青蒿素類藥聯(lián)合紫杉醇對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作（精品課件）

1、青蒿素類藥聯(lián)合紫杉醇對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作用收稿日期：2015-08-26作者簡介：薛林路，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治重大疾病。Email：1121595778。通訊作者：宋健平，男，教授，博導(dǎo)，研究方向：青蒿素防治瘧疾策略和中醫(yī)藥防治重大疾病的研究。Email：songjp?；痦?xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273643）；青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81403295）。薛林路1，李國銘2，楊 濤1，鄧長生1，郭嘉雯1，鄭紹琴2，王 琪1，徐 勤1，宋健平1，2（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園，廣東 廣州 510445）.摘要：目

2、的 觀察青蒿琥酯（ATS）、雙氫青蒿素(DHA)和紫杉醇(Taxol)及ATS聯(lián)合Taxol對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作用，評價(jià)各組藥物對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的殺傷作用，初步探討ATS與Taxol聯(lián)合給藥對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞是否有協(xié)同增效作用。方法 采用CCK-8法檢測ATS、DHA和Taxol單藥對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用24 h和48h的抑制作用，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值；檢測ATS聯(lián)合Taxol不同配比AT（1:1）、AT（3:2）和AT（7:3）對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48 h的抑制作用。運(yùn)用質(zhì)量作用中效定理和藥物合并指數(shù)定理分析兩藥聯(lián)合是否有協(xié)同增效作用。

3、結(jié)果 ATS、DHA和Taxol單藥作用于小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的IC50值，在24h時(shí)，分別為126.56，86.09，3.27molL-1；在48h時(shí)，分別為1.36，15.11，0.97molL-1。ATS聯(lián)合Taxol 3個(gè)濃度組AT（1:1）、AT（3:2）和AT（7:3）對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h，聯(lián)合用藥合并指數(shù)（CI）均小于1。結(jié)論 ATS、DHA和Taxol單藥對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度和時(shí)間的增加而明顯增加，呈劑量和時(shí)間依賴性。青蒿琥酯聯(lián)合紫杉醇抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖，有良好的協(xié)同增效作用。.關(guān)鍵詞：青蒿琥酯；紫杉醇；小鼠黑色素瘤B1

4、6細(xì)胞中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003-9783（2016）01-doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2016.01.0The Antitumor Study of Artemisinins Combined with Paclitaxel on B16 Mouse Melanoma Cells .Xue Linlu1, Li Guoming2, Yang Tao1, Deng Changsheng1, Guo Jiawen1,Zheng Shaoqin2,Wang Qi1, Xu Qin1 ,Song Jiangping1,2* .(1. G

5、uangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006 Guangdong， China； 2. Science & Technology Industrial Park，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510445 Guangdong，China）.Abstract Objective To observe the inhibitory effects of artesunate (ATS), dihydroartemisinine (DHA) and pacli

6、taxel (Taxol) alone, and ATS combined with Taxol on the proliferation of B16 mouse melanoma cells, so as to evaluate the killing effects of each treatment on B16 mouse melanoma cells and to preliminarily explore whether ATS combined with Taxol provides synergy on B16 mouse melanoma cells.Methods Usi

7、ng CCK-8, the inhibitory effects of ATS ,DHA and Taxol alone on B16 mouse melanoma cells over 24 h and 48 h were detected and the 50% inhibiting concentration (IC50) was calculated; the inhibitory effects of ATS combined with Taxol in different ratios of A/T (1:1, 3:2 and 7:3) on B16 mouse melanoma

8、cells over 48 h were detected. Median-effect theory and drug combination index were used to analyze whether the combination of the two drugs provided synergy. Results The IC50 of ATS, DHA and Taxol alone on B16 mouse melanoma cells was 126.56, 86.09 and 3.27 M, respectively, at 24 h, and 1.36, 15.11

9、, 0.97 M, respectively, at 48h. The drug combination index (CI) was 1 for all the three ATS and Taxol combinations of A/T (1:1), A/T (3:2) and A/T (7:3) over 48 h acting on B16 mouse melanoma cells. Conclusions ATS, DHA and Taxol alone produced inhibitory effects on B16 mouse melanoma cells that inc

