大球蓋菇的分離純化及ITS序列鑒定

1、大球蓋菇的分離純化及 ITS 序列鑒定 大球蓋菇( Stropharia rugosoannulata )別稱酒紅球蓋菇、 皺環(huán)球蓋菇，屬擔(dān)子菌門(mén)( Basidomycota )層菌綱 (HymenomyceteS 傘菌目(Agaricales )球蓋菇科 ( Strophariaceae )球蓋菇屬( Stropharia )，是國(guó)際菇類交易 市場(chǎng)上十大菇類之一，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO向發(fā)展中國(guó) 家推薦栽培的特色食用菌之一 1 。大球蓋菇鮮菇色澤艷麗，肉 質(zhì)脆嫩滑爽，干品氣味清香，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的食用價(jià)值和 藥用價(jià)值，頗受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，具有非常廣闊的發(fā)展前景。 大球蓋菇的栽培管理

2、較為粗放，對(duì)其冬閑田露地栽培 2 、大棚 反季節(jié)栽培 3 、畦式栽培、層架式栽培、地坑式栽培等 4 多種 栽培模式進(jìn)行深入研究，對(duì)利用稻草、玉米秸稈、菌渣等不同栽 培料栽培大球蓋菇也進(jìn)行多樣化比較 5-8 ，取得了豐富的研究 成果，但關(guān)于大球蓋菇母種的獲得、 液體培養(yǎng)基配方的篩選以及 如何對(duì)菌種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定還未見(jiàn)報(bào)道。 ITS( internal transcribed spacer )是核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)， 包括 ITS1 和 ITS2 兩部分，連同二者中間的 5.8S rDNA 基因組成 ITS1-5.8S-ITS2 結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于真菌菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、條形碼和群體多 樣性研究 9

3、。本研究對(duì)采自吉林長(zhǎng)白山地區(qū)的野生大球蓋菇進(jìn) 行組織分離，獲取母種，篩選最適合液體菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方， 并對(duì)子實(shí)體和分離菌株的 ITS 序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)， 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹(shù)，旨在從分子水平上對(duì)大球蓋菇進(jìn)行鑒定， 進(jìn)而為大球蓋菇的 開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 大球蓋菇子實(shí)體于 2015 年 9 月采自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)。 1.2 試驗(yàn)方法 1.2.1培養(yǎng)基的制備 研究使用的分離培養(yǎng)基為 PDA培養(yǎng) 基，培養(yǎng)基制作方法如下：將馬鈴薯洗凈去皮，用電子天平稱取 200 g 切成 1 cm3 的小塊，用紗布包好后放入 1 000 mL 水中煮 沸；待馬鈴薯塊軟化后撈出，加入葡

4、萄糖20 g，瓊脂15 g，再 次煮沸，加水補(bǔ)足 1 000 mL ；再用雙層紗布過(guò)濾，倒入錐形瓶 內(nèi)；將瓶口用封口膜封好后，用高壓滅菌鍋 121 C滅菌20 min； 滅菌結(jié)束后， 待培養(yǎng)基溫度降至不燙手但未凝固時(shí)， 在超凈工作 臺(tái)內(nèi)，定量倒入直徑為 8 cm的培養(yǎng)皿中，裝液量為 20 mL,凝 固后備用。 1.2.2 子實(shí)體晾曬時(shí)間對(duì)分離的影響 以剛采集到的部分野 生大球蓋菇新鮮子實(shí)體作為對(duì)照， 將大球蓋菇放置在充足陽(yáng)光下 晾曬，晾曬時(shí)間為10: 0015: 00,分別取晾曬1、2、3、4、5 h的子實(shí)體和新鮮子實(shí)體進(jìn)行組織分離。將菌蓋從中間撕開(kāi)，挑 取0.3 cm大小的菌肉組織接于 PD

