CD8mAb對(duì)呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥的影響(一)

1、CD8mAb對(duì)呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥的影響 （一）【關(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T細(xì)胞；CD8單克隆抗體；氣道炎癥【Abstract】AIM:ToevaluatetheeffectofantiCD8monoclonalantibody(antiCD8mAb)onair wayinflammationofBalb/cmicewithrespiratorysyncytialvirus(RSV)inducedas thma.METHODS:Fiftymicewererandomlydividedinto5groups(n=10eachgro up):PBScontrolgro

2、up,OVAgroup,OVA/RSVgroup,antiCD8mAbtreatedgroupandlgG2 a mAbtreatedcontrolgroup.Lunghistopathologicalchangeswereevalu atedbyHEstain.Airwayresponsivenesswasassessedusingawholebodyplethys mography.Cellsinbronchoalveolarlavagefluid(BALF)werecountedandclassifi edandthesupernatantsoftheBALFwereusedfordet

3、ectionofinterleukin(lL) 4,IL5andinteferon (IFN) 丫 .ThepercentageofCD(+FN 丫 +,IL4+,ILL5+CD8+(IFNy +,IL4+,IL5+)TlymphocytesandtheratioofTh2/Th1,Tc2/Tc1inperibronchiallymphnodes(PBLN)wereanalysedbythreecolorflowcytometrymethod.RESULTS:Intraperiton ealadministrationofantiCD8mAbcanremarkablyinhibitairway

4、inflammationa ndairwayhyperresponsiveness(AHR).EosinophilsandlFN丫 ,IL4,IL5levelsinBALFdecreasedinantiCD8mAbtherapeuticgroupcomparedwithOVA/RSVgroup(P0.01,respectively ) .ThepercentageofCD8+ ( IFN y +,IL4+,IL5+TlymphocytesandtheratioofTc2/Tc1decreasedinantiCD8mAbtherapeuticgroupcomparedwithOVA/RSVgro

5、up( P0.01,respectively ) .AclosecorrelationbetweenthepercentageofCD8+（IFNy +,IL4+,IL5+）TlymphocytesandlFN丫，IL4,IL5levelsinBALFfromOVA/RSVgroup,antiCD8mAbtherapeuticgroupwasdemonstrated（rs=0.765,P0.01;rs=0.825,P0.01;rs=0.89 3,P0.01）.CONCLUSION:AntiCD8mAbmightsuppressairwayinflammationand AHRthroughth

6、emechanismthatCD8+TlymphocytestransferfromTc1toTc2,w hichmayberelativetotheincreaseofIL4,IL5,thegatheringofinflammatorycellsi ntheairwayandAHR.【Keywords】respiratorysyncytialviruses;asthma;CD8+Tlymphocytes;antiCD8monoclonal antibody;airwayinflammation【摘要】目的：觀察CD8mAb對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV誘導(dǎo)哮喘小鼠 氣道炎癥的影響 方法：Balb/

7、c小鼠50只，隨機(jī)分成5組（n=10）:磷 酸鹽緩沖液（PBS對(duì)照組；卵白蛋白（OVA組；OVA/RSV模型組； CD8mAb治療組；lgG2 a mA跆療對(duì)照組.應(yīng)用OVA腹腔注射致敏、OVA 氣道霧化結(jié)合RSV滴鼻激發(fā)復(fù)制小鼠哮喘模型，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣道炎 癥和氣道反應(yīng)性變化，支氣管肺泡灌洗液（balf作細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，測(cè)定BALF上清中白細(xì)胞介素（IL） 4,IL5干擾素（IFN ） 丫含量并采用三 色光流式細(xì)胞分析法檢測(cè)氣管旁淋巴結(jié)（PBLN中CD4+,CD8+T田胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFNy ,IL4,IL表達(dá).結(jié)果：與模型組相比，CD8mAb可明顯減輕小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng).CD8mA

8、b治療后BALF中嗜酸性粒細(xì) 胞及上清中細(xì)胞因子IFNy ,IL4,IL含量明顯減少(P均0.01), CD8+(IFN丫 +,IL4+ IL5+) T細(xì)胞百分比及Tc2Tc1比值明顯下降(P均0.01).PBLN中 CD8(IFN 丫 +,IL4+_5+)T細(xì)胞百分比與 BALF中 IFN y ,IL4,IL5 含量呈顯著正相關(guān) (分別 rs=0.765,P0.01;rs=0.825,P0.01;rs=0.893,P0.01). 結(jié)論：CD8mAb對(duì)RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)具有抑制 作用，其部分機(jī)制可能與致敏條件下病毒感染引起CD8+T細(xì)胞功能發(fā)生轉(zhuǎn)化，即由產(chǎn)生IFNy為特征

9、的細(xì)胞毒CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL4,IL5 為特征的非細(xì)胞毒CD8+T細(xì)胞有關(guān).【關(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T細(xì)胞；CD8單克隆抗體；氣 道炎癥0引言 臨床及流行病學(xué)研究表明,呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的 重要原因1.Osullivan等2在因重度哮喘死亡患者的肺標(biāo)本中檢 測(cè)到呼吸道合胞病毒( respiratorysyncytialvirus,RSV) ,鼻病毒基因組, 并發(fā)現(xiàn)氣管旁有大量CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，且CD8+T細(xì)胞表面分子CD25, 穿孔素表達(dá)增高，提示重度哮喘患者氣道局部存在CD8+T細(xì)胞數(shù)量和功能的異常.Schwarze等3的研究表明，病毒誘導(dǎo)的哮喘與過(guò)

