重組人干擾素α-2b

1、重組人干擾素-2b生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)(趙楊楊，河南城建學(xué)院，平頂山，)摘要：重組人干擾素-2b(rIFN 2b)是一種廣譜抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥物。干擾素是病毒進(jìn)入機(jī)體后誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的反應(yīng)物，它從細(xì)胞釋放后可促使其他細(xì)胞抵抗病毒的感染，干擾素增強(qiáng)免疫功能的機(jī)理是：調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫監(jiān)視，防御和穩(wěn)定功能，使殺傷(NK)細(xì)胞、Tc細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷作用增強(qiáng)；使吞噬細(xì)胞的活力增強(qiáng)；誘導(dǎo)外周血液中單核細(xì)胞活性；增加或誘導(dǎo)細(xì)胞表皮主要組織相容復(fù)合物抗原的表達(dá)。臨床用于治療多發(fā)性骨髓病，后天免疫缺損癥(AIDS)病人所患的卡波濟(jì)肉瘤、惡性黑色素瘤、毛狀細(xì)胞白血病及慢性活動(dòng)性乙型肝炎。關(guān)鍵詞：重組人干

2、擾素-2b、菌種構(gòu)建、分離、純化、檢測1.基因工程假單胞桿菌菌種的建立 1.1干擾素基因的克隆 從感染新城疫病毒的人血紅白細(xì)胞中分離干擾素-2b基因的mRNA，由逆轉(zhuǎn)錄酶將Poly（A）RNA反轉(zhuǎn)錄形成cRNA第一鏈。再由DNA聚合酶的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二條鏈。在dCTP存在的條件下，利用末端轉(zhuǎn)移酶給cDNA加Poly（dC)尾，連接到質(zhì)粒pBR322上。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并用氨芐青霉素和四環(huán)素篩選抗性克隆，獲得編碼人干擾素-2b的基因序列。1.2干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建 把干擾素基因與宿主載體pAYC37連接，篩選出序列正確的表達(dá)載體pVG。將表達(dá)載體導(dǎo)入假單胞桿菌

3、中，篩選得到干擾素工程菌，表達(dá)重組人干擾素-2b不低于2.0109IU/L，并具有氨芐青霉素、四環(huán)素和鏈霉素的抗性。2. 重組人干擾素-2b發(fā)酵與純化2.1重組人干擾素-2b工程菌的發(fā)酵取菌種1ml接種于100ml LB培養(yǎng)基(含50g/ml氨芐青霉素)的錐型瓶中,搖床30震蕩培養(yǎng)67h,OD值達(dá)0.60.7h,按120的比例轉(zhuǎn)種于1000ml LB培養(yǎng)基中,搖床30震蕩培養(yǎng)78h,OD值達(dá)1.01.2h,接種30L發(fā)酵罐中,30培養(yǎng)45h后,42培養(yǎng)4h,離心收集菌體。2.2菌體破碎及包涵體的提取將菌體加入A液懸浮洗滌35次,取洗滌后的菌體加入4倍體積的A液,冰浴條件下超聲破碎15次,30s

4、/次,每次間隔30s,離心收集沉淀,加入B液和C液各洗滌3次,離心后收集沉淀物即為包涵體。2.3包涵體的溶解及復(fù)性包涵體加入5倍體積的D液,冰浴條件下,抽提2h,再將抽提液迅速用E液100倍稀釋,4放置2h后裝透析袋,于20倍體積的F液透析2024h。2.4重組人干擾素2b的純化離子交換柱層析:采用DEAE Sepharose(FF)柱,柱型XK30/50。用F液平衡后,將上述透析后的復(fù)性液樣品上樣,流速為20ml/min,上樣結(jié)束后,以含不同濃度NaCl的F液洗脫,收集干擾素活性峰。選用Sephacryl00/50XK層析柱,S-100填料,柱體積1700ml,用G液平衡后,將離子交換柱層析

5、收集的干擾素活性峰樣品經(jīng)凝膠過濾,上樣量為柱床體積的5%,再收集干擾素活性峰,合并樣品進(jìn)行以下檢定。3. 重組人干擾素-2b的檢定23.1生物學(xué)活性檢測選用微量細(xì)胞病變抑制法(Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng))進(jìn)行檢測。3.1.1 將SH細(xì)胞(人羊膜傳代細(xì)胞株)接種于96孔培養(yǎng)板，置375CO2溫箱中培養(yǎng)1218h使其生長成單層。3.1.2 去除營養(yǎng)液，依次加入系列稀釋的IFN檢品，每個(gè)稀釋度各加2孔。同時(shí)設(shè)不同稀釋度的IFN標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。375CO2溫箱中孵育過夜。3.1.3 去除IFN溶液，用100TCID5的VSV攻擊(細(xì)胞對(duì)照孔加不含病毒的營養(yǎng)液)，再培養(yǎng)12do待病毒對(duì)

6、照孔細(xì)胞全部或75以上出現(xiàn)明顯病變時(shí)，即可在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果或用結(jié)晶紫將細(xì)胞染色后，肉眼觀察結(jié)果。3.2蛋白濃度測定選用Lowry法測定,標(biāo)準(zhǔn)蛋白由中國藥品生物制品檢定所提供。3.3電泳純度檢測選用非還原SDS-PAGE電泳,濃縮膠4.5%,分離膠13.5%,銀染法染色后,CS930掃描儀掃描,波長370m。3.4 HPLC純度檢測選用Protein-PAKl25色譜柱檢測。3.5 分子量的測定選用還原型SDS-PAGE電泳,以Pharmacia公司分子量標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,CS930掃描儀掃描后,計(jì)算結(jié)果。3.6紫外光譜掃描全波長紫外光譜掃描,讀取最大吸收峰值。3.7殘余DNA含量測定用地高辛法測定。3.8殘余宿主菌蛋白含量測定用ELISA法測定。參考文獻(xiàn)：1 吳梧桐,王友同,吳文俊.21世紀(jì)生物工程藥物的發(fā)展與展望.藥物生物技術(shù)2000,7(2):65-70.2 中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編.中國生物制品規(guī)程S.2000版,化學(xué)工業(yè)出版社,2000年.3 劉凡實(shí),姜崴,隋寶真. 重組人干擾素-2b的提取和純化.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展.2004,32(1):1316.4 石曉麗,萬里,王東倩,等. 重組-2b型人干擾素工程菌菌種穩(wěn)定性試驗(yàn).中國生物制品學(xué)雜志.1999