5、A平板培養(yǎng)基中心部位，每個(gè) 平板接 1 塊菌肉,蓋蓋后用封口膜封好,每組設(shè)置 10 個(gè)重復(fù), 放置在25 C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察菌肉組織的萌發(fā)、 污染以及菌絲生長(zhǎng)情況 1.2.3 子實(shí)體不同部位對(duì)分離的影響 將分離要使用的解剖 刀、鑷子、封口膜以及PDA平板放入超凈工作臺(tái)中進(jìn)行紫外滅菌。 將大球蓋菇經(jīng)處理后分離效果最好的子實(shí)體，用75%乙醇擦拭表 面23遍，用無(wú)菌的解剖刀在菌蓋頂部中間劃口，用手撕開(kāi)， 注意避免手接觸到內(nèi)部的菌肉。 用解剖刀分別在子實(shí)體菌蓋、 菌 蓋與菌柄交接處、 菌柄上端和菌柄基部劃取一小塊組織， 用無(wú)菌 鑷子夾起，迅速放置于制備好的 PDA平板培養(yǎng)基中心處，每個(gè)平

6、 板接1塊組織，每組設(shè)置10個(gè)重復(fù)，封口膜封口后置于 25 C 恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 每天觀察并記錄組織體的萌發(fā)情況、 污 染情況和菌絲生長(zhǎng)情況。 1.2.4 液體培養(yǎng)基的制備 研究共采用 5 種液體培養(yǎng)基研究 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，各培養(yǎng)基制作方法如下。 （1 ）基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1。將馬鈴薯洗凈去皮，稱取 300 g, 切成 1 cm3 小塊，用紗布包好后放入 1 500 mL 水中煮沸；待馬 鈴薯塊軟化后撈出，加入 30 g葡萄糖、1.5 g KH2PO4和0.75 g MgSO，4 再次煮沸；加水補(bǔ)足 1 500 mL ，再用雙層紗布過(guò)濾，倒 入500 mL錐形瓶?jī)?nèi)，每個(gè)錐形瓶分裝

7、300 mL液體培養(yǎng)基；封口 膜封口后，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121 C滅菌30 min以備用。（2） 加富液體培養(yǎng)基A2。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基 A1+15 g蛋白胨。（3）加 富液體培養(yǎng)基A3?；A(chǔ)液體培養(yǎng)基 A1+15 g尿素。（4）加富液 體培養(yǎng)基A4。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基 A1+15 g酵母膏。（5）加富液體 培養(yǎng)基A5o基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基 A1+15 g硫酸銨。 1.2.5 不同液體培養(yǎng)基配方對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 1.2.5.1 菌塊培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng) 將由同一子實(shí)體 的同一部位分離獲得的母種進(jìn)行擴(kuò)繁，接種于新的PDA平板培養(yǎng) 基中心，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板培養(yǎng)基后，用直徑為5 mm滅過(guò)菌 的打孔器在距平

8、板中心接種點(diǎn) 3 cm 處打孔，將菌齡一致的菌塊 轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，每瓶液體培養(yǎng)基接入菌塊10 塊，每個(gè)配 方設(shè)置 5 個(gè)重復(fù)。將接入菌塊的液體培養(yǎng)基錐形瓶放入恒溫振蕩 器內(nèi)，在25 C、130 r/min的條件下培養(yǎng)10 d，觀察菌絲球形 態(tài)。125.2 生物量的測(cè)定 取50 mL液體菌種，2 000 g 離心 20 min ，去上清；菌絲體沉淀經(jīng)蒸餾水充分洗滌后，濾紙 過(guò)濾；待濾液無(wú)色透明后收集菌絲體，80 C真空干燥至恒質(zhì)量， 電子天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量。計(jì)算公式為： 菌絲體生物量（g/L ）=菌絲體干質(zhì)量（g） 0.05 （L） X 1 000。 1.2.5.3 菌絲球密度的測(cè)定 將培養(yǎng)至

9、10 d 的液體菌種搖勻 后，用移液器吸取1 mL的菌液，加入9 mL的無(wú)菌水中，稀釋 10 倍，測(cè)定菌絲球個(gè)數(shù)。 1.2.6 DNA 的提取 采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒 （天根）分別對(duì)大球蓋菇的子實(shí)體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進(jìn)行 基因組DNA提取。將大球蓋菇子實(shí)體撕開(kāi)用滅過(guò)菌的鑷子夾取 內(nèi)部完好的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨；菌絲體采用 錐形瓶中的液體菌種，經(jīng)紗布過(guò)濾后，用無(wú)菌水沖洗35遍， 將菌絲擰干，取適量放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟 參照說(shuō)明書(shū)。 1.2.7 ITS 序列的擴(kuò)增 采用通用引物 ITS1 和 ITS4 (ITS1 ： 5 -TCCGTAGGT-

