中藥制劑分析第四章衛(wèi)生學(xué)檢查

1、 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 微生物限度檢查法 第三節(jié) 活螨檢查法 第四節(jié) 熱原檢查法 第五節(jié) 無菌檢查法 第六節(jié) 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 一、細(xì)菌 二、真菌 （一）細(xì)菌細(xì)菌 1. 細(xì)菌的大小與基本形態(tài)細(xì)菌的大小與基本形態(tài) 細(xì)菌個體微小，通常以微米(m)為計量單位。需 用顯微鏡放大幾百倍或上千倍才能看到。各種細(xì)菌大小不一，同種細(xì)菌也因 菌齡和環(huán)境不同而有差異。細(xì)菌的種類不同，形態(tài)也多種多樣，其基本形態(tài) 有三類：即球菌、桿菌和螺形菌。 2. 細(xì)菌的結(jié)構(gòu)細(xì)菌的結(jié)構(gòu) 各種細(xì)菌共有的結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)等。 細(xì)胞壁是細(xì)菌的最外層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜緊密相連。其主要功能是維持細(xì)菌的 形態(tài)，保護細(xì)菌，與細(xì)胞

2、膜共同完成菌體內(nèi)外的物質(zhì)交換。革蘭氏陽性菌細(xì) 胞壁較厚，其主要成分為肽聚糖、磷壁酸和少量表面蛋白質(zhì)；革蘭氏陰性菌 細(xì)胞壁較薄，肽聚糖含量少，肽聚糖外層還有由脂蛋白和脂多糖組成的多層 結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，是半滲透性生物膜，主要成分是蛋白質(zhì)、磷 脂和少量的糖。膜上有許多特異性的酶，可高度選擇性地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，排 泄廢物，維持滲透壓平衡。細(xì)胞質(zhì)為無色透明的膠狀物質(zhì)，基本成分為水、 無機鹽、核酸、蛋白質(zhì)和脂類等。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常含有核蛋白體、質(zhì)粒和胞漿顆 粒等多種內(nèi)含物。細(xì)菌的細(xì)胞核沒有核膜和核仁，但在細(xì)胞漿中有固定的核 區(qū)，稱核質(zhì)。核質(zhì)是由裸露的雙股脫氧核糖核酸鏈組成的，主要功能是控制 細(xì)菌的遺傳

3、和變異性狀。某些細(xì)菌具有莢膜、芽胞、鞭毛和菌毛。其中芽胞 對熱、干燥、化學(xué)藥品與輻射均有較強的抵抗力。因此，在消毒滅菌時應(yīng)以 殺死芽胞作為徹底滅菌的指標(biāo)。 3. 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 觀察細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，通常有不染色法和染色法兩種。前者適用于 觀察細(xì)菌的動力、形態(tài)和大小，常用的方法有壓滴法、懸滴法、暗視 野熒光法等；后者適用于觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列和染色特性， 尚可鑒別細(xì)菌的結(jié)構(gòu)。由于細(xì)菌的等電點較低，約在pH25之間， 故在中性、堿性和弱酸性溶液中，帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的堿性染 料結(jié)合而著色。染色標(biāo)本制作的基本步驟如下： (1)涂片：涂片：于潔凈載玻片上加一滴生理鹽水，再

4、用取菌環(huán)挑取菌落少許， 均勻涂布于載玻片上。 (2)干燥：干燥：在空氣中自然干燥。必要時，可將標(biāo)本面向上，在火焰上烘 干，但應(yīng)注意，切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本烤焦。 (3)固定：固定：固定的目的是殺死細(xì)菌，使細(xì)菌粘附在玻片上，增強染料對 細(xì)菌的通透性，便于染料著色。方法是將已干燥的玻片來回通過火焰 三次，以熱而不燙為宜。 (4)染色：染色：根據(jù)檢驗?zāi)康牡牟煌?，選用不同的染色方法進行染色。 單染法：只用一種染料染色，如常用的美藍染色。單染法只能將各種細(xì)菌染成一種顏色，可觀察 細(xì)菌的大小與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性，對鑒別細(xì)菌意義不大。 復(fù)染法：用兩種以上的染料先后進行染色，可將不同的細(xì)菌染成

5、不同的顏色，既能觀察細(xì)菌的大 小、形態(tài)與排列，又能鑒別不同細(xì)菌的染色特性，對鑒別細(xì)菌的種類有重要意義。常用的革蘭氏染 色步驟如下：將結(jié)晶紫染液滴加在已固定的細(xì)菌涂片上，染1min后水洗；滴加盧戈氏碘液， 1min后水洗；滴加乙醇，搖動玻片至無明顯紫色脫落為止，水洗；滴加復(fù)染液(如沙黃染液)復(fù) 染30s1min，水洗，自然干燥或用濾紙吸干后鏡檢。 革蘭氏陽性(G+)菌染成紫色；革蘭氏陰性(G-)菌染成紅色。 4. 細(xì)菌生長繁殖的條件細(xì)菌生長繁殖的條件 細(xì)菌和其他生物一樣，必須不斷地從外界環(huán)境吸收營養(yǎng)物質(zhì)，用以合成自 身的細(xì)胞成分和獲得能量，同時排泄廢物，進行新陳代謝，以維持自身的生長和繁殖。細(xì)菌

