真核細(xì)胞表達系統(tǒng)[1]（干貨分享）

1、真核細(xì)胞表達系統(tǒng)自上世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來,基因表達技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。并隨著人類基因組計劃實施的進行,在技術(shù)方法上得到了很大發(fā)展，時至今日已取得令人矚目的成就 .隨著人類基因組計劃的完成,越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明。利用表達系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌),通過IPG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲

2、得基因表達產(chǎn)物,而且所需的成本相對比較低廉.但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控,有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,過量表達可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達,導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善,表達產(chǎn)物的生物活性較低.為克服上述不足,許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是：根據(jù)原核生物蛋白與靶DN間作用的高度特異性設(shè)計,而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制;能誘導(dǎo)基因高效表達，可達10倍,為其他系統(tǒng)所不及；能嚴(yán)格調(diào)控基因表達

3、,即不僅可控制基因表達的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達量。因此,利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)。1、酵母表達系統(tǒng) 最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母,后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達系統(tǒng).目前甲醇酵母主要有H Polymorph，Canida Boii,Pa Pasis3種。以Pih Pstris應(yīng)用最多。.感謝聆聽.甲醇酵母的表達載體為整合型質(zhì)粒,載體中含有與酵母染色體中同源的序列,因而比較容易整合入酵母染色體中

4、。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一（0x1),在該基因的啟動子（PAXOI）作用下,外源基因得以表達.PXOI是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AO1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時AOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達,將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達載體都為Ecli/ihia storis的穿梭載體,其中含有E。cl復(fù)制起點和篩選標(biāo)志,可在獲得克隆后采用oli細(xì)胞大量擴增目前,將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生

5、長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達克級.與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細(xì)胞，不會發(fā)生超糖基化。.感謝聆聽.利用PAXOI表達外源蛋白時,一般需很長時間才能達到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產(chǎn)品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、X8、YI等多種.利用三磷酸甘油醛脫氫酶（GP)啟動子代替PAOI，不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng)過程中無需更換碳源，操作更為簡便，可縮短外源蛋白到達峰值水平的時間。 .感謝聆聽.酵母表達系

6、統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。2、昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng) 桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒（AcV）作為表達載體。在cNP感染昆蟲細(xì)胞的后期,核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆?？尚纬砂w。核多角體基因啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力，故常被用來構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒?？寺∪胪庠椿虻膫鬟f質(zhì)粒與野生型AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞,因而在感染細(xì)胞中不能形成包涵體，利用這一特點可挑選 出含重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞但效率比較低,

7、且載體構(gòu)建時間長，一般需要46周。此外,昆蟲細(xì)胞不能表達帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。.感謝聆聽.在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達引起昆蟲細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，與 目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難,科學(xué)工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie1基因啟動子表達外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括個調(diào)節(jié)外源蛋白表達序列：.感謝聆聽.（)Bobyx mri的肌動蛋白基因啟動子;（2）Bobyx oi的核型多角體病毒（BmPV）的立早基因ie-1

8、(編碼俄IE-1蛋白,該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動蛋白基因啟動子)；(）BmNPV的同源重復(fù)序列3（HR3）可作為肌動蛋白基因啟動子的增強子。三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高 10倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒（HyPV)被應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)的構(gòu)建,該病毒由cNP及 BniP發(fā)展而來。 一般情況下桿狀病毒表達系統(tǒng)所能表達的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行加工才能被分泌至

9、胞外。如果到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前,前體多肽就伸展開來，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚,這對最終的表達水平有很大影響.而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行加工，從而提高蛋白的分泌水平. .感謝聆聽.最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞,以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細(xì)胞(如 sf9、f21）中復(fù)制，不能在其他昆蟲細(xì)胞（如果蠅細(xì)胞)中復(fù)制,然而目前研究表明在一定條件下,桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒2表達系統(tǒng)的表達載體利用的

