基于RAPD標記分析蔥屬7個栽培品種的遺傳多樣性

1、安徽農業(yè)科學。JournalofAnhuiignSci2009。37(35)：1738217383。17385責任編輯 張楊林 責任校對 盧礙基于 RAPD標記分析蔥屬 7個栽培品種的遺傳多樣性劉良科，歐立軍，蔣向輝，陳志鑫 (懷化學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化41808)摘要 目的利用 RAPD標記分析蔥屬7個栽培品種的遺傳多樣性。方法采取改良CTAB法提取植物的總 DNA，從 68個 RAPD引物中篩選出25條具有多態(tài)性且擴增穩(wěn)定的引物用于品種的 DNA多態(tài)性分析，采用優(yōu)化后的 RAPD的PCR反應體系進行 PCR擴增，利用 MEGA4軟件進行各品種間 UPGMA

2、聚類分析。結果從 25個引物中共擴增出245條 DNA帶，其中99條為多態(tài)性帶。根據聚類分析，蔥屬 7個栽培品種可分為 2類：漢中冬韭、阜豐 1號和豫韭 2號為 1類；其他4個為 1類，其中懷化大蒜和南寧大蒜、連蔥6號和杭州分蔥各為 1小類；7個品種的相似系數范圍為 802 998。該聚類結果與依據表型特征的傳統(tǒng)分類的結果一致。結論該研究為準確地進行蔥屬植物種質資源的鑒定、篩選和利用提供了科學依據。關鍵詞 蔥屬；RADP標記；遺傳多樣性；聚類分析中圖分類號 S63文獻標識碼 A文章編號 o51766l1(2009)351738202Analysis on Genetic Diversity o

3、f7 CultivarsofAlium based on RAPD M arkersLIU Liang-keetal (KeyLaboratoryofHunanProvinceforStudyandUtilizationofEthnicMedicinalP1antReources，HuaihuaUniversityHuaihuaHunan4180o8)Abstract ObjectiveThepurposewastoanalyzethegeneticdiversityof7cultivars ofAlium basedonRAPD markersMethod111etotalDNA in pl

4、antwasextracted by improved CTAB method and25 RAPD primerswith polymorphism and stableamplification wereselectedfrom 68 RAPD primerstoanalyze DNA polymorphism of7 cultivar ofAlliumPCR amplifcation was made by PCR reaction system ofoptimizedRAPD nIe UPGMA clusteranalysison variousvarietieswas conduct

5、ed by MEGA4 softwarefResult245 DNA bandswere amplified outfrom 25 primers ，amongwhich，99werepolymorphism bandsAccordingto clusteranalysis，7 cuhivarsofAUium weredivided to2classes：A tuberosum cvHangzhong WinterLeekAtuberosum cvFufeng No1 leek andAtuberosum cvHenan No2 leek belonged toa class：the othe

6、rs belonged to a class including 2 branches，in which，Asativum cvHuaihua garlic and Asativum cv Nanning garlic belonged to a branch；Acepa cvLiancongNo6 onion andA tulosum varcaepitusum cvHangzhou Spring shalotbelonged to the otherbranchThe similaritycoeficientsin 7 cultivarsofAlium were from 802 to 9

7、98 I e resultofclusteranalysiswasconsistentwith the traditionalclassifcationbasedonmorphologictraitsConclusionThisstudyprovidedthescientifcbasisforaccurateidentification，screeningandutilization ofAllium plantgermplasm resourceKey words Allium：RAPD marker；Genetic diversity：Clusteranalysis蔥屬(AUium L)屬