6、生長繁 殖的條件有：充足的營養(yǎng)：細(xì)菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)有水、無機鹽、碳源、氮源和生長因子。 生長因子是許多細(xì)菌生長過程中必需、但不能自身合成的因子，如某些特殊氨基酸、維生素、嘌呤 和嘧啶等。適宜的酸堿度：不同種類的細(xì)菌，生長時的最適酸堿度有差異。多數(shù)病原菌的最適 pH7.27.6。但有些細(xì)菌，如霍亂弧菌在pH8.49.2生長良好；乳酸桿菌的最適pH為5.0左右。 適宜的溫度：不同種類的細(xì)菌，對溫度的適應(yīng)性不同，一般在1540條件下均能生長。大多數(shù) 病原菌生長的最適溫度為37。必要的氣體環(huán)境：細(xì)菌生長繁殖所需的氣體主要是氧氣和二氧化 碳。按對氧氣的要求不同，可將細(xì)菌分為三類：只能在有氧條件下

7、生長的細(xì)菌稱為專性需氧菌， 如霍亂弧菌；只能在無氧環(huán)境下才能生長的細(xì)菌稱為專性厭氧菌，如破傷風(fēng)桿菌；在有氧和無 氧條件下均能生長的細(xì)菌稱為兼性厭氧菌，多數(shù)病原菌屬此類型，如葡萄球菌。 5. 細(xì)菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的代謝產(chǎn)物 細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中有些產(chǎn)物可供鑒別細(xì)菌 用，有些與細(xì)菌的致病性有關(guān)，有些可用于防治疾病。 (1)合成代謝產(chǎn)物合成代謝產(chǎn)物 毒素及侵襲性酶：細(xì)菌能產(chǎn)生對機體有害的毒素。內(nèi)毒素由G-菌產(chǎn)生；外毒素大多 由G+菌產(chǎn)生，但少數(shù)G-菌也能產(chǎn)生外毒素。某些細(xì)菌還能產(chǎn)生具有侵襲性的酶，損傷 機體組織，如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶等。 熱原質(zhì)：許多G-桿菌及少數(shù)G+桿菌

8、，能產(chǎn)生一種耐熱物質(zhì)，注入人或動物體內(nèi)可致 發(fā)熱反應(yīng)，故稱熱原質(zhì)。它耐高溫，一般的高壓蒸氣滅菌法不易使之破壞?？捎谜麴s、 吸附、濾過等方法除去液體中大部分熱原質(zhì)。生物制品、靜脈滴注用注射劑應(yīng)不含有 熱原質(zhì)。 色素：許多細(xì)菌在一定條件下能產(chǎn)生各種色素，如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的金黃色脂 溶性色素和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的綠色水溶性色素等，這些特征有助于鑒別細(xì)菌。 抗生素：是指某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的，能選擇性抑制和殺死它種生物細(xì)胞 的代謝產(chǎn)物?？股刂饕煞啪€菌和真菌產(chǎn)生。 細(xì)菌素：某些細(xì)菌能產(chǎn)生一類具有抗菌作用的蛋白質(zhì)，其抗菌范圍狹窄，僅對近緣 細(xì)菌有抗菌作用。主要用于細(xì)菌的分型和流行病學(xué)調(diào)查。 維

9、生素：人體腸道內(nèi)的某些細(xì)菌如大腸桿菌，能合成維生素B和維生素K，可供人體 利用。 (2)分解代謝產(chǎn)物：分解代謝產(chǎn)物：各種細(xì)菌具有不同的酶，對物質(zhì)的分解 利用能力和代謝產(chǎn)物有所不同。利用這些生化特性來鑒別 細(xì)菌，統(tǒng)稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)。 糖代謝產(chǎn)物：糖的分解產(chǎn)物主要是酸類(甲酸、醋酸和 乳酸)、醇類(乙醇、丁醇、乙酰甲基甲醇等)、酮類和氣體 (二氧化碳、氫氣)等。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖， 產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；而傷寒桿菌則不能分解乳糖，分解葡萄糖只 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，據(jù)此可用于細(xì)菌的鑒別。 蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物：不同細(xì)菌對蛋白質(zhì)和氨基酸的分解能 力不同，如大腸桿菌能分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)；沙門氏菌 能分解胱氨酸等

10、含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫氣體，據(jù)此可幫助 鑒別細(xì)菌。 6. 細(xì)菌的生理學(xué)檢驗細(xì)菌的生理學(xué)檢驗 (1)培養(yǎng)基的種類：培養(yǎng)基的種類：培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)菌的生長需要，人工配 制的營養(yǎng)環(huán)境。按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基。 按其用途可分為以下幾類： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有細(xì)菌需要的最基本營養(yǎng)成分，可供大 多數(shù)細(xì)菌生長。如普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基。 營養(yǎng)培養(yǎng)基：營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、血清 和某些生長因子等，可供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長，如血 平板、血清肉湯等。 選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：利用不同種類細(xì)菌對各種化學(xué)物質(zhì)的敏感 性不同，制成有利于選擇欲分離細(xì)菌而抑制其他細(xì)菌生長