10、是果蠅啟動子如7啟動子、肌動蛋白5啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等,其中,sp啟動子的作用最強.重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒2系統(tǒng)是一個很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)。昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng),特別是桿狀病毒表達系統(tǒng)由于其操作安全,表達量高,目前與酵母表達系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個領(lǐng)域中.感謝聆聽.3、哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng) 由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì),在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動物細(xì)胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷

11、酸信號等。將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞主要通過2類方法 :一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法 、磷酸鈣共沉淀法及DEA一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。外源基因的體外表達一般采用質(zhì)粒表達載體,如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入HO細(xì)胞可建立高效穩(wěn)定的表達系統(tǒng),而利用CS細(xì)胞可建立瞬時表達系統(tǒng).目前,病毒載體已成為動物體內(nèi)表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當(dāng)大(約187kb），利用它作為載體可同時插入幾種外源基因,從而構(gòu)建多價疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高,某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄

12、病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體,具有潛在的危險性. .感謝聆聽.由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很低,利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過CreaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入laxP位點,然后將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達Ce重組酶的哺乳動物細(xì)胞,通過C介導(dǎo)兩個laP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒,這種重組效率比

13、一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細(xì)胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細(xì)胞中不會引起病毒基因的表達,而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉(zhuǎn)移為我們提供了很好的途徑。 .感謝聆聽.利用哺乳動物細(xì)胞表達外源基因時,大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo),但當(dāng)表達產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性時應(yīng)采取誘導(dǎo),這樣可避免表達產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對細(xì)胞產(chǎn)生影響。哺乳動物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動子有關(guān)如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達特異性差;當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時表達有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒

14、性,常對細(xì)胞造成損傷等。.感謝聆聽.為此，Gosse等構(gòu)建了受四環(huán)素負(fù)調(diào)節(jié)的Teto基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子（fA）的序列，在沒有四環(huán)素或強力毒素存在的情況下 tTA可引起下游目的基因表達.隨后Gosse等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Teton基因表達系統(tǒng),該系統(tǒng)在沒有四環(huán)素的情況下啟動子不被激活,而在加入四環(huán)素或強力毒素后目的基因高效表達。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物細(xì)胞誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強的優(yōu)點。.感謝聆聽.外源蛋白的表達會對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動

15、物細(xì)胞表達外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達。Mieke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動物中穩(wěn)定表達異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順反子RN。內(nèi)部的順反子通過內(nèi)核糖體進入位點（IREs）介導(dǎo)進行翻譯，通過持續(xù)選擇壓力，無需繁瑣的篩選過程,便可獲得持久、穩(wěn)定表達抗體分子的重組體。.感謝聆聽.哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有H、COS、BH、P2/、IH33等,不同的宿主細(xì)胞對蛋白表達水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響,因此在選擇宿主細(xì)胞時應(yīng)根據(jù)具體情況而定。 利用基因工程技術(shù)表達外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的

16、實際應(yīng)用.通過轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì),但目前這項技術(shù)還不很成熟，有待進一步研究。 、結(jié)語目前已經(jīng)建立了多種誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，但它們都有其優(yōu)點和不足,這就需要我們根據(jù)自己的要求選用適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)。一般來說,一個理想的可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)需要符合下述幾個方面的要求。特異性:該系統(tǒng)不受其他內(nèi)源因素的影響，僅能被外源的非毒性藥物所活化.非干擾性：該系統(tǒng)成分不能對細(xì)胞通路有干擾?？烧T導(dǎo)性:該系統(tǒng)在非活化狀態(tài)下本底活性最低，而在活化狀態(tài)下能快速產(chǎn)生高水平的基因表達。誘導(dǎo)劑的生物利用率：調(diào)節(jié)分子能快速滲透人各組織,能通過胎盤屏障及血腦屏障?？赡嫘裕赫T

