小鼠IL-10免疫組化試劑盒

1、小鼠IL-10免疫組化試劑盒該試劑盒以HRP標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin ConjugateHRP-SA為基礎(chǔ)，可用于檢測細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性IL-10抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的IL-10 抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，最后加入HRP-S A形成抗原一特異一抗一生物素化二抗一HRP-SA復(fù)合物，顯微鏡下觀察成像。試劑盒原理及 主要步驟圖試劑盒所含試劑：試劑 A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）試劑B封閉緩沖液（封閉用）20 mL試劑C （原裝進(jìn)口分裝）已稀釋的即用型IL-

2、10 抗（2.5ml）試劑D （原裝進(jìn)口分裝）生物素化羊抗兔IgG 1支（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:3001:500 ） 50卩L+抗體稀釋液20ml試劑E HRP-SA復(fù)合物1支（濃度1卩M 稀釋比1:501:200 ） 100卩L 試劑F DAB顯色液5ml用戶自備試劑：1. 10mM TBS（pH7.27.4）三羥基氨基甲烷1.21g氯化鈉7.6g加蒸餾水800mL濃鹽酸調(diào)pH值至7.27.4，最后定容至1000mLTBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比） 2抗原修復(fù)液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液） 10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液 檸檬酸 0.38g

3、檸檬酸三鈉 2.45g加蒸餾水900mL濃鹽酸調(diào)pH值至6.0，最后定容至1000mL 或：0.5M EDTA修復(fù)液（pH8.0）EDTA 2H2O 186.1g檸檬酸三鈉 2.45g加蒸餾水700mL用10mM NaO調(diào)pH值至8.0，最后定容至1000M13. 緩沖甘油封固劑 10 mL4. Tween 20 5 mL石蠟包埋組織切片免疫染色實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案） ：石蠟包埋組織切片34卩m厚度1. 烤片：將待做切片置于切片架上，于 60C恒溫烤箱中至少烤1 hr ;2. 脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3次（即二甲苯I、U、M），每次10 min；3. 水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，

4、無水乙醇 5min， 95%乙醇 2次（每次 2min）， 85% 乙醇2 min ； 75聽醇2min,自來水沖洗，ddH2O洗 2X 2min；4. 抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫度達(dá)到98100C）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O洗2X2min, TBS洗滌（2X2min）（具體修復(fù)方法見附1） *注：有些抗原勿需修復(fù)， 直接進(jìn)入第 5 步封閉。5. 封閉：滴加試劑B, 37E濕盒孵育30 min ;6. 加一抗：滴加用試劑C （即用型一抗），37T濕盒孵育2 hr或4C過夜；7. 洗滌：TBS-T 洗滌（3X 5 min ）;8

5、. 封閉：滴加試劑B, 37E濕盒孵育10 min ;9. 加二抗：滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑 D），37T濕盒中孵育30 min ；10. 洗滌： TBS-T 洗滌（ 3X 5 min ）；11. 封閉： 滴加試劑Tween 20，37E濕盒孵育封閉20 min ；12. 加HRP-SA 滴加用試劑C稀釋的試劑E（ 1： 50200,終濃度520 nM）, 37C 濕盒中孵育 30 min；13. 洗滌：TBS-T 洗滌（3X 5 min ）, TBS 洗滌（2X 5 min ）;14. 顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色；15. 復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；16.

6、 封片： 待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；17. 觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。注意事項(xiàng)：1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致 結(jié)晶或抗原封閉。2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使 用。3. 若試劑為微量濃縮液， 用前應(yīng)低速離心， 將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的 Tween 20,否則會(huì) 影響結(jié)果觀察。5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封 片。附 1：抗原修復(fù)方法常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液(0.01M pH6.0 )

7、、EDTA抗原修復(fù)液(pH8.0或 9.0)等等。一、酶消化修復(fù)法切片脫蠟水化處理，TBS沖洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37C孵育2030min后TBS沖中洗即可。二、微波抗原修復(fù)法微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰， 將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料 切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或高檔繼續(xù)微波1015mi n,取出微波盒冷卻至室溫后， 自來水沖洗， 取出切片。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異， 須自行調(diào)整。三、直接高壓抗原修復(fù)法取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰， 將組織切片置于耐高溫切片架上， 修復(fù) 液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí) 1.52.5min 即可脫離熱源，自 然冷卻至室溫后自來水沖洗， 取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。四、隔水式高壓抗原修復(fù)法 不銹鋼高壓鍋中加自來水