11、的培養(yǎng)基。例如加入煌綠、膽鹽等的沙門氏、志賀氏菌屬 瓊脂培養(yǎng)基(SS培養(yǎng)基)，能抑制G+菌和大腸桿菌，有利 于G-腸道致病菌生長。 鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某些特定成分(如糖、醇 類的指示劑等)，用于觀察細(xì)菌的各種生化反應(yīng)。 厭氧培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基：專性厭氧菌須在無氧條件下才生長，因此 需制備與氧隔絕或在細(xì)菌生長時達到無氧環(huán)境的培養(yǎng)基， 如皰肉培養(yǎng)基。 (2)常用培養(yǎng)基的制備程序：常用培養(yǎng)基的制備程序：制備一般培養(yǎng)基的主要程序可 分為配料、溶化、調(diào)整pH值、澄清過濾、分裝、滅菌、 檢定、保存等步驟。 (3)細(xì)菌的接種方法：細(xì)菌的接種方法：接種細(xì)菌采用接種針(環(huán))來沾取細(xì)菌 標(biāo)本，

12、進行接種。接種環(huán)與接種針以白金絲最為理想，也 可用鎳鉻絲代替，二者均能耐高溫且傳熱快，經(jīng)火焰滅菌 后冷卻快。 平板曲線劃線法：平板曲線劃線法：先將標(biāo)本涂于平板表面的一角，然后用接種環(huán)自 此開始，向左右兩側(cè)劃線并逐漸向下移動，連續(xù)劃成若干條分散的平 行線。 斜面接種法：斜面接種法：主要用于鑒定或保存菌種。以左手持培養(yǎng)基，右手持 接種環(huán)(針)，通過火焰滅菌后冷卻挑取菌落；左手立即換取斜面培養(yǎng) 基管，以右手小指和無名指拔取棉塞，夾持于手指間。立即將管口通 過火焰滅菌后將接種環(huán)伸入斜面管內(nèi)，先從斜面底部到頂端拖一條接 種線，再自下而上劃曲線接種。 傾注平板法：傾注平板法：常用于液體標(biāo)本的細(xì)菌計數(shù)。取原

13、標(biāo)本或經(jīng)適當(dāng)稀釋 的標(biāo)本1ml，置于直徑9cm無菌平皿內(nèi)，傾注已熔化并冷卻至50左 右的培養(yǎng)基約1315ml，立即混勻，待凝固后倒置，于37培養(yǎng) 1824h，作菌落計數(shù)。 穿刺接種法：穿刺接種法：多用于觀察細(xì)菌動力及某些生化反應(yīng)。方法與斜面接 種類似。以接種針挑取菌落少許，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至 培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。 液體接種法：液體接種法：以接種環(huán)挑取菌落，在試管內(nèi)壁與液面交界處輕輕研 磨，使細(xì)菌混勻在液體培養(yǎng)基中。 (4)細(xì)菌的培養(yǎng)方法：細(xì)菌的培養(yǎng)方法：細(xì)菌的培養(yǎng)方法有以下三種：一般培養(yǎng)法：又 稱需氧培養(yǎng)法，在3037溫箱中培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。 二氧化碳培養(yǎng)

14、法：將某些在有二氧化碳環(huán)境下才能生長的細(xì)菌(如腦 膜炎球菌)，放在二氧化碳環(huán)境中進行培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)法： 厭氧菌由于對氧敏感，在其分離及鑒定過程中均需在無氧的環(huán)境下培 養(yǎng)，否則就不能生長甚至死亡。 (5)細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：將細(xì)菌接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)37培 養(yǎng)1824h，即可出現(xiàn)肉眼可見的生長現(xiàn)象。在液體培養(yǎng)基中，可出 現(xiàn)均勻混濁、沉淀及形成菌膜等。若將細(xì)菌接種于固體培養(yǎng)基的表面， 經(jīng)培養(yǎng)后，可形成單一的肉眼可見的細(xì)菌集團，稱為菌落。菌落的大 小、形狀、色澤等因細(xì)菌種類的不同而異，有助于細(xì)菌的鑒別(見圖3- 10)。當(dāng)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面密集生長時，多個菌落融

15、合在一起， 稱為菌苔。細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中生長時，無鞭毛的細(xì)菌，沿穿刺線 生長；有鞭毛的細(xì)菌則沿穿刺線向周圍擴散呈云霧狀混濁生長，借此 可判斷細(xì)菌有無動力。 圖3-10 細(xì)菌的菌落形態(tài) 真菌為真核生物，無根、莖、葉的分化，也無葉綠體，以 腐生或寄生方式生長，進行有性或無性繁殖。真菌的結(jié)構(gòu) 比細(xì)菌復(fù)雜，有細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞核具有核 膜、核質(zhì)和核仁。真菌的基本形態(tài)有單細(xì)胞和多細(xì)胞兩種， 單細(xì)胞真菌呈圓形或橢圓形，常見的有酵母菌或類酵母菌； 多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子組成，菌絲分枝交織形成菌絲體， 孢子是真菌的繁殖結(jié)構(gòu)。真菌種類繁多，形態(tài)大小不一。 革蘭氏染色為陽性。 大多數(shù)真菌不需復(fù)雜的營養(yǎng)

