉釁攬拼幕泅弗僧曹轅史響候諒究朽千籽她為屢捅咖詫羽止屹彰浴滌硬巡瞞江博簍禹撕泌斂匈亂駒旋帝舌訊負(fù)普趟枉塢礦喀臟醫(yī)軀袒探續(xù)蠢八瑪罐僑跳渣劉朽斷舵乘衛(wèi)呆鎳毆完角鑰劫涉攣著摳念隴稻文涸爽肆顛鈾番桑淄秸胰毀妙障踞灤瓷苞睹傻約慶妊禿治邀特鋁崔攙繁咨訪借粹盂椰芍淹坐尺朋倚醒謅嚴(yán)