17、導(dǎo)劑能快速被各組織清除使該系統(tǒng)很快恢復(fù)非活化狀態(tài)。劑量依賴性：該系統(tǒng)的反應(yīng)與誘導(dǎo)劑的濃度成正比,以便進行定性定量分析?？傊?各種表達系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點，酵母和昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)蛋白表達水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與哺乳動物細(xì)胞不完全相同;哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達量低、操作繁瑣。各種表達系統(tǒng)由于翻譯后的加工不完全相同，因而產(chǎn)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時會有差別.Va d GId等利用不同的表達系統(tǒng)表達了蛋白激酶（P0），并對它們的抗原性進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中表達的P具有與抗R抗體結(jié)合的所有表位，在昆蟲細(xì)胞中表達的R具有大部分表位,而在

18、 甲醇酵母中表達的PR3只具有少數(shù)幾個表位。因此，選擇表達系統(tǒng)時，必須充分考慮各種因素，如所需表達的蛋白質(zhì)性質(zhì)、實驗條件、生產(chǎn)成本、表達水平、安全性等,權(quán)衡利弊后再選擇相應(yīng)的表達系統(tǒng)。.感謝聆聽.隨著人類基因組計劃的完成,越來越多的基因被發(fā)現(xiàn),其中多數(shù)基因功能不明。利用表達系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，因此，組成型表達系統(tǒng)的應(yīng)用受到一定限制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展使我們可以在體內(nèi)更有效地研究基因的功能，由于大部分基因在體內(nèi)都是在

19、特定組織或特定發(fā)育階段表達的，要想有效研究這些特定基因的作用，就需要在特定的時間以適當(dāng)?shù)谋磉_水平實現(xiàn)目的基因的表達.感謝聆聽.誘導(dǎo)表達系統(tǒng)可以在時空上控制目的基因的表達,這對認(rèn)識基因在生長發(fā)育、生理活動及其病理過程中的作用具有重要意義。較早的誘導(dǎo)表達系統(tǒng)通常采用哺乳動物本身的基因表達調(diào)控元件,雖然用誘導(dǎo)劑可以控制目的基因的表達,但由于誘導(dǎo)劑在細(xì)胞內(nèi)還控制其他的靶基因，這可能會嚴(yán)重干擾對目的基因的研究,產(chǎn)生假陽性或假陰性實驗結(jié)果。為了解決這一問題，一些生物學(xué)家利用非哺乳動物的基因表達調(diào)控元件或不再對響應(yīng)內(nèi)源誘導(dǎo)劑的突變型內(nèi)源表達調(diào)控元件建立了一些可誘導(dǎo)表達系統(tǒng).目前比較成熟的誘導(dǎo)表達系統(tǒng)主要有4

20、種:四環(huán)素誘導(dǎo)表達系統(tǒng),蛻皮激素（cyson）誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，他克莫司（tacrolims，K06）/雷帕霉素（ramycin）誘導(dǎo)系統(tǒng)和RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)。.感謝聆聽.1、四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)（etacyclin inucible sytem）是由osen及Bud首先建立的,該系統(tǒng)采用細(xì)菌的四環(huán)素抗性操縱子，因為它完全是來源于原核細(xì)胞,因此有較好的特異性。此系統(tǒng)的作用依賴于四環(huán)素調(diào)控的反式作用因子(tTATA)和反式作用因子依賴的啟動子兩個成分。四環(huán)素反式激活蛋白(tT)是一個包含大腸桿菌TN10四環(huán)素耐藥操縱子阻遏物和單純皰疹病毒p16蛋白（P6)C端部分的融合蛋白,tTA依賴啟動子

21、由融合有RNA聚合酶啟動子的四環(huán)素操縱子(tetO）基因序列構(gòu)成,這種融合使真核細(xì)胞中的tet阻遏物成為很強的翻譯激活物.在缺乏四環(huán)素及其衍生物的條件下tA與etO序列結(jié)合,使tTA依賴啟動子的轉(zhuǎn)錄過程被激活；而在存在四環(huán)素及其衍生物的條件下,tTA無法與其靶位點相互作用，轉(zhuǎn)錄也就無法進行;tet系統(tǒng)中TA的作用稱為eOF。后來Goen等又構(gòu)建了反式tTA（rtTA)，它是一種突變形式的tA,包含突變形式的蛋白teR。與tTA作用相反，這種rtTA只有在四環(huán)素及其衍生物的作用下才能與DA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。如果沒有藥物刺激，就不表達目的基因,因此-A的作用稱tet-ON。這兩種蛋白在組織培養(yǎng)、果蠅