10、GAACCTGCGG-ITS4: 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-用于 rDNAITS 區(qū)段的 PCR 擴(kuò) 增10。擴(kuò)增體系為50卩L,其中35.5卩L去離子水，5 L 10X PCR buffer , 4 卩 L dNTPs (2.5 mmol/L ), ITS1/ITS4 弓I 物各2卩L, 0.5卩L Taq DNA酶(5 U/卩L), 1卩L模板DNA (濃度2050 mg/L) o PCR反應(yīng)條件：95 C預(yù)變性5 min; 94 C 變性30 s, 55 C退火30 s, 72 C延伸40 s, 35個(gè)循環(huán)；72 C 反應(yīng)7 min。PCF擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢

11、測(cè)后4 C保存。 1.2.8 ITS 序列的測(cè)序與分析 為了保證測(cè)序的準(zhǔn)確率， PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用正反向弓物雙向測(cè)序， 測(cè)序由哈爾濱博仕 生物技術(shù)XX公司完成。 將測(cè)序結(jié)果在NCBI中作BlastN比對(duì)，找出并下載 90%相目 似性序列， 用 ClustalX2.1 的 Alignment 程序?qū)λ型葱蛄羞M(jìn) 行多重對(duì)位排列。用 MEGA5.02 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹(shù) 的構(gòu)建。用 Kimura2-parameter 模式計(jì)算遺傳距離，所有對(duì)位 排列結(jié)果中的空位(gaps)或缺失數(shù)據(jù)(missing data )作完全 刪除( complete deletion )處理，進(jìn)化

12、距離分析采用鄰位相連 法( NJ， neighbor-joining )。系統(tǒng)樹(shù)每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 分析以自展法( bootstrap )進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為 1 000 次。 2 結(jié)果與分析 2.1 子實(shí)體晾曬時(shí)間對(duì)分離的影響 由表 1 可知，分離新鮮子實(shí)體污染率達(dá)到了 30%，而經(jīng)過(guò)晾 曬1 h，污染率降低至10%晾曬25 h，污染率降為0。晾曬 時(shí)間越長(zhǎng)，萌發(fā)越慢，新鮮子實(shí)體和晾曬12 h的子實(shí)體分離 時(shí)，萌發(fā)最快，只需2 d;晾曬5 h時(shí)，分離的菌肉組織不萌發(fā)。 晾曬時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)越慢，晾曬 2 h 的子實(shí)體分離后，菌絲 生長(zhǎng)速度最快，為8.0 mm/d，但與新鮮子實(shí)體和晾曬

13、1 h的子 實(shí)體差別不大。新鮮子實(shí)體和晾曬 12 h 的子實(shí)體，菌絲生長(zhǎng) 濃密，長(zhǎng)勢(shì)旺盛;但晾曬 3 h 之后，菌絲變得稀疏，長(zhǎng)勢(shì)較弱。 綜上所述，采用晾曬 2 h 的大球蓋菇子實(shí)體進(jìn)行分離，既能有效 地降低污染率，又不影響萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)。 2.2 子實(shí)體不同部位對(duì)分離的影響 從表 2 可以看出，大球蓋菇子實(shí)體菌蓋與菌柄交接處分離 后，菌絲的生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到8.9 mm/d其次是菌柄上端（8.5 mm/c）和菌蓋（8.0 mm/d ）;菌柄基部最慢，僅為 7.4 mm/d 。 除菌柄基部外， 其他 3 個(gè)部位菌絲的長(zhǎng)勢(shì)都很濃密旺盛； 菌柄基 部的污染率達(dá)到了 10%，其他 3 個(gè)部位污染率

14、則為 0。綜合分析， 菌蓋與菌柄交接處為最佳分離部位。 2.3 不同液體培養(yǎng)基配方對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 如表 3 所示，不同的液體培養(yǎng)基配方上生長(zhǎng)的菌絲存在很大 差異。A2的菌絲體生物量（6.8 g/L ）和菌絲球密度（138個(gè)/mL） 均明顯高于其他4組培養(yǎng)基；其次為 A4培養(yǎng)基，菌絲體生物量 為5.5 g/L，菌絲球密度為109個(gè)/mL; A3的菌絲體生物量和菌 絲球密度則最小，分別為 3.7 g/L、65個(gè)/mL。A2和A4配方的 菌?z球如小米粒大小，呈圓球狀，大小均一，菌液稠密；其他3 組配方的菌絲球都如綠豆粒大小，呈刺球狀，其中 A1 配方的菌 絲球大小均一，菌液濃度較稠密；而A3和A