16、就能生長，適宜生長溫度為 2228，生長時需要較高的濕度和氧氣。雖繁殖力較 強，但生長速度較慢。一般需數(shù)日至十幾日才能長出菌落。 真菌的菌落有單細(xì)胞真菌的酵母型菌落、酵母樣菌落，多 細(xì)胞真菌的絲狀菌落三種。 1. 酵母型菌落酵母型菌落 類似一般細(xì)菌菌落，菌落光滑、濕潤、柔 軟、致密，顯微鏡檢查可見圓形或橢圓形芽生細(xì)胞，酵母 菌及隱球菌多為此種菌落。 2. 酵母樣菌落酵母樣菌落 外觀性狀同酵母型菌落。但在菌落表面除 有芽生細(xì)胞外，還有假菌絲伸入培養(yǎng)基中，如白色念珠菌。 3. 絲狀菌落絲狀菌落 菌落疏松，呈棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌 落正面和背面可顯示各種不同的顏色，如白色、黃色、紅 色、紫色或灰

17、色等，常作為鑒定菌種的參考。毛霉菌和皮 膚絲狀菌等多細(xì)胞真菌產(chǎn)生此型菌落。 霉菌、酵母菌與細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板上的 菌落形態(tài)區(qū)別，見表36。 一、染菌限度檢驗原則 二、常用稀釋液、試液、指示液及培養(yǎng)基 三、細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 四、控制菌檢查 五、微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 染菌限度檢驗是以規(guī)定的方法與步驟，測定藥品中染菌的程度。必須 遵循下述基本準(zhǔn)則： 1. 供試品抽樣、保存及檢驗量供試品抽樣、保存及檢驗量 供試品一般按批號隨機抽樣。每批取檢驗用量的3倍量。每批抽樣應(yīng) 至少含有2個以上最小包裝單位。抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異常的樣品，應(yīng) 先抽取有疑問的樣品；但機械損傷、明顯破裂的包裝，不能抽作樣品

18、。 肉眼可見長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，無需再抽樣檢查，可直接 判為不合格品。 供試品在檢驗前不得任意開啟，以防再污染。所需樣品必須保存在陰 涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防引起原染菌狀況發(fā)生變化。 各種藥品檢驗取樣量都有明確規(guī)定。所有劑型的檢驗量必須取自2個 以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑應(yīng)取4丸(片)以上樣品；固體和半固體 制劑檢驗量為10g；液體制劑檢驗量為10ml；中藥膜劑檢驗量為30 50cm2。貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可酌減，但口服用藥不得 低于3g，外用藥不得低于5g，液體制劑采用原液直接測定者不得低于 6ml，采用供試液稀釋者，不得低于3ml。 2. 檢驗條件檢驗條件 (1)

19、培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度：除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3037，霉菌、 酵母菌培養(yǎng)溫度為2528，控制菌培養(yǎng)溫度為361。取供 試液檢驗時，應(yīng)注意搖勻，以便均勻取液。檢品制成供試液后應(yīng)在 12h內(nèi)進行檢驗。 (2)陰性對照：陰性對照：在藥品衛(wèi)生檢查之前應(yīng)先做陰性對照試驗，以確定無菌 技術(shù)的可靠性。方法是：取供試液用的稀釋劑，分別按照細(xì)菌數(shù)、霉 菌數(shù)及各控制菌檢驗方法培養(yǎng)，均無菌生長，說明無菌技術(shù)可靠；否 則，說明無菌技術(shù)不過關(guān)，應(yīng)查明原因。 (3)陽性對照：陽性對照：在規(guī)定控制菌檢查中，應(yīng)做陽性對照試驗，目的是檢查 供試品對控制菌生長有無干擾，培養(yǎng)條件是否適宜。方法是：將供試 液分為兩組，一組中加入

20、一定數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)對照菌株，另一組不加對照菌 株，兩組平行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結(jié)果。如果已知陽性菌未檢出，供試品 的陰性結(jié)果應(yīng)認(rèn)為無效，而陽性結(jié)果需做具體分析或?qū)嶒炘僮鹘Y(jié)論。 國家規(guī)定的各種控制菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株是：大 腸桿菌CMCC(B)44102、沙門氏菌 CMCC(B)50094、銅綠假單胞菌 CMCC(B)10104 及金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003。 對照用菌液的制備方法是：取相應(yīng)菌株的 新鮮培養(yǎng)物1取菌環(huán)，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基內(nèi)，培養(yǎng)1820h后，稀釋至1:106。對 照菌的加入量為50100個。 3. 供試液的制備 (1)液體中藥制劑：液體中藥制劑：取供試品10ml，加入90ml稀釋劑

21、中，混勻，作為1:10供試 液。油劑可加入適量聚山梨酯-80；氣霧劑以適量方法使拋射劑導(dǎo)出后，加入 適量稀釋劑，混勻，吸取相當(dāng)10g或10ml供試品，再稀釋成100ml做供試液； 含蜂王漿或蜂蜜的合劑及滴眼劑可以原液為供試液。 (2)固體或半固體中藥制劑：固體或半固體中藥制劑：取供試品10g，置0.9無菌生理鹽水100ml中， 用勻漿儀或其他適宜方法混勻后，作為供試液。在制備過程中，必要時可加 適量聚山梨酯-80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45。 非水溶性中藥制劑：取供試品5g(5ml)，加入含溶化的無菌司盤-80 5g、單 硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-80 10g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成