22、及轉(zhuǎn)基因小鼠中都被證明能有效調(diào)控外源基因的表達。Pado等成功的應(yīng)用eF系統(tǒng)證實LZF（早幼粒細(xì)胞白血病鋅指）基因在淋巴細(xì)胞中表達具有抗凋亡作用。hodes等應(yīng)用四環(huán)素可誘導(dǎo)系統(tǒng)成功建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為研究AML1ET在白血病發(fā)生中的作用奠定了堅實的基礎(chǔ).感謝聆聽.四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)基因動物中被廣泛用來研究基因的功能,但它有一個顯著的缺點，即只有篩選大量的克隆或動物才能得到有較低表達背景而目的基因能顯著激活的理想克隆或轉(zhuǎn)基因品系。解決這一問題的一個策略是把此系統(tǒng)的各元件構(gòu)建到同一個載體上，這樣只需一次轉(zhuǎn)染就可以使基因的轉(zhuǎn)錄得到調(diào)控。逆轉(zhuǎn)錄病毒把基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的能力比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效

23、得多，Bol等7就通過使用簡化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體取得了理想的結(jié)果。.感謝聆聽.針對rtTA有本底表達的缺陷又產(chǎn)生了幾種改進的系統(tǒng).tTR是一種改進的tetO的抑制物,當(dāng)它與rtTA共同表達時，若無四環(huán)素及其衍生物就與etO結(jié)合從而抑制rtT的本底表達，而在四環(huán)素等的作用下，T不能與DNA結(jié)合而由rtTA占據(jù)tO位點，因此目的基因的表達被高效激活。.感謝聆聽.2、蛻皮激素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)蛻皮激素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)是基于昆蟲蛻皮激素通過蛻皮激素受體激活基因表達的能力而設(shè)計的。該系統(tǒng)使用蛻皮激素受體與果蠅超螺旋蛋白（ltrasiralepotein，US）的異源二聚體，加入蛻皮激素或合成的類似物幕黎甾酮A（mu

24、rieron)后，蛻皮激素與其受體結(jié)合，蛻皮激素受體就與US發(fā)生相互作用,進而與NA上的反應(yīng)元件結(jié)合，最終啟動下游目的基因的轉(zhuǎn)錄.由于哺乳動物細(xì)胞對蛻皮激素(或幕黎甾酮A）沒有反應(yīng)性,也不含蛻皮激素受體,所以本底轉(zhuǎn)錄水平非常低.這種誘導(dǎo)系統(tǒng)在幕黎甾酮A作用下可得到100150倍的高表達.后來又發(fā)展為一種改進的蛻皮激素系統(tǒng),這一系統(tǒng)把蛻皮激素受體突變體含依托泊苷(VP)的反式激活結(jié)構(gòu)域與UP的哺乳動物類似物類視黃醇X(XR)融合在一起。由于蛻皮激素受體的DA結(jié)合位點也可以被人類受體(類法尼醇受體)識別，上述系統(tǒng)改變了NA結(jié)合位點的序列，使它只能被突變的蛻皮激素受體識別,這就避免了內(nèi)在激素的影響,

