天然藥物化學(xué)--天然藥物的研究開發(fā)

1、第十一章 天然藥物的研究開發(fā)祖國(guó)醫(yī)藥在長(zhǎng)期實(shí)踐中所積累的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，是藥物研究和尋找新藥的一個(gè)極其重要的源泉和基礎(chǔ)，如：中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)和歷代醫(yī)書上記載青蒿對(duì)抗瘧有效，由此而研究制出抗瘧有效成份青蒿素，再如從中藥麻醉藥洋金花中篩選出來的有效成份東茛菪堿，也是從古醫(yī)書中挖掘出來的，等等許多。我們的祖先在用中草藥防治疾病時(shí)，大多用水煎或酒浸來提出有效成份，并做成丸、散、膏、丹等劑，那么，總觀中藥、天然藥物的用藥情況，大體有三種形式。 1、原生藥，2、精提取物，3有效成份或活性成份單體。 第一種形式：主要以中藥飲片煎煮服用。其優(yōu)點(diǎn)是可以根據(jù)具體病情，適當(dāng)增減某味藥，針對(duì)性強(qiáng)，靈活機(jī)動(dòng)，效果好，但用量大，使用保

2、存都不方便。 第二種形式：在搞清有效成份的基礎(chǔ)上，將中藥、天然藥物經(jīng)過一定程度的加工提取，去粗取精，去偽存真，將中藥加工成用量小，毒副作用小，高效速效，生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用、攜帶方便的藥物劑型，作為醫(yī)藥商品進(jìn)入市場(chǎng)，這樣，可使藥品質(zhì)量有一定的保證，且生產(chǎn)工藝也不復(fù)雜，成本也低。 第三種形式：就是在搞清有效成份的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代科學(xué)方法，從中藥或天然藥中直接提取有效成份單體，含量低的或可進(jìn)行化學(xué)合成，再作成適當(dāng)劑型入藥，這種形式，因成份結(jié)構(gòu)清楚，其療效確切，質(zhì)量易控制，并可通過構(gòu)效關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行一系列化學(xué)修飾，以降低毒性，提高效療效，應(yīng)該是最好的一種形式，但生產(chǎn)復(fù)雜，成本也高。新藥開發(fā)不是一件容易事

3、，它需要龐大的經(jīng)費(fèi)，同時(shí)需要一個(gè)非常復(fù)雜的高技術(shù)密集型系統(tǒng)工程，涉及化學(xué)、藥理、毒理、臨床、制劑等多學(xué)科領(lǐng)域。根據(jù)國(guó)際成熟經(jīng)驗(yàn)，大約平均合成一萬個(gè)化合物，才有可能希望研制出一個(gè)新藥，成功率很低，且周期長(zhǎng)，一般需要十年以上，投資約為2-2.5億美元。當(dāng)然，中藥、天然藥（民間藥物）因有千百年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)積累，其實(shí)驗(yàn)對(duì)象是人，其藥理作用是以人體為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)確定的，再將其應(yīng)用到人，其療效是無可置疑的，而西藥則不同，以動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，與人體必有差別。所以，從中藥中開發(fā)新藥，成功率較高，可能會(huì)縮短一些時(shí)間，研究周期較短，但其工作量之大，投入之多也可想而知的。一、產(chǎn)物天然的研究開發(fā)程序 從天然藥物或中藥中開發(fā)

4、新藥至少包括以下五種形式： 第一種形式：經(jīng)過文獻(xiàn)資料或民間用藥的調(diào)研或通過現(xiàn)代藥理學(xué)的篩選研究（含體內(nèi)、體外等研究），發(fā)現(xiàn)某種動(dòng)物、植物、礦物或微生物具有藥用價(jià)值，然后將其開發(fā)成新藥。 第二種形式：已知某種成分或某類成分具有藥用價(jià)值或已成為新藥，根據(jù)動(dòng)植物的親緣關(guān)系，尋找含有這種或這類成分的動(dòng)植物，進(jìn)而將其開發(fā)成新藥。如來自于黃連、黃柏中的黃連素具有抗菌、消炎的作用，臨床療效良好，但因黃連、黃柏均系貴重藥材，資源有限，故限制了黃連素的廣泛使用。根據(jù)植物的親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)三顆針中也含有黃連素，進(jìn)而將三顆針開發(fā)成一個(gè)新藥。又如人參皂苷是人參中的主要有效成分，具有多方面的藥理作用。通過對(duì)人參莖葉的研究發(fā)