22、團后， 慢慢加入450.9無菌氯化鈉溶液約80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化， 作為供試液(1:20)。 不溶于水的膜劑：取3050cm2，剪碎，加稀釋劑100ml(必要時可增加稀 釋劑)，浸泡，振搖，即得。 腸溶膠囊(片)：取供試品10g，置含無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)100ml的錐形 瓶內(nèi)，于451水浴中，振搖，溶解，即得。 (3)含抑菌成分的中藥制劑：含抑菌成分的中藥制劑：供試品如干擾控制菌檢驗，按 以下方法處理后，依法檢查。 稀釋法：將供試液接種入較多的培養(yǎng)基中，使該供試液 稀釋至不具抑菌作用的濃度。 離心沉淀集菌法：取規(guī)定量的供試液高速(3000r/min)離 心沉淀30mi

23、n，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀 釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先低速 (500r/min)離心沉淀5min，取全部上清液，再行集菌處理。 薄膜過濾法：取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中， 搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于 0.45m0.02m微孔濾膜的過濾器內(nèi)，減壓抽干后，用 稀釋劑沖洗濾膜三次，每次50100ml，取出濾膜備檢。 中和法：凡含有硫胺、汞、砷類或防腐 劑的中藥制劑，可用相應(yīng)的試劑中和毒性 后制成供試液。 4. 檢驗報告單位 (1)細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)：細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)：個(菌落 數(shù))/g(ml)。 (2)膜劑：膜劑：個/cm2或“

24、未檢出”。 (3)控制菌：控制菌：以1g、1ml或10cm2為單位，報 告“檢出”或“未檢出”。 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)是檢測規(guī)定單位的非滅菌藥品制 劑中污染活菌的數(shù)量，是判定藥品受到微生物污染程度的 重要指標(biāo)，同時，也是對生產(chǎn)單位的藥品原輔料、設(shè)備器 具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作人員衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學(xué) 評價的綜合依據(jù)之一。 細(xì)菌、霉菌與酵母菌計數(shù)均采用平板菌落計數(shù)法。由于檢 驗中細(xì)菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂在3037需氧培養(yǎng)，霉菌與 酵母菌計數(shù)用玫瑰紅鈉瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂在 2528需氧培養(yǎng)，厭氧菌和嗜冷菌在此條件下不生長， 有特殊營養(yǎng)要求的菌也受到限制，因而測定數(shù)只包括一群 能在上述培養(yǎng)基

25、上生長的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌的菌 落總數(shù)。因此，測定時，必須嚴(yán)格按規(guī)定的條件操作，以 免產(chǎn)生實驗誤差。 1. 培養(yǎng)基與試劑培養(yǎng)基與試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基(YPD)、0.9無菌氯化鈉或pH7.2的無菌磷酸鹽緩沖液。 2. 檢驗程序檢驗程序 供試品10g(ml)1:10供試液（平皿23個）1:102供試液（平皿 23個）1:103供試液營養(yǎng)肉湯（平皿23個）（培養(yǎng)1824h） 3035傾注培養(yǎng)48h2h或2528傾注培養(yǎng)72h2h菌 落計數(shù)報告。 3. 操作步驟操作步驟 (1)供試液制備：供試液制備：各類制劑按前述方法制備1:10供試液。 (2

26、)供試液的稀釋與注皿：供試液的稀釋與注皿：用1ml無菌吸管，吸取混勻的供試液1ml， 沿管壁注入裝有9ml無菌稀釋劑的試管內(nèi)，混成1:100的稀釋液。按同 法依次10倍遞增稀釋成1:1000、1:10000的稀釋液備用。每一次稀釋 更換一支1ml吸管。根據(jù)對供試品污染程度的估計，選擇23個適宜 稀釋度，用一支1ml無菌吸管，按高倍稀釋至低倍稀釋的順序分別取 各稀釋度的液體1ml，注入平皿內(nèi)。每個稀釋度應(yīng)作23個平皿。 (3)傾注培養(yǎng)基：傾注培養(yǎng)基：將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基(細(xì) 菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一 般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、蜂王漿液體 制劑另加用YPD瓊脂)熔化，冷卻至45時， 傾

27、注上述各平皿約15ml，旋搖平皿使混合 均勻。置水平臺上待冷凝固。 (4)培養(yǎng)：培養(yǎng)：細(xì)菌計數(shù)平板倒置于3037 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；霉菌、酵母菌計數(shù)平板 于2528培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。 4. 菌落計數(shù)菌落計數(shù) (1)一般將平板置菌落計數(shù)器上或以肉眼仔細(xì)觀察點計。不要漏計瓊脂層內(nèi)和 平板邊緣生長的菌落。注意細(xì)菌菌落和酵母菌菌落以及它們與藥渣、培養(yǎng)基 的沉淀物、氣泡等的區(qū)別。必要時用放大鏡檢查或挑取可疑物涂片鏡檢。 (2)若平板上有2個或2個以上的菌落重迭，肉眼可辨別時仍以2個或2個以上菌 落計數(shù)。有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長及平板已被污染，不宜作為計數(shù) 用。 (3)記錄各稀釋級平板的菌落數(shù)，

28、求取各稀釋級2或3個平板菌落的均數(shù)。當(dāng)菌 落數(shù)在15以上，同稀釋級2個平板菌落數(shù)又相差1倍以上時，該稀釋級不宜采 用；當(dāng)2個平板菌落數(shù)均在15以下(含15)時，每個平板菌落數(shù)的差值允許范圍 為04，17，29，310，412，514，615。超出以上范圍即視 為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。 (4)供試品按營養(yǎng)瓊脂平板點計細(xì)菌菌落數(shù)；固體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂平板 點計霉菌數(shù)，一般液體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂平板點計霉菌及酵母菌總數(shù)； 含蜂蜜及蜂王漿的合劑按玫瑰紅鈉瓊脂平板點計霉菌菌落數(shù)，按YPD瓊脂平 板點計酵母菌菌落數(shù)，二者合并為霉菌及酵母菌數(shù)。 5. 菌數(shù)報告原則菌數(shù)報告原則 細(xì)菌宜選取平均菌落