15、5配方的菌絲球大小 不均一，菌液濃度較稀疏。綜上分析，采用A2培養(yǎng)大球蓋菇菌 絲體最佳，其次為 A4培養(yǎng)基。 2.4 ITS區(qū)段的PCR產(chǎn)物及測(cè)序 對(duì)大球蓋菇子實(shí)體及分離培養(yǎng)得到的菌絲進(jìn)行DNA提取，并 以提取的DNA為模板進(jìn)行PCRT增，PCFT物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)后，得到如圖 1 所示的特異性條帶。由圖 1 可以看出， S1 與S2片段大小一致，約為650 bp，與測(cè)序得到的基因片段長(zhǎng)度 S1 （649 bp）和S2 （ 654 bp）大小相符，并且 S1與S2有99% 的同源性。由此可以初步判定，菌絲體 S2 為大球蓋菇子實(shí)體 S1 的純培養(yǎng)菌絲體。 2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 在NC

16、BI中進(jìn)行BLASTN:匕對(duì)，找至U 12條與S2相似性90% 的序列并下載， 用 ClustalX2.1 軟件進(jìn)行序列比對(duì)， 并輔以人工 修正。以靈芝（ Ganoderma lucidum ）作為外參，基于來(lái)自 NCBI 中的 12 個(gè)種的 ITS 序列，連同試驗(yàn)中的 ITS 序列共 14 條序列 一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用 MEG/5.02中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系 統(tǒng)樹(shù)。從圖 2 可以看出， S2 與球蓋菇屬大球蓋菇( Stropharia rugosoannulata )系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。 3 結(jié)論與討論 對(duì)于野生食用菌的人工馴化， 首先須要獲得純化菌種， 常見(jiàn) 的菌種分離方法有組織分離法

17、、孢子分離法和基內(nèi)菌絲分離法， 其中組織分離法因簡(jiǎn)單、 易操作且純化率高， 在實(shí)踐中被廣泛地 應(yīng)用 11 。本試驗(yàn)采用組織分離法對(duì)野生大球蓋菇進(jìn)行分離， 試 驗(yàn)結(jié)果表明， 野生大球蓋菇能夠成功分離獲得母種， 并且子實(shí)體 經(jīng) 2 h 的晾曬，既能有效降低污染率，又不影響萌發(fā)和菌絲的生 長(zhǎng)，而長(zhǎng)時(shí)間的晾曬則會(huì)嚴(yán)重抑制菌絲的萌發(fā)和生長(zhǎng)。 可能是經(jīng) 過(guò)適宜時(shí)間的晾曬， 子實(shí)體水分減少?gòu)亩鴾p少了細(xì)菌污染， 再加 上陽(yáng)光中的紫外線具有殺菌功能， 進(jìn)一步降低污染， 但長(zhǎng)時(shí)間晾 曬使子實(shí)體脫水， 菌絲體細(xì)胞活力減弱甚至死亡， 從而影響分離 效果。大球蓋菇最佳的分離部位是菌蓋與菌柄交接處， 該部位分 離的菌絲生長(zhǎng)速度快， 長(zhǎng)勢(shì)旺盛且污染率低， 可能的原因是該部 位是子實(shí)體的生長(zhǎng)點(diǎn)，菌絲體細(xì)胞活力強(qiáng)，分裂速度快，且該部 位與空氣接觸少，雜菌少。在食用菌工廠化生產(chǎn)中，液體菌種因 其生產(chǎn)周期短、菌齡一致、菌種生產(chǎn)成本低、接種簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)， 得到了十分廣泛的應(yīng)用 12 。本試驗(yàn)篩選出最適宜的液體培養(yǎng)基 配方為A2,即基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基 A1+蛋白胨15 g，采用此配方培 養(yǎng)的液體菌種，菌絲體生物量高