5、現(xiàn)人參莖葉中含有大量的皂苷，且與人參中的皂苷類似，進(jìn)而將人參莖葉中的皂苷開發(fā)成一個(gè)新藥，廣泛用于保健藥物和某些中藥復(fù)方。再如具有良好鎮(zhèn)痛作用的延胡索乙素，其在延胡索中的含量很低，而對(duì)其全合成成本又很高，從而限制了延胡索乙素的使用。根據(jù)植物親緣關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)防己科植物黃藤(x6rq“reo乩nc。九o)的根和根莖中含有大量的巴馬汀(可高達(dá)253)，巴馬汀經(jīng)鋅粉和硫酸還原就可方便地轉(zhuǎn)化成延胡索乙素，從而解決了延胡索乙素的資源問題。 第三種形式：在不明確有效成分的基礎(chǔ)上，將臨床療效明確的經(jīng)典方、經(jīng)驗(yàn)方或經(jīng)藥效學(xué)研究具有開發(fā)價(jià)值的復(fù)方中藥開發(fā)成新藥，或?qū)F(xiàn)有的新藥改變劑型如由口服液改為片劑、注射劑等（現(xiàn)

6、臨床上使用的大部分中藥即屬于這種形式的新藥）。采用這種形式開發(fā)的新藥雖然有效成分不明確，藥品的質(zhì)量控制難度較大，但它具有生產(chǎn)工藝不太復(fù)雜、成本較低、比較符合我國(guó)國(guó)情等特點(diǎn)。 第四種形式：在基本上搞清了有效成分和有效部位的基礎(chǔ)上，將有效部位開發(fā)成新藥，如目前在臨床上廣泛使用的地奧心血康、銀杏葉制劑等。因有效成分已明確或基本明確，故采用這種方法開發(fā)的新藥具有藥品的均一性較易控制、臨床療效穩(wěn)定、質(zhì)量易于得到保證等特點(diǎn)。 第五種形式：通過天然藥物或中藥中的有效成分或生物活性成分的研究，從中發(fā)現(xiàn)有藥用價(jià)值的活性單體或潛在藥用價(jià)值的活性單體即先導(dǎo)化合物（有一定的生物活性，但因其活性不夠顯著或毒副作用較大，

7、無法將其開發(fā)成新藥的具有潛在藥用價(jià)值的化合物稱先導(dǎo)化合物）。通過對(duì)先導(dǎo)化合物構(gòu)效關(guān)系的研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)有藥用價(jià)值的化合物，然后按照國(guó)際慣例經(jīng)過一系列的研究將其開發(fā)成新藥。如麻黃素、黃連素、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等均是直接從天然藥物中開發(fā)出來的新藥，蒿甲醚、普魯卡因、鎮(zhèn)痛新、-甲基地高新等則都是經(jīng)天然先導(dǎo)化合物構(gòu)效關(guān)系的研究和結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)出來的新藥。雖然這些新藥均起源于對(duì)天然藥物或中藥中生物活性物質(zhì)的研究，但在工業(yè)生產(chǎn)中它們并不局限于從天然藥物中提取，通過對(duì)材料來源、經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境保護(hù)等綜合因素考慮，可以從直接從天然藥物中提取、半合成或全合成三種方法中任選取一種。雖然從天然藥物或中藥中開發(fā)新藥的