29、數(shù)在30300之間的稀釋級，霉菌、 酵母菌宜選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級作為菌 數(shù)的依據(jù)。細(xì)菌總數(shù)報告原則如下： (1)若有一個稀釋級的平均菌落數(shù)在30300時，將該稀釋 級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表4-2例1)。 (2)若有兩個稀釋級，其生長菌落數(shù)均在30300，先計算 兩稀釋級菌落數(shù)的比值， 比值 若其比值2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若比值2，則以低稀釋 級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表) 稀釋倍數(shù)低稀釋度的平均菌落數(shù) 落數(shù)稀釋倍數(shù)高稀釋度的平均菌 (3)若有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30300之間時，采 用后2個稀釋級計算級間比值報告(見表4-2例4及例5)。 (4)若所有稀釋

30、度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)該按稀釋 度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表4-2例6)。 (5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300間，以最接 近30或300的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表4- 2例7)。 (6)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30，則應(yīng)按稀釋度 最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。但若用原液為供試 液，當(dāng)1:10稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液時，應(yīng)以培 養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告(見表4-2例8及例9)。 培養(yǎng)基稀釋法：吸取供試液(原液或1:10供試液)1ml，注入 5個平皿內(nèi)(每皿各0.2ml)共作3份，共15個平皿。每皿注 熔化并冷至45左右的瓊脂培

31、養(yǎng)基約 15ml，混勻，冷凝后按規(guī)定培養(yǎng)溫度與時限培養(yǎng)，計數(shù)。 每1ml注入的5個平板的菌落數(shù)之和，即為1ml的菌落數(shù)， 共得3組數(shù)據(jù)，取其平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。 (7)若各稀釋級的平板均無菌落生長或測定數(shù)在10個以下 時，報告菌數(shù)為10個/g(ml)霉菌(酵母菌)總數(shù)報告原則 與細(xì)菌總數(shù)報告原則基本相同。如供試品原液平板均未生 長霉菌及酵母菌，報告每毫升未檢出霉菌及酵母菌。 6. 菌落數(shù)的報告菌落數(shù)的報告 (1)菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)據(jù)報告。 (2)菌落數(shù)大于100時，采用兩位有效數(shù)字報告，第三位按 數(shù)字修約規(guī)則處理。為簡便計算，也可用10的指數(shù)報告。 7. 復(fù)試復(fù)試 供試品細(xì)菌數(shù)

32、、霉菌及酵母菌數(shù)中任何一項一次檢驗不合 格，應(yīng)重新取2 倍包裝量供試品，依法作單項復(fù)試兩份， 以三次檢驗結(jié)果的均值報告。 8. 注意事項注意事項 一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)細(xì)菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂 平板計數(shù)霉菌、酵母菌數(shù)。但如果營養(yǎng)瓊脂平板生長了霉 菌、酵母菌，且多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的霉菌和酵母菌菌 落數(shù)，則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌數(shù)報告；反之， 如果玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細(xì)菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板 的細(xì)菌菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細(xì)菌數(shù)報告。 9. 檢驗結(jié)論檢驗結(jié)論 按下列方式書寫檢驗結(jié)論:本品按中國藥典2000年版微生物限度 檢查法標(biāo)準(zhǔn)檢驗，結(jié)果符合（或不符合）規(guī)定。 （三）大腸桿菌

33、檢查法（三）大腸桿菌檢查法 大腸桿菌為腸桿菌科埃希氏菌屬細(xì)菌，主要寄生于人和動物的腸道內(nèi)， 隨糞便排出體外。藥品中檢出大腸桿菌，證明已被糞便污染，即可能 污染腸道病原體。因此，大腸桿菌被列為糞便污染指示菌，是口服藥 品的控制菌之一。 1. 培養(yǎng)基與試劑培養(yǎng)基與試劑 普通肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、乳糖發(fā)酵管或5%乳糖發(fā) 酵管、蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培 養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱培養(yǎng)基(MacC)、三糖鐵瓊脂 （TSI）、歐-波氏試劑、甲基紅指示劑、V-P試劑、革蘭氏染色液。 2. 檢驗程序檢驗程序 供試品供試液BL增菌液（培養(yǎng)1824h）EMB或

34、MacC平板（培養(yǎng)1824h） 無菌落生長，報告；有疑似菌落TSI（培養(yǎng)1824h）革蘭氏染色鏡檢；或乳糖發(fā) 酵；或IMViC試驗報告。 3. 操作步驟操作步驟 (1)增菌培養(yǎng)：增菌培養(yǎng)：取均勻供試液10ml，加入備妥的100mlBL增菌液內(nèi)，培養(yǎng)1824h。 (2)分離培養(yǎng)：分離培養(yǎng)：將上述增菌液搖勻，再用接種環(huán)沾取12環(huán)在EMB或MacC平板上劃線 接種，培養(yǎng)1824h，觀察菌落生長情況。大腸桿菌在EMB瓊脂平板上的典型菌落呈 紫黑色或中心紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤； 在MacC平板上的典型菌落呈桃紅色或中心桃紅，圓形扁平，光滑濕潤。但從藥品中分 離的菌株

