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1、外周血單核細胞分離 技術(shù) 本頁僅作為文檔封面，使用時可以刪除 This document is for reference only-rar21 year.March 人外周血單核細胞分離 1 抗凝血的預(yù)離心分別取正常人新鮮抗凝全血 A: 20 mL J 50 mL離心管中,以2 000 r/min離心20 min吸棄上層血漿,獲得下層 沉淀細胞約1012.5 mL。 2. 沉淀細胞的稀釋與離心分離在所獲取沉淀 A中的細胞中加入Hank s液（不含Ca?+、Mg2+, pH 7.27.6）體積比仍未1:1,混勻， 制成細胞懸液。 B:無菌抗凝血與Hank s液或PBS以1:1體積在試管中混勻。

2、 另取一離心管，加入LTS1077淋巴細胞分層液，然后用毛細吸管距分層液上icm處將 細胞懸液小心而緩慢地加于其上面，使稀釋血液重疊于分層液上。此時稀釋后的細胞懸液 分離液淋巴細胞體積為：1:1-與用水平離心機以2000 r/min離心20min,離心結(jié)束后，取 出離心管，可見管中液體已經(jīng)分層。 管內(nèi)可見分為4層：最上層是血漿，含部分血小板：第二層為薄薄的白膜層，主要臺 單個核細胞，還混雜有少疑血小板：第三層為分離液層；第四層為粒細胞及紅細胞，紅細 胞沉于管底，而粒細胞則緊貼在壓積紅細胞上呈一層很薄的白膜 3. 單個核細胞的提取、洗滌與懸浮、貼壁 吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細胞分藹液交

3、界而的單個核細胞，盡量全部吸 出PBMCo加34倍以上體積Hanks或PBS液于所得的單個核細胞中，用毛細吸管輕輕吹 判均勻，避免產(chǎn)小氣泡，液柱高度不超過離心管的2/3o混勻后離心1500r/min離心 lOmin,低速離心有利于去除細胞懸液中留存的血小板，去上淸液。 注意：還可以先用吸管把霧狀層上而的液體吸走，注意不要碰到霧狀層，然后在把要的部 分慢慢吸岀來。第二種方法，比較簡單一些。 再用同樣洗滌液洗滌細胞2次，1500r/min離心lOmin,洗去殘留的淋巴細胞分離 液。再以RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌2次，吸盡上淸，以充分去除血小板等雜質(zhì)。按每亳 升血液標(biāo)本加0.2 mL含20%小牛血淸的Hank s液（或含10%胎牛血淸及25 mmol/L hepas 的RPMI-1640液34 mL）重新混懸細胞37C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)23 h后去除上淸, 得到貼壁的單核細胞。于各培瓶中分別加入含10%胎牛血淸的RPMI-1640液34 mL,按 需調(diào)左細胞密度，于37C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)備用。 4. 單核細胞的純度與細胞活力的鑒左 取一泄體積的細胞懸液送做流式細胞CD14. CD56等檢査以測左所得細胞的純度。取 1滴細胞懸液登于血細胞汁數(shù)板內(nèi)計數(shù)。以臺盼藍拒染法檢測細胞活力。取1

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