8、方法多種多樣，但是對(duì)于具體情況要做具體分析，不可 能采用一個(gè)固定的模式，應(yīng)根據(jù)具體研究課題的特點(diǎn)采用不同的途徑，但無論采用何種方法和途徑開發(fā)新藥都要大體經(jīng)過以下三個(gè)階段，即：臨床前研究；臨床研究；試生產(chǎn)（期臨床實(shí)驗(yàn)，主要是考察其安全性）。表111是國(guó)際上開發(fā)新藥的大致過程和各個(gè)階段所需的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，可供參考。表11-1 天然物藥品(一類新藥)的開發(fā)研究過程二、天然產(chǎn)物中生物活性成份的研究方法從天然藥物或中藥中開發(fā)創(chuàng)新藥物的關(guān)鍵是能否從天然藥物或中藥中分離得到有藥用價(jià)值或潛在藥用價(jià)值的活性化合物。沒有新結(jié)構(gòu)、新活性的化合物，創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)就成了無源之水、無本之木。中藥具有數(shù)千年的用藥歷史，對(duì)

9、某些疾病具有獨(dú)特的療效，臨床基礎(chǔ)非常雄厚，其中的化學(xué)成分種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎，是創(chuàng)新藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來源，這也是為什么近20年來國(guó)際上對(duì)于從天然藥物中開發(fā)新藥非常重視的根本原因。（一）活性成份的分離研究法：天然活性成份研究也是多學(xué)科協(xié)同研究的問題，應(yīng)有從事生藥、化學(xué)、藥理和臨床等幾方面的配合研究，才能使活性成份的研究得以順利進(jìn)行，尋找中藥有效成份的途徑是多種多樣的，對(duì)每一具體情況，要作具本分析，不可能作一個(gè)固定的模式。 兩種不同方法的思路 1、早期方法：分離與活性測(cè)試分兩個(gè)階段進(jìn)行，即首先分離單體，然后對(duì)單體進(jìn)行活性測(cè)試，這種方法盲目性較大，費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，且對(duì)含量小的成份還可能漏掉。 2、

10、現(xiàn)代方法：在選定供試樣品后（具有活性），在分離活性成份時(shí)，利用化學(xué)指標(biāo)和藥理活性指標(biāo)兩只眼睛，對(duì)分離過程中的每一個(gè)部分都進(jìn)行跟蹤檢查，對(duì)無活性的部位隨時(shí)棄掉，而只對(duì)有效部位繼續(xù)分離，一方面節(jié)省經(jīng)費(fèi)開支，同時(shí)，節(jié)省了一些不必要的分離時(shí)間，另一優(yōu)點(diǎn)如：分離過程中某一過程不當(dāng)，導(dǎo)致活性成份流失，還可以迅速查明原因，及時(shí)補(bǔ)救，當(dāng)有些成份只是在與其它成份混合時(shí)，協(xié)同作用才有效，而分離成純品時(shí)效果就低了或無效。這種情況在中藥分析中也是常見的，這些因素能及時(shí)得到分析。所以說，現(xiàn)代方法成功率是很高的，可以說是一種好方法，只是活性測(cè)試工作量加大。 具體程序如下： 1、調(diào)查：（1） 療效調(diào)查，收集民間驗(yàn)方。（2）

11、 植物鑒別，學(xué)名、來源、產(chǎn)地等。（3） 文南獻(xiàn)收集，主要放在療效上和化學(xué)成份上。 要注意幾個(gè)方面的問題；l 只有療效報(bào)道，無化學(xué)報(bào)道（藥理，臨床醫(yī)學(xué)等雜志）。l 有化學(xué)報(bào)道，無療效報(bào)道的（有關(guān)化學(xué)方面文獻(xiàn)）。l 各方面都不全的。（4）預(yù)試（化學(xué)成份預(yù)試）有單項(xiàng)預(yù)試和系統(tǒng)預(yù)試。 單項(xiàng)預(yù)試：根據(jù)需要，有重點(diǎn)地檢查某類成份，如尋找生物堿類，可在中藥中進(jìn)行生物堿的定性反應(yīng)。 系統(tǒng)預(yù)試（又稱系統(tǒng)分析法）：對(duì)中藥中各類成份進(jìn)行全面檢查，方法較多，如：用梯度溶劑極性法。 用石油可能含油脂，揮發(fā)油，植物甾醇等。 藥渣再用乙醚提?。▋?nèi)酯、黃酮、醌、弱堿性生物堿等）。 再用乙醇提?。ㄟ邦?、生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、