10、reased with drug concentration and time, suggesting dose and time dependence. ATS combined with Taxol provided favorable synergy in inhibiting proliferation of B16 mouse melanoma cells.Keywords：Artesunate;Taxol; B16 Mouse melanoma cells.18 / 18青蒿素是20世紀(jì)70年代初，我國藥學(xué)工作者從黃花蒿（Artemisia annuaL.）中提取的有效抗瘧成分，是

11、一種含內(nèi)過氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物1。近來有研究2-4表明，青蒿素類藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用具有廣泛的有效性。相對于化療藥物嚴(yán)重的毒副作用，青蒿素類藥物聯(lián)合用藥時(shí)不僅不會增加副作用，還能增強(qiáng)療效和減少抗腫瘤藥的用量5。因此，本研究在觀察青蒿琥酯（ATS）、雙氫青蒿素(DHA)和紫杉醇 (Taxol) 單藥以及ATS聯(lián)合Taxol抗小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用的基礎(chǔ)上，探討ATS與Taxol聯(lián)合給藥對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞是否有協(xié)同增效作用。.1材料與方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞購于ATCC，用含10 %新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于5 %CO2、37 、飽和濕度的二

12、氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔23天換液一次，用0.25 %胰酶（含0.02 %EDTA）消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。.1.2 藥物與試劑 青蒿琥酯，桂林南藥，批號：ZA130614；雙氫青蒿素，重慶華立武陵山制藥有限公司，純度99.1 %；紫杉醇，上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司，批號：120703；CCK-8試劑盒，日本DOJINDO公司，批號：EQ829；新生牛血清，美國Gibco公司，批號：；1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司，批號：；臺盼藍(lán)，美國Sigma公司，批號：105F-05375。.1.3細(xì)胞增殖的檢測 取匯合率80 %90 %對數(shù)生長的B16細(xì)胞用0.25 %胰酶消化成

13、單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約1.0105mL，接種到96孔板中，每孔90L，置于37 、5 % CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，將各藥液稀釋加入各孔，每孔加10L藥液。ATS的終濃度分別為5，1，0.5，0.25 molL-1，DHA的終濃度為10，5，1，0.5molL-1，Taxol的終濃度為20，10，5，1 molL-1，各濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑）、0.1 %DMSO對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、0.1 %DMSO和CCK-8試劑）和調(diào)零組（空白培養(yǎng)基、CCK-8試劑），置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。待檢測前4h，每孔加入CCK-8試劑10

14、L，再避光培養(yǎng)到檢測時(shí)間。在酶標(biāo)儀檢測波長450nm，參考波長630nm下檢測吸光度OD值，并取其均數(shù)。以空白組調(diào)零后，分別計(jì)算細(xì)胞的抑制率。.1.4 ATS聯(lián)合Taxol作用小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞48h的增殖抑制作用 取匯合率80 %90 %對數(shù)生長的B16細(xì)胞用0.25 %胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約1.0105mL，接種到96孔板中，每孔90 L，置37 、5 %CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)板，將各藥液稀釋加入各孔，每孔加10L藥液。結(jié)合ATS和Taxol單藥對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的48h IC50值，選擇紫杉醇和青蒿琥酯的終濃度為4，2，1，0.5molL-1。根據(jù)

15、文獻(xiàn)資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，聯(lián)合給藥按下表1進(jìn)行配制給藥，各濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑）和調(diào)零組（空白培養(yǎng)基、CCK-8試劑），置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。待檢測前4h，每孔加入CCK-8試劑10L，再避光培養(yǎng)到檢測時(shí)間。在酶標(biāo)儀檢測波長450 nm，參考波長630 nm下檢測吸光度OD值，并取其均數(shù)。以空白組調(diào)零后，分別計(jì)算細(xì)胞的抑制率。補(bǔ)參考文獻(xiàn)。.表1 ATS+Taxol聯(lián)合用藥的藥物配制（molL-1）Table 1 The compounding of ATS with Taxol組合物ATSTaxolATSTaxolATSTaxolATSTaxol0