8、于百合科(Liliaceae)蔥族 (Allieae)，是百合科中種類最多的一屬，全世界約有 700多種 ，多分布于北溫帶。我國有 138種，11變種，主要分布在東北、西北和西南地區(qū)。由于蔥屬的屬下分類的界限無統(tǒng)一標準，從而導致種的數目不斷增加，國內外學者對蔥屬植物的種類尚無一致的觀點。由于缺乏明顯的總體形態(tài)學共有衍征，因而亞屬等的劃分具有很大的人為性，關于其屬下系統(tǒng)及系統(tǒng)發(fā)育和進化問題尚存在不少分歧。許多學者認為屬下分類群的區(qū)別特征都以一些細微的形態(tài)學差異組合而成，有時這些特征在蠟葉標本上幾乎無法觀察到或難以確認，因此該屬的分類學問題一直是一個難題 。RAPD、SRAP、RFLP等分子標記技

9、術既可對蔥屬植物進行種內遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，也可建立每種蔥屬植物的 DNA分子指紋圖譜 ，從而為該屬的屬下分類提供重要的依據，這有利于更加準確地研究蔥屬植物自然的屬下系統(tǒng)和親緣關系，為人們更好地利用蔥屬植物提供科學依據。1 材料與方法11 材料 試驗材料及來源見表 1。12 方法121 DNA提取。該試驗采取改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法 提取植物總 DNA。122 隨機引物選擇。隨機引物采用美國Operon公司設計基金項目 懷化學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室資助項目。作者簡介 劉良科 (1963一 )，男，侗族，湖南會同人，教授，從事植物分子細胞遺傳學研究

10、。收稿日期 2009-0817的 68個隨機引物，通過預備試驗，選取了25個引物用于對蔥屬 7個栽培品種基因組 DNA的隨機擴增，部分引物及序列見表 2。表 1 試驗材料及來源Table1 Thetestmaterials andtheir origin123 PCR擴增。采用優(yōu)化后 RAPD的 PCR反應體系：30 50ngIxlDNA 20 ，25mmolL10Buffer(力口MgC12)25l，2 U l z DNA polymerase 04 l，10 mmolL dNTP MIX05 1，引物 15 Ixl，ddH O 181txl，進行 PCR擴增。反應程序：94預變性 3min

11、；然后 94 45s，36oC45s，72 45s，4JD個循環(huán)；最后 72qC延伸 10min。PCR產物經05mgL溴化乙錠的08的瓊脂糖凝膠電泳后用 Tanon4100型凝膠處理系統(tǒng)照相，記錄電泳結果。124 數據處理。根據電泳結果記錄清晰可重復的 RAPD 帶，在相同遷移位置，擴增條帶存在時賦值為 A，否則賦值為G。計算蔥屬品種問的遺傳相似系數，即根據公式 F=37卷 35期劉良科等 基于 RAPD標記分析蔥屬 7個栽培 品種的遺傳多樣性17383(2 ： 。+ )100計算不同品種問的相似系數，其中 品種2的 DNA擴增譜帶數。各品種之間的遺傳距離 P=1一F表示相似系數， 為品種

12、1和品種 2共同具有的分子量 F。根據遺傳距離并利用 MEGA4軟件進行各品種間 UPGMA 相同的 DNA譜帶數 ， 為品種 1的 DNA擴增譜帶數， 為 聚類分析。表 2 試驗所用部分引物及序列Table 2Partial primers and their sequences引物 Primers序列 Sequence引物 Primers序列 Sequence引物 Primers序列 SequenceSBSA01CAGGCCCTTCSBS A15ITCCGAACCCSBS909CTCACCGTCCSBSA02TGCCGAGCGSBSA16AGCCAGCGAASBSS10TGTCTGGGTG

13、SBS A03AGTCAGCCACSBSA17GACCGCTIIGTSBS S11AAAGCIIGCGGSBSA04AATCGGGCTGSBSAl8AGGTGACCCTSBSS12TGTCATCCCCSBS。AO5AGGGGTCTrGSBSA19CAAACGTCGGSBSS13AAGCCTC( SBS。A06GGTCCCTGACSBSA2OGTIIGCGATCCSBSS14TGCGTGCrrGSBSA07GAAACGGGTGSBS SOlIIGAGCCAGSBSS15GACGGATCAGSBSAO8GTGACGTAGGSBS S02GTGAGGCGTCSBSS16CACAC ICAGSBSAO