10、敏性哮 喘在氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制上有所不同，前者的Th2型炎癥主要由CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生和維持，而后者主要由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生和維持.上述研究提示，CD8+T細(xì)胞在呼吸道病毒誘導(dǎo)的哮喘發(fā)作及急性加重中起重要作用.因此，我們采用RSV誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，觀察 CD8mAb對(duì)哮喘氣道炎 癥和氣道反應(yīng)性的影響 .1 材料和方法1.1 材料1.1.1動(dòng)物、試劑和儀器清潔級(jí)雌性 Balb/c 小鼠 50 只(中國(guó)科學(xué)院上海 動(dòng)物中心)，68周齡，體質(zhì)量1720g乙酰膽堿(acetylcholine,ACH), 卵白蛋白(ovalburmin,OVA) (Sigma) ;IFN 丫，IL4,IL酶聯(lián)免疫吸附

11、試驗(yàn)(ELISA試劑 Kit(Biosource);大鼠抗小鼠 CD8a(Ly2)mAb大鼠抗小 鼠IgG2 a mAb對(duì)照抗體(BDPharMinger);流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒包括： 刺激劑卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯( phorbolmyristateacetate, PMA) ,離子霉 素(Inomycin)，阻斷劑(brefeldinA,BFA 大鼠抗小鼠 PECy5標(biāo)記 CD3, FITC標(biāo)記 CD8, PE標(biāo)記 IFN 丫L4,IL5mAb及大鼠 IgG1 陰性對(duì)照(Caltag); 動(dòng)物肺功能體描箱，呼吸機(jī) (北京鑫奧成科技有限公司提供 )；軟件分析 系統(tǒng)(An iRes2003forWi

12、 ndows982000/XP),酶標(biāo)儀(Sun rise),真空凍 干機(jī)(LABCONCO, FACScalibu流式細(xì)胞儀(BectonDickinson).1.1.2細(xì)胞和病毒RSVLong株A型(南京醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教 研室提供)；人喉癌上皮細(xì)胞(HEp2)(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究 所惠贈(zèng)) .HEp2 細(xì) 胞 在含 100mL/L 滅活胎牛血清的 DMEM 中 37C ,50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，RSV接種HEp2細(xì)胞， 繼續(xù)在含20mL/L滅活胎牛血清的DMEM的維持液中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變 達(dá)100%時(shí)收獲病毒，并凍存于-80C冰箱中，反復(fù)凍融、離心后

13、，留上清備用 .參照文獻(xiàn)4的方法采用空斑形成試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度， 取滴度為1.0 x 10空斑形成單位（PFu/mL） RSV備用.1.2 方法1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型 Balb/c 小鼠 50 只隨機(jī)分成 5 組，每組 10 只， 分別為磷酸鹽緩沖液（PBS對(duì)照組；卵白蛋白（OVA組；OVA/RSV模型 組；CD8mAb治療組；lgG2a mA治療對(duì)照組.動(dòng)物分別于第1, 14日腹 腔注射致敏液0.2mL（ 0.8g/LOVA0.1mL和等體積液態(tài)鋁混合），第15 日起將小鼠置于透明密閉容器中以10g/LOVA溶液10mL霧化吸入，每 次20min，隔日1次，連續(xù)5wk，并分別于第21,

14、35,49日用滴度為 1.0 x 106PFu/ntL RSV50a鼻腔滴入，每日觀察小鼠癥狀，于最后1次 RSV滴入4d后測(cè)氣道反應(yīng)性.CD8mAb治療組和IgG2 a mA治療對(duì)照組 分別于RSV應(yīng)用6h后按1mg/kgipCD8mAb和IgG2 a mAt對(duì)照抗體.1.2.2 氣道反應(yīng)性測(cè)定小鼠經(jīng)腹腔麻醉、 氣管切開(kāi)后， 置密閉體描箱中，吸氣管、呼氣管、測(cè)壓管按指示連接，小鼠按頻率90次/min、潮氣量56mL/kg機(jī)械通氣，調(diào)節(jié)呼氣末壓為-8cmH2O,記錄經(jīng)肺壓、流速、 潮氣容積變化氣道反應(yīng)性用ACH激發(fā)后以肺阻力（RL表示，將ACH分 別按濃度（0.5, 1.5, 5.0, 15.0和45.0g/L）、容積為35卩L次尾靜脈注 射激發(fā)，經(jīng)肺壓和潮氣容積曲線回到基線后，將濃度增加 3 倍，每次 應(yīng)用ACH后記錄至少10次峰反應(yīng)的肺變量.1.2.3肺泡灌洗液（BALF細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)以0.5mLPBS進(jìn)行肺泡灌洗，反 復(fù)2次，1200r/min離心5min,上清保存在-20C冰箱中待測(cè)定細(xì)胞因 子沉淀細(xì)胞用0.5mLHanks液重懸，取O.ImL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余沉淀 細(xì)胞經(jīng)涂片，瑞氏吉姆莎染色， 按細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù) （至少計(jì)數(shù) 200 個(gè)細(xì)胞）.124細(xì)胞因子測(cè)定將BALF上清放入真空凍干機(jī)內(nèi)-70C凍干后，加入 200卩生理鹽