12、鞣質(zhì)等）。 水提?。ǖ鞍踪|(zhì)、多糖、氨基酸）。 然后，各提取部分依照可能含有的成份，選擇各類成份的特有顯色反應(yīng)，沉淀反應(yīng)等，作一般預(yù)試。2、化學(xué)成份的分離 一般途徑，首先要選擇一種簡(jiǎn)便、快速的、能反應(yīng)中藥治療作用的藥理指標(biāo)，作為分離指導(dǎo)，將各部分分開，按照藥理指標(biāo)取舍，直到最后分到活性成份和有效部分 。注意以下幾點(diǎn)： （1）當(dāng)中藥的療效往往不是某種成份產(chǎn)生，而是由多種成份相互協(xié)同表現(xiàn)的，這就要求工作細(xì)致，不要滿足于獲得一種有效成份而忽略其它有效成份。（2）中藥的療效可能是由于多種成份按其原有比例構(gòu)成的混合成份的總療效，若僅以一種成份的藥理指標(biāo)，勢(shì)必?zé)o法代表中藥療效的有效部位和成份。所以，常常發(fā)現(xiàn)

13、某單一成份的療效不如混合成份的療效的事例，亦說明此點(diǎn)。追蹤天然活性成份時(shí)注意事項(xiàng)1、選擇建立先進(jìn)的生物活性測(cè)試方法，是天然活性成成份追蹤分離成功與否的關(guān)鍵所在。 體外試驗(yàn)：方法簡(jiǎn)單，快速。 體內(nèi)試驗(yàn)：用動(dòng)物模型試驗(yàn)，與人本較相近，準(zhǔn)確性高，但費(fèi)用高。還要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異等因素。 一般多采用體外試驗(yàn)，靈敏、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但體外實(shí)驗(yàn)有效，并不說明一定體內(nèi)有效。2、確保試驗(yàn)材料具有活性。3、在眾多的生物活性中，力求找出最本質(zhì)的作用。4、注意正確判斷各餾分的活性。 （二） 天然藥物及中藥中原生生物活性成分的研究1通過調(diào)研或廣泛篩選需要開發(fā)的天然藥物，然后采用體內(nèi)的方法對(duì)該藥進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，

14、以便再次確認(rèn)該藥的開發(fā)價(jià)值并在有效部位或活性部位尋找所使用的活性測(cè)試模型或指標(biāo)。對(duì)于沒有經(jīng)過體外活性測(cè)試的藥物還需確定在活性成分追蹤分離中所使用的體外活性測(cè)試方法及指標(biāo)。2根據(jù)原料藥中化學(xué)成分的性質(zhì)將其粗分成幾個(gè)部分，按等劑量不等強(qiáng)度的原則對(duì)每部分均進(jìn)行活性測(cè)試，確定有效部位。如果每部分均有活性，但活性均不強(qiáng)，則說明粗分失敗，需要改用其它方法進(jìn)行粗分，直到找到其中某一部分或幾部分活性強(qiáng)、剩余部分無活性或活性很弱為止。由于這部分往往得量較高，加之某些天然成分屬于前體藥物(即本身并無活性，在體內(nèi)代謝后其代謝產(chǎn)物具有活性)，故在活性測(cè)試時(shí)最好采用體內(nèi)方法。最常用的粗分方法是將其中的化學(xué)成分按極性大小