35、，常出現(xiàn)非典型的菌落，在EMB平板上呈淺紫色或粉紅色，無明顯暗紅色中 心，無金屬光澤；在MacC平板上呈微紫色或粉色。因此，以上形態(tài)均應(yīng)作為疑似菌落 進行鑒定，切勿漏檢。 分離平板上無菌落生長或無疑似菌落生長，可做出未檢出報告。 (3)純培養(yǎng)：純培養(yǎng)：用接種針從疑似菌落中心沾出少許，接種于三糖鐵瓊脂斜面上，培養(yǎng)18 24h，供各鑒別試驗用。 (4)革蘭氏染色革蘭氏染色：取上述疑似大腸桿菌的純培養(yǎng)物涂片，作革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌 為G 無芽胞短桿菌。 (5)生化反應(yīng)生化反應(yīng) 乳糖發(fā)酵試驗：取上述斜面培養(yǎng)物接種于乳糖 發(fā)酵管，培養(yǎng)2448h，取出觀察結(jié)果。大腸桿 菌應(yīng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)

36、氣。產(chǎn)酸者， 以酸性復(fù)紅為指示劑的培養(yǎng)基顯紅色；以溴甲酚 紫為指示劑的培養(yǎng)基顯黃色。產(chǎn)氣者，倒管內(nèi)有 氣泡。 為避免遲緩發(fā)酵乳糖造成假陰性，可選用5乳糖 發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌可于24h 出現(xiàn)陽性。 IMViC試驗： 靛基質(zhì)試驗(I)：取斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448h， 沿管壁加入歐-波氏試劑數(shù)滴，輕微搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試 劑本色為陰性。 甲基紅試驗(M)：取斜面培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48h。每1ml培養(yǎng)物中加入甲基紅試劑1滴搖勻，立即觀察結(jié)果，呈鮮紅色或 桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。 V-P試驗(Vi)：取斜面培養(yǎng)物接種于

37、磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 48h，每2ml培養(yǎng)液中加入V-P試劑甲液(6-萘酚乙醇溶液)1ml，混勻，再加 V-P試劑乙液(40KOH)0.4ml，充分振搖，如在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅 色為陰性。 枸櫞酸鹽利用試驗(C)：取斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培 養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng) 基顏色無改變，無菌苔生長為陰性。 大腸桿菌IMViC反應(yīng)模式為+-或-+-。 4. 結(jié)果報告：結(jié)果報告： 完全符合以下結(jié)果時，判定為檢出大腸桿菌：染色鏡檢是G-無芽胞桿菌；發(fā) 酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；IMViC試驗反應(yīng)為+-或-+-。 一、

38、活螨的檢查 二、活螨卵的檢查 螨屬于節(jié)肢動物門蛛形綱蜱螨目，其種類多，分布廣，在土壤、水、 動植物、食品和藥品中均可發(fā)現(xiàn)。藥品可因其原料、生產(chǎn)過程、包裝、 運輸、貯存等條件不良，受到螨的污染。藥品染螨后，可在短期內(nèi)發(fā) 霉變質(zhì)失效，一些螨類還可直接引起皮炎、肺螨、腸螨等疾病,傳播疾 病或危害人體健康。藥典規(guī)定，藥品特別是中成藥，不得檢出活螨。 （一）螨的形態(tài)特征（一）螨的形態(tài)特征 螨的體形小，多在1mm以下，肉眼可察見，但需用放大鏡或顯微鏡才 能觀察鑒別。螨的形狀一般呈卵圓形或橢圓形，無頭、胸、腹界限。 幼蟲足三對，成螨足多數(shù)為四對。足通常有六節(jié)組成?？谄飨蚯岸送?出，螯肢常呈螯鉗狀，有齒，由2

39、3節(jié)組成。須肢節(jié)數(shù)因種類而異， 由15節(jié)組成。有些種類在軀體前端或兩側(cè)有12對眼。軀體兩側(cè)對 稱，表面被有堅硬的幾丁質(zhì)的板。體表有剛毛。螨的形態(tài)因種類而異 （見圖）。螨類與蜘蛛、昆蟲（如書虱），外形比較近似，應(yīng)注意區(qū) 別（見表4-1）。 圖中藥材中常見的螨 （二）活螨的檢查（二）活螨的檢查 1. 活螨的一般檢查方法活螨的一般檢查方法 （1）漂浮法：）漂浮法：將供試品放入盛有適量飽和 鹽水的漂浮瓶中，攪拌均勻。再緩慢加入 飽和鹽水，至液面略高于瓶口（為防止水 溢出，可將漂浮瓶放在培養(yǎng)皿內(nèi)），上覆 以潔凈的載玻片，使玻片與液面接觸沾取 液面上的漂浮物，將載玻片迅速翻轉(zhuǎn)，置 顯微鏡下觀察。 （2）直