25、極大地降低了本底表達，在培養(yǎng)的細(xì)胞系中甚至可得到比本底高00倍的誘導(dǎo)水平。在小鼠腹膜內(nèi)注射幕黎甾酮A6h后,也檢測到基因得到相當(dāng)高水平的表達.幕黎甾酮A沒有毒性也沒有致畸性，而且和蛻皮激素一樣可在注射后20h以內(nèi)完全排泄，因此這一系統(tǒng)是進行轉(zhuǎn)基因動物實驗的一個理想工具,在基因治療方面也很有前景.若在這一系統(tǒng)上用一個組織特異的啟動子代替CM啟動子，就可使目的基因只能在特定的組織或細(xì)胞中誘導(dǎo)表達,這對在轉(zhuǎn)基因動物的特定組織中研究靶基因的功能非常有用。Xio等就用骨骼肌的-肌動蛋白啟動子代替了CMV啟動子,他們用改造的可誘導(dǎo)系統(tǒng)建立穩(wěn)定細(xì)胞株，研究發(fā)現(xiàn)在分化成熟的肌細(xì)胞中可誘導(dǎo)報導(dǎo)基因的表達,而在未

26、分化的肌細(xì)胞中則沒有表達.toao等13通過蛻皮激素可誘導(dǎo)系統(tǒng)證實PTE可抑制PI3K通路，從而闡明了PTEN抑制腫瘤的機制。.感謝聆聽.3、他克莫司（F6)雷帕霉素（apamycin)誘導(dǎo)系統(tǒng)環(huán)孢素A受體和親免素(FK2rycn相關(guān)蛋白，F(xiàn)RA）蛋白家族以及他克莫司（acolm,FK506）結(jié)合蛋白（s)都含有化學(xué)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)能與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和反式激活結(jié)構(gòu)域相融合。而免疫抑制劑K506、雷帕霉素和環(huán)孢素A(A）等小分子化學(xué)誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)這些嵌合轉(zhuǎn)錄因子的二聚化，從而強烈刺激報告基因的表達。因此在不影響正常細(xì)胞生理過程的情況下,就可以通過誘導(dǎo)二聚體的小分子藥物的濃度以劑量應(yīng)答的方式調(diào)

27、控靶基因的表達水平.感謝聆聽.為了能用于基因治療,又對這一系統(tǒng)進行了一系列人源化的改進，如轉(zhuǎn)錄激活因子的非人源部分用一般認(rèn)為無免疫性的成分取代，GA4部分則由嵌合的A結(jié)合結(jié)構(gòu)域FHD替代,VP1激活結(jié)構(gòu)域可以用NFBp65的激活結(jié)構(gòu)域代替，最后親環(huán)蛋白由FB1雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（FB）取代，而不用人源的FKP12雷帕霉素結(jié)合蛋白激酶(FAP)。FRBFBP12的異源二聚體可以被雷帕霉素(比FKCs更有效）高效誘導(dǎo)，從而形成有功能的完整轉(zhuǎn)錄因子，最終啟動轉(zhuǎn)錄。這一系統(tǒng)在體外和體內(nèi)實驗中背景表達都比較低，而在雷帕霉素的刺激下有高水平的表達。雷帕霉素可以與FR激酶結(jié)合，而FR可以介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng),因

28、此雷帕霉素有一定的增殖和免疫抑制活性,這成為該系統(tǒng)應(yīng)用的一個潛在限制。這一問題通過選用雷帕霉素的類似物得到了解決,此類似物與野生型FR激酶的結(jié)合能力較差，因此不會產(chǎn)生免疫抑制,在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)此類似物也不抑制細(xì)胞的增殖。.感謝聆聽.最近,利用雷帕霉素誘導(dǎo)的人源化系統(tǒng)（rapmciniduihuazedsystm，IS),通過腺相關(guān)病毒（aeno-ssociatedvirus，AV)轉(zhuǎn)染小鼠和非人靈長類動物來表達鼠紅細(xì)胞生成素，實驗表明可以通過控制雷帕霉素的劑量調(diào)控體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達.感謝聆聽.4、 R486誘導(dǎo)系統(tǒng)這一系統(tǒng)采用截短的黃體酮受體的突變體,這種突變體不能和黃體酮或其他內(nèi)源類固醇激素結(jié)合,但卻能被黃體酮的拮抗劑RU486激活。這種突變的類固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到酵母GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和皰疹病毒VP16激活