15、不同分成幾部分，如水煎、醇沉，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等提取，或?qū)⒃纤幬镆来斡檬兔?、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水等提取。?dāng)然也可根據(jù)其中化學(xué)成分的不同類型采用不同的粗分方法。3采用各種色譜方法和其它方法對(duì)活性部位進(jìn)行分離，每次分離所得組分均需經(jīng)過活性測(cè)試（由于所得量均較少，常采用體外的方法進(jìn)行活性測(cè)試），對(duì)于無效的組分常棄去不再研究，只研究那些有效或有活性的組分，直到追蹤到活性成分。雖然采用活性追蹤的方法其活性測(cè)試樣品和工作量以及所需費(fèi)用均大大增加，而且還需有簡(jiǎn)易、靈敏、快速、可靠的活性測(cè)試方法及與藥理工作者有良好的工作配合條件，有時(shí)因配合不便還需由分離工作者自己承擔(dān)，需要同

16、時(shí)配置分離及活性測(cè)試兩方面的儀器設(shè)備，以及同時(shí)具備分離和生物活性測(cè)定的知識(shí)等等。但采用這種方法可大大減少分離工作的盲目性和在分離過程中造成的活性成分的丟失特別是微量活性成分的丟失（通常微量活性成分其活性往往很強(qiáng)），以即使在分離過程第一階段，由于化合物本身的原因或選擇方法失當(dāng)導(dǎo)致活性化合物分解變化或流散，也能查明原因，采取有關(guān)補(bǔ)救措施獲得分解變化或流散的活性成分，所以大多已采用這種方法進(jìn)行活性成分研究。而只追蹤活性部位，進(jìn)而對(duì)活性部位中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，最后通過測(cè)試所得化學(xué)成分的活性來闡明天然藥物中活性成分的研究方法已逐漸不被人們所采用。4根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)確定單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)已明確

17、化學(xué)結(jié)構(gòu)的單體進(jìn)行活性評(píng)價(jià)（由于確定化學(xué)結(jié)構(gòu)通常并不消耗樣品，而進(jìn)行活性評(píng)價(jià)則需消耗樣品，故先確定結(jié)構(gòu)，后測(cè)試活性）。5對(duì)有開發(fā)價(jià)值的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系的研究，進(jìn)而將其開發(fā)成創(chuàng)新藥物。（圖111） （三）天然藥物及中藥中前體活性成分的研究有些中藥中的化學(xué)成分本身并無生物活性，但經(jīng)體內(nèi)代謝后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的生物活性，這實(shí)際上也是它們中的有效成分。如中藥秦皮具有清熱利濕的作用，在臨床上用于治療痢疾效果良好，其中的主要成分秦皮素并無抗菌活性，但經(jīng)體內(nèi)代謝成3，4-二羥基苯丙酸后，其抗菌作用則優(yōu)于氯霉素。對(duì)于天然藥物中這類生物活性成分的研究常采用體內(nèi)代謝的方法進(jìn)行。即將天然藥物(既

18、可以是天然藥物中的某種成分，也可以是動(dòng)植物原材料)給動(dòng)物食用后，分別收集動(dòng)物的糞便、尿、膽汁，然后采用各種提取分離方法分離它們中的代謝產(chǎn)物，并采用譜學(xué)和與標(biāo)準(zhǔn)晶對(duì)照的方法確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)已知的情況下進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)，對(duì)于有開發(fā)價(jià)值的化合物可采用上述法進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)。(圖11-2)（四）血清藥化學(xué)和血清藥理學(xué)一種天然藥物中含有的化學(xué)成分少則數(shù)十種，多則數(shù)百種。復(fù)方中藥中的化學(xué)成分的數(shù)量將會(huì)更加巨大，要對(duì)這些所有的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究，進(jìn)而闡明天然藥物及中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，需要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，有時(shí)即使有充足的財(cái)力，由于種種原因?qū)嶋H上也難以完成。除了治療消化道系統(tǒng)疾病或某