40、檢法：）直檢法：取供試品先用肉眼觀察，若有疑似活螨的 白點或其他顏色的點狀物，可用510倍放大鏡或?qū)嶓w顯 微鏡檢查。有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨 放在滴有一滴稀甘油的載玻片上，置顯微鏡下觀察。 （3）分離法：）分離法：也稱烤螨法，將供試品置于附有適宜孔徑 篩網(wǎng)的玻璃漏斗內(nèi)，利用活螨避光、怕熱的習(xí)性，在漏斗 的廣口上面放一個60100W的燈泡，距離藥品6cm處， 照射12h?；铗裳芈┒返撞考?xì)頸內(nèi)壁向下爬，用小燒 杯裝半杯稀甘油，放在漏斗的下口處，收集爬出的活螨。 發(fā)絲針的制作：取長約10cm的小金屬棒一根和長約1.5cm 的頭發(fā)絲一根，以頭發(fā)絲長度的一半緊貼在金屬棒的尖端 上，用細(xì)

41、線將其纏緊，然后粘上加拿大樹脂或油漆晾干， 即得。 2. 各型中藥制劑活螨的檢查各型中藥制劑活螨的檢查 各劑型供試品，每批應(yīng)抽取2瓶或2盒以上的包裝單位；貴重或微量包 裝的供試品，取樣量可酌減。必要時，可再次抽樣，或選取有疑問的 樣品進行檢查。 （1）大蜜丸：）大蜜丸：將藥丸外殼（蠟殼或紙蠟殼）置酒精燈小火焰上，轉(zhuǎn) 動，適當(dāng)燒灼（殺滅外殼可能污染的活螨）后，小心打開。表面完 好的藥丸，用消毒的解剖針刺入藥丸，手持解剖針，在放大鏡或?qū)嶓w 顯微鏡下檢查。同時注意檢查丸殼的內(nèi)壁或包丸的油紙有無活螨。 有蟲粉的藥丸，可用放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡直接檢查，也可用漂浮法檢 查。 （2）小蜜丸、水丸：）小蜜丸、水

42、丸：表面完好的藥丸，可將供試品放在預(yù)先襯有 潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或小搪瓷盤中，用直檢法檢查。如未能檢出活螨時， 可再用漂浮法或烤螨法檢查；有蟲粉的藥丸，可用直檢法或漂浮法 檢查，同時注意檢查藥瓶內(nèi)壁及內(nèi)蓋有無活螨。 （3）散劑、顆粒劑和膠囊劑：）散劑、顆粒劑和膠囊劑：先直接檢查藥品內(nèi) 蓋及塑料薄膜袋的內(nèi)側(cè)有無活螨。后將藥品放在 襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或搪瓷盤中，使成薄層， 直接檢查。必要時可再用漂浮法檢查。并注意檢 查藥瓶口及內(nèi)壁是否有螨。 （4）塊狀沖劑：）塊狀沖劑：直接檢查供試品的包裝蠟紙、玻 璃紙或塑料薄膜的內(nèi)側(cè)有無活螨。有蟲粉者，用 直檢法配合漂浮法檢查。 （5）液體制劑及半固體膏劑：）液體

43、制劑及半固體膏劑：先用75%乙醇將藥 瓶的外蓋螺口周圍消毒后小心旋開外蓋，用直檢 法，檢查藥瓶外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口內(nèi)外的周圍與內(nèi)蓋 有無活螨。必要時配合漂浮法和烤螨法檢查。 螨卵極小，一般在0.1mm以下，乳白色，卵圓形。 顯微鏡下才能察見。對可疑供試品，未檢出活螨 時，應(yīng)注意檢查活螨卵?？刹捎脵z查活螨的直檢 法或漂浮法檢查。如發(fā)現(xiàn)可疑螨卵時，小心挑取， 放入中央滴有2滴稀甘油的載玻片上，置顯微鏡下 檢查。為確證挑取物是否為活螨卵，可將上述載 玻片置培養(yǎng)皿中，加蓋。2530培養(yǎng)10d， 每天上、下午定時用顯微鏡檢查，如在稀甘油中 孵出幼螨，則判斷為檢出活螨卵。 （四）檢驗報告（四）檢驗報告 供試品按

44、上述規(guī)定檢查，檢出活螨，應(yīng)作檢出活螨報告； 未檢出活螨，但檢出活螨卵，也按檢出活螨處理。 為保留陽性結(jié)果備查，可將檢出的螨按下法處理保存：將 活螨放在預(yù)先滴有1滴75%乳酸液的載玻片上，蓋上蓋玻 片，在酒精燈小火焰上來回移動，緩緩加熱片刻，使其適 當(dāng)透化，即可鏡檢。鑒定后的螨體，可放入70%的乙醇中 保存，或作固定處理。 一、供試用家兔 二、試驗前的準(zhǔn)備 三、檢查方法 四、結(jié)果判斷 按規(guī)定作好實驗前的準(zhǔn)備。檢查時，取適用的家兔3只， 測定其正常體溫后15min內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量 并溫?zé)嶂良s38的供試品溶液，然后每隔30min測量其體 溫1次，共測6次，以6次中最高的一次體溫減去正常體溫， 即為該家兔體溫的升高。如3只家兔中有一只體溫升高 0.6或0.6以上，或3只家兔體溫升高均低于0.6，但 體溫升高的總和達1.4或1.4以上，應(yīng)另取5只家兔復(fù) 試。如果初試的3只家兔體溫升高均低于0.6，并且3只 家兔體溫升高的總和低于1.4，或在復(fù)試中，體溫升高 為0.6或0.6以上的家兔僅有1只，并且初、復(fù)試的8只 家兔體溫升高總和為3.5或3.5以下，均認(rèn)為供試品的 熱原檢