14、9GGGTAACGCCSBSSO3GGGGGTCrrTSBSS17ITCCCCCCAGSBS-A10GTGATCGCAGSBSSo4CCGCATCTACSBSS18TGAGTGGG IIGSBS-Al1CAATCGCCGTSBSSO5GATGACCGCCSBSS19GTrGCCAGCCSBSA12TCGGCGATAGSBSS06GAACGGACTCSBSA14ITGTGCTGGSBSA13CAGCACGCACSBSSO7GTCCCGACGASBSO8STGGACCGGTG2 結果與分析4040，無多態(tài)性譜帶數 146條。不同引物擴增出的 DNA21 PCR擴增結果 篩選出的 25個 10bp寡

15、核苷酸隨機帶數差異較大，其變化范圍為010條，平均每個引物可擴增引物對 7個蔥屬品種的總 DNA樣本進行擴增，共得到 245條 98條 ，擴增片段長度都在 1002000bp。圖 1為引物 SBS 擴增 DNA片段，其 中有 99條表現出多態(tài)性 ，占總條帶數的 A03、SBSA13的 RAPD擴增圖譜。注：A為 SBS-A03；B為 SBSA13。17為 7個 恧屬品種的檢測結果。Note：A ，SBSA03；B，SBS-A13；17 are the detection results ofseven cultivars ofAllium圖 1 引物 SBS-A03和 SBS-A13的 RAP

16、D產物圖譜Fig1 RAPD products witllthe pnIIlers ofSBS-A03 and SBS-A1322 聚類分析結果 根據 DNA擴增結果計算出各品種間的相似系數，其分布范圍在 802 998。其中漢中冬韭、阜豐 1號和豫韭 2號兩兩之間的相似系數最大，分別為998、99O、989；懷化大蒜和南寧大蒜之間的相似系數為 977(表 3)。表 3 7個蔥屬 品種的相似系數Table 3 Similarity index among 7 cultivars ofAllium注：1-7分別為表 l對應的7個蔥屬品種編號。下同。Note：17 are thenumberoft

17、he seven cultivarsofAllium in Table 1Thesame as belowMEGA40軟件處理 DNA圖譜得到聚類分析圖(圖 2)。聚類分析結果表明，7個品種分為 2支。其中漢中冬韭和阜豐 1號聚類再與豫韭 2號相聚為一支，懷化大蒜和南寧大蒜先聚類再與連蔥 6號 、杭州分蔥相聚為另一支。由此可將這7個蔥屬品種分為兩大類：韭菜單獨一類；另一類包括洋蔥、蒜和蔥。3 討論(1)漢中冬韭、阜豐 1號和豫韭 2號是韭的 3個栽培品種，來自不同的省區(qū)，它們兩兩之間的相似系數最大，分別為998、990、989，這說明韭在馴化栽培過程中基因變異較小，基因比較保守，受環(huán)境影響也較

18、小，從而表現出遺傳差異不大。同樣 ，懷化大蒜和南寧大蒜是蒜的 2個栽培品種，相似系數為 977。(2)周頌東等建議將中國蔥屬植物分為 6亞屬級，在部分亞屬級下，可以再分組。根據周頌東的建議，韭隸屬于根莖亞屬，洋蔥、蒜和蔥隸屬于蒜亞屬 。該研究中，連蔥6號、(下轉第 17385頁)37卷35期王敏等 快粵取小砉寸 DNA的一種簡易方法17385GhDREB基因的濟麥 19379轉基因小麥株系的植株都擴增 DNA降解。因為 DNA分子量較大，機械張力或高溫很容易出與陽性對照一樣的條帶，且?guī)Ъy清晰。說明該方法提取到 DNA分子發(fā)生斷裂。因此，在實際操作過程中應盡可能輕的基因組 DNA能十分有效的進行