19、些特殊的成分，通常天然藥物中化學(xué)成分只有吸收人血后才能發(fā)揮藥效。一個(gè)天然藥物中雖然含有數(shù)十個(gè)甚至數(shù)百個(gè)化學(xué)成分，但能吸收入血的成分畢竟有限，如果只研究吸收人血的化學(xué)成分（血清藥化學(xué)）及藥理作用(即血清藥理學(xué))，必將大大簡(jiǎn)化所要研究的成分，而且還可排除那些雖然體外有活性但因其不能吸收人血無法發(fā)揮藥效的偽活性成分的干擾及找出前體活性成分。由于天然藥物中化學(xué)成分的含量相差巨大，多的可達(dá)百分之幾，少的則僅有十萬甚至百萬分之幾；化學(xué)成分與血漿蛋白的結(jié)合率隨成分不同而異；化學(xué)成分吸收人血后會(huì)很快被代謝、分布、排泄，不同時(shí)間檢測(cè)同一種成分含量會(huì)有很大差異；動(dòng)物所用劑量畢竟有限，難于積累到足量樣品；所用的結(jié)構(gòu)

20、測(cè)定方法絕大多數(shù)只能依靠質(zhì)譜如lc-ms等，而用質(zhì)譜測(cè)定化學(xué)結(jié)構(gòu)不但需要對(duì)該天然藥物中的化學(xué)成分要有透徹的了解，而且有時(shí)還需要對(duì)照晶，可靠性也差，所以目前采用血清藥物化學(xué)方法研究天然藥物中生物活性成分的進(jìn)展并不大，從中研究出的一些成分多數(shù)是含量較高的已知成分或其代謝產(chǎn)物。（五）天然藥物中生物活性成分研究需要注意的幾個(gè)問題1從表111可看出，創(chuàng)新藥物的開發(fā)是一個(gè)高技術(shù)、高風(fēng)險(xiǎn)、高投入、高回報(bào)、知識(shí)密集型的系統(tǒng)工程，涉及化學(xué)、藥理、制劑、臨床醫(yī)學(xué)、毒理等多學(xué)科領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計(jì)，開發(fā)成功一個(gè)創(chuàng)新藥物需要篩選1萬甚至數(shù)萬個(gè)化合物，故成功率極低，難度極大，所用時(shí)間約1012年，所需經(jīng)費(fèi)約2億3億美元，但回報(bào)

21、率也很高(一個(gè)大品種的創(chuàng)新藥物其單品種的年銷售額以出廠價(jià)計(jì)則可達(dá)到50余億美元)。這也是世界經(jīng)濟(jì)強(qiáng)國(guó)都對(duì)創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)極為重視的一個(gè)原因。固然由于天然藥物及中藥有數(shù)千年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，從中開發(fā)一些新藥的成本會(huì)相對(duì)較低，成功率較高，所需時(shí)間較短，但也不能認(rèn)為僅對(duì)某一個(gè)天然藥物或中藥的活性成分進(jìn)行研究就可開發(fā)成一個(gè)創(chuàng)新藥物。因?yàn)閯?chuàng)新藥物和一個(gè)具有活性甚至活性很好的天然產(chǎn)物畢竟是兩碼事，作為創(chuàng)新藥物不僅要考慮到它的體內(nèi)藥效，而且還要考慮到它的急性毒性、長(zhǎng)期毒性、臨床藥效、是否易于制成制劑、生物利用度及在體內(nèi)的分布、排泄、原料是否易得成本如何、與現(xiàn)有同類藥物相比有何特點(diǎn)等等多方面的問題。如果其

22、中的活性成分無法開發(fā)成創(chuàng)新藥物，但活性部位又具有開發(fā)價(jià)值，則可考慮將活性部位直接開發(fā)成新藥。無論是開發(fā)創(chuàng)新藥物還是將活性部位開發(fā)成新藥都要投入大量的人力、物力和財(cái)力，故要特別注重知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。一旦獲得具有開發(fā)價(jià)值的活性單體或活性部位，總是要在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)申請(qǐng)專利，求得知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。只有在確保知識(shí)產(chǎn)權(quán)的情況下，才能做大量、長(zhǎng)期、全面的戰(zhàn)略投入，并在研究過程中隨時(shí)分析、調(diào)整開發(fā)計(jì)劃，以求獲得最好效果。2活性測(cè)試方法選擇的正確與否是活性追蹤分離能否取得成功的關(guān)鍵。常用的活性測(cè)試方法有整體動(dòng)物、動(dòng)物的器官、組織、酶、受體以及藥物對(duì)體內(nèi)某些生物活性物質(zhì)的抑制或促進(jìn)等。無疑采用整體動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)與人比較相

23、近，但所需實(shí)驗(yàn)費(fèi)用很大、現(xiàn)象復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，加以動(dòng)物個(gè)體差異以及病理模型難于建立等因素，實(shí)際上用其指導(dǎo)活性追蹤分離難于做到。最好的方法是尋找活性部位時(shí)用整體動(dòng)物試驗(yàn)，追蹤分離成分選用體外的方法。理想的體外活性測(cè)試方法應(yīng)具有簡(jiǎn)易、快速、不需特殊設(shè)備、方便、抗干擾性強(qiáng)、假陽(yáng)性和假陰性均較低、臨床相關(guān)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際工作中理想的活性測(cè)試方法往往很難找到，只有綜合分析考慮，根據(jù)實(shí)際情況、條件以及研究開發(fā)的課題選擇較理想的活性測(cè)試方法。同時(shí)也要根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)積累和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，改進(jìn)現(xiàn)有的一些活性測(cè)試方法和建立一些新的活性測(cè)試方法。由于一個(gè)藥物療效的發(fā)揮并不只取決于它與藥物靶點(diǎn)的作用強(qiáng)弱，還與它的吸收、

24、分布、代謝、排泄、到達(dá)靶點(diǎn)的濃度及持續(xù)時(shí)間、體內(nèi)對(duì)外影響的綜合平衡能力等有關(guān)因素，所以體外活性測(cè)試方法所得結(jié)果與藥物在體內(nèi)實(shí)際作用并不平行。即使是動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)，由于種族的差異以及病理模型與臨床上的實(shí)際病癥并不完全一樣，所以也存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床療效不平行的問題，故在實(shí)踐工作中應(yīng)予以注意。3確保供試材料具有活性是能夠追蹤到活性化合物的前提。在活性追蹤分離之前一定要采用體內(nèi)、體外多種方法，多個(gè)指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行活性測(cè)試，其目的是再次確證實(shí)驗(yàn)材料的活性，確定有無進(jìn)一步研究的價(jià)值；二是為選擇活性追蹤分離所用的活性測(cè)試方法提供依據(jù)。圖113的流程是美國(guó)癌癥研究中心(ncl)用于篩選確認(rèn)植物或動(dòng)物粗提物抗腫

25、瘤活性的改進(jìn)方434天然藥物化學(xué) 案，可供工作時(shí)參考。通過該方案確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)材料至少有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：不至于丟失活性低或含量少的化合物；增加了分離出新化合物的機(jī)會(huì)；有可能分離到具有不同作用機(jī)理或新的作用機(jī)理的化合物。由于植物原材料中所含的化學(xué)成分及活性成分與產(chǎn)地、采收季節(jié)、氣候、品種及放置時(shí)間等有關(guān)，為了保證所用實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)量的穩(wěn)定性，在正式開始活性追蹤分離之前，最好要一次性采集或購(gòu)買到所需的實(shí)驗(yàn)材料，并經(jīng)簡(jiǎn)易的方法再次確認(rèn)活性和一次性提取完畢，將提取物置于冰箱中保存。4天然藥物及中藥在臨床上往往具有多方面的治療作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上具有多方面的活性，在體外實(shí)驗(yàn)中具有多個(gè)作用靶點(diǎn)。研究者應(yīng)當(dāng)從這些雜亂的