19、 PCR擴增，完全適用于后 緩，盡量避免過多的溶液轉移及劇烈震蕩等，以減少機械張續(xù)分子生物學研究。力對 DNA的損傷。同時要避免過高的溫度，以保證 DNA的完整性。與傳統(tǒng)的 CTAB法 相比，改良的 CTAB法所需材料量少，無需稱量，直接用離心管夾取；研磨直接在離心管中進注：M為 Mark；P為 陽性對照；16為水；15為非轉化植株對照；114為濟麥 19-379轉基因小麥株系。Note：M Marker； P Positive control； 16 Water； 15 Nontransformed plantcontrol；114Transgenic wheatlines ofJimai1

20、9379圖2 轉基因小麥株系 PCR擴增 電泳圖譜rig2PCR amplified electrophoretogram of transgenic wheatlines3 討論31 材料的選擇與保存 前人的研究證明，對于大多數植物而言，健康的嫩葉是試驗最佳的樣本來源。因為健康的嫩葉不僅含有較少的代謝物，同時細胞數量也更多，而如果選擇成熟或老化的葉片組織，多糖、多酚等代謝物質相應增加，會給基因組 DNA的提取帶來 困難，也會影響下游試驗。但對小麥而言，筆者經過反復試驗對比發(fā)現，在提取基因組DNA時對材料的要求不是很嚴格，只要是健康的綠葉，無論選擇嫩葉或是老葉提取出來的 DNA無論從質量上還是

21、得率上差別都不是很大。32 操作步驟 提取 DNA的過程中有很多因素能導致使行，不必先在研缽中研磨然后再轉移到離心管里，能有效減少材料損失；氯仿：異戊醇(24：1)抽提也由原來的抽提 3次變?yōu)楝F在的抽提 1次 ，但所提取的 DNA無論從質還是量上與抽提 3次相比并無太大差別。試驗結果證明，當需要提取的樣本量很大，而所需的 DNA量較少，用這種改良的 CTAB 法提取小麥葉片總 DNA，可以縮短操作周期、節(jié)省時間，并且需要材料量少、成本低、得率高、純度好，可用于 PCR等分子生物學研究的需要。參考文獻1李希臣，雷勃鈞，盧翠華，等高效的植物 DNA提取方法J生物技術，1994，4(3)：39412

22、宣樸，徐利遠，余桂容，等植物 DNA快速高效提取方法研究J西南農業(yè)學報，1998，11(2)：l111143張明永，孫彩云，梁承鄴一步法提取植物 DNA用于大規(guī)模 RAPD分析J遺傳，2O0O，22(2)：1064房慧旺，劉慶華，王奎玲，等10種繡線菊 DNA的提取及 RAPD反應體系的優(yōu)化 J中國農學通報，2008，24(2)：67-695黃曉丹，張云貴，應鐵進高質量植物基因組 DNA的提取 J植物生理學通訊，2OO6，42(2)：3113146陳燕不同pH值對 DNA提取率的影響J安徽農業(yè)科學，2008，36(5)：177517797黃文霞，何覺民一種適于 PCR擴增的蓖麻基因組 DNA提取方法J中國農學通報，20O7，23(11)：61638徐粵宇，周玉雷，趙茂林，等多枝賴草基因組 Mb級 DNA制備和酶切方法的優(yōu)化J華北農學報，2007，22(6)：24289肖璇，孫敏，王心燕，等頑拗植物龍眼基因組 DNA提取方法的研究J生物技術，2005，15(1)：444610趙衛(wèi)國，潘一樂從桑樹營養(yǎng)組織中提取高純度 DNA的方法J江蘇蠶2001(1)：920(上接第 17383頁)(3)該研究表明，利用 RAPD標記能夠在 DNA水平上進1510n 50注：