26、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象中找出其中最本質(zhì)的作用，選擇建立能反映臨床治療特點(diǎn)且效果與之平行的活性測(cè)試體系才有可能追蹤分離出有開發(fā)價(jià)值的活性成分及先導(dǎo)化合物，表112是這方面工作的一些典型實(shí)例。表112 活性成分及先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)實(shí)例（見p434） 5在分離過程中要按“等劑量不等強(qiáng)度原則”對(duì)每一階段所得組分進(jìn)行活性定量評(píng)估并與母體進(jìn)行比較，追蹤分離活性最強(qiáng)的餾分。通常如與母體比較所得幾個(gè)組分活性強(qiáng)弱參差不齊，則說明活性分離與物質(zhì)分離平行，預(yù)示可能獲得良好的分離效果；如果某個(gè)組分活性顯著增強(qiáng)，則說明在分離過程中可能除去了某種具有拮抗作用的物質(zhì)；如果所得各組分活性均明顯減弱，即使將其合并，其活性與母體相比也大大減弱，則

27、提示活性成分可能發(fā)生分解、破壞或產(chǎn)生了不可逆吸附；如果所得各組分分別測(cè)試其活性雖然明顯降低，但將其合并后其活性與母體相當(dāng)，則提示是活性成分被分散或該藥中的成分存在明顯的協(xié)同作用(相加或相乘)，故分離后反而導(dǎo)致活性的減弱或消失。如附子的水煎劑對(duì)蛙心呈現(xiàn)明顯的強(qiáng)心作用，當(dāng)除去水煎劑中的鈣離子后則對(duì)蛙心的強(qiáng)心作用明顯降低，但單純的鈣離子的作用并沒有附子水煎劑強(qiáng)。經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)附子的水煎劑中存在微量的烏頭堿；雖然烏頭堿本身對(duì)蛙心并不表現(xiàn)多大的強(qiáng)心作用，但微量烏頭堿與鈣離子混合后卻具有明顯的強(qiáng)心作用，其作用強(qiáng)度與附子水煎劑類似，說明其強(qiáng)心作用的有效成分是鈣離子和烏頭堿的混合物，且它們之間存在明顯的協(xié)同作

28、用。以上說明在活性追蹤分離中具體問題應(yīng)作具體分析，并在查明原因后采取相應(yīng)對(duì)策處理。6傳統(tǒng)天然藥物及中藥多為湯劑，從某種意義上來講，只有溶于湯劑中的成分即水溶性成分才是有效成分，但脂溶性成分是否就一定不是有效成分?實(shí)際上未必，其原因有三，一是在煎煮過程中有些本不溶于水的脂溶性成分會(huì)因互溶而溶于湯劑中；二是古人會(huì)用增大劑量的方法提高脂溶性成分的用量，從而達(dá)到防病治病的目的；三是受科技發(fā)展的限制，古人沒有意識(shí)到的并不是不存在的，所以脂溶性成分也可能是天然藥物及中藥的有效成分。（六）活性追蹤分離的幾個(gè)實(shí)例1大黃瀉下活性成分的研究 大黃是蓼科植物掌葉大黃(rheumpalmatuml)、唐古特大黃(rh

29、eumtangutium)或藥用大黃(兄officinale)的干燥根及根莖，具有瀉下通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效。生大黃在臨床上用于術(shù)前清腸和治療便秘具有良好的效果。生大黃粉碎后依次用正己烷、氯仿、丙酮、乙醇、水提取，各提取物以大白鼠口服后觀察其致瀉作用作為活性追蹤指標(biāo)。從表113中可看出正己烷提取物在劑量達(dá)500msks時(shí)仍無效；氯仿提取物和丙酮提取物亦基本上無瀉下作用；乙醇提取物雖有瀉下作用，但較弱，在劑量為loomsks以下時(shí)無效，200m6ks劑量時(shí)，10只大白鼠中只有兩只有效，到500msks的大劑量時(shí)亦只有7只大白鼠有效；而水提取物瀉下作用最強(qiáng)，50msks劑量時(shí)有4只大白鼠有效，200msks時(shí)10只大白鼠全部具有瀉下作用，故其主要活性部位應(yīng)為水提取物。(圖114) 生大黃粉正已烷回流提取3次，