16、:104.002.001.000.51:12.02.01.01.00.50.50.250.253:22.41.61.20.80.60.40.30.27:32.81.21.40.60.70.30.350.151:04.002.001.000.501.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 以Excel錄入原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 19.0和Graphpad prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料分析采用One way ANOVA，多重比較采用Duncan法進(jìn)行比較，線性相關(guān)采用線性回歸分析。. 腫瘤細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式如下：細(xì)胞抑制率（IR %）=(空白對照組平均OD值-給藥

17、組平均OD值)/空白對照組平均OD值 100 %。采用Logit法計(jì)算IC50。.1.6聯(lián)合用藥分析方法 根據(jù)文獻(xiàn)6提出的合并指數(shù)定理和質(zhì)量作用中效定理進(jìn)行分析。.藥物質(zhì)量作用中效定理公式為：Dx=Dmfa/(1-fa)1/m，藥物合并指數(shù)定理公式為：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，.其中：CI（Combo Index）是藥物聯(lián)合用藥指數(shù)，當(dāng)CI=1時(shí)，表示相加作用；當(dāng)CI1時(shí)，表示拮抗作用；當(dāng)CI1時(shí)，表示協(xié)同作用。(Dx)1是第一個(gè)藥物(D)1單獨(dú)作用時(shí)抑制率為x %的劑量， (Dx)2是第二個(gè)藥物(D)2單獨(dú)作用時(shí)抑制率為x %的劑量，而(D)1和(D)2分別是在兩藥聯(lián)

18、合使用時(shí)抑制率也為x %時(shí)第一個(gè)藥物和第二個(gè)藥物的劑量。Dm是藥物的中效劑量濃度（IC50），m表示質(zhì)量作用中效定理曲線的斜率，fa是抑制率。.使用CompuSyn 1.0電腦軟件輸入各單藥及其聯(lián)合用藥在各劑量濃度的抑制率（即fa值），則可以自動演算m、r及Dm值，并模擬出fa-CI圖形（Chou-Talalay Plot），自動掃描測定藥物的拮抗、相加或協(xié)同作用。其中r表示質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)，r值不小于0.95表示模擬的參數(shù)線性良好。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次數(shù)據(jù)單獨(dú)處理，根據(jù)三次試驗(yàn)的均值標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)Dm、m和r的值。.2 結(jié)果2.1 ATS、DHA和Taxol對小鼠黑色素瘤B16細(xì)

19、胞IC50值的測定 根據(jù)表2可以得出，運(yùn)用CCK-8法檢測紫杉醇、青蒿琥酯和雙氫青蒿素對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的IC50，在藥物作用24h時(shí)，分別為3.27，126.56，86.09molL-1；在藥物作用48h時(shí)，分別為0.97，1.36，15.11molL-1。由圖1圖3可見，隨著藥物劑量的增加，藥物對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增加，呈濃度依賴性；另外，隨著作用時(shí)間的延長，藥物對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增加，呈時(shí)間依賴性。.注:同一藥物同一時(shí)間用Duncan法進(jìn)行多重比較，標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P0.01)；標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(

20、P0.05)；標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P0.05)。同一藥物同一濃度，不同作用時(shí)間48h與24h抑制率相比，*P0.01，*P0.05。.表2 ATS、DHA和Taxol對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞24h和48h的IC50（molL-1）.Table 2 IC50 of ATS, DHA and Taxol on proliferation of B16 mouse melanoma cells in 24 h and 48 h.藥物24 h IC5048 h IC50ATS126.561.36DHA86.0915.11Taxol3.270.972.2 ATS+Taxol聯(lián)合用藥 根

21、據(jù)以上藥物作用48h的IC50值，選擇ATS與Taxol進(jìn)行聯(lián)合用藥，聯(lián)合給藥按表1進(jìn)行配制給藥，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以考察兩藥聯(lián)合應(yīng)用是否有協(xié)同作用。ATS+Taxol不同配比對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48 h的增殖抑制作用數(shù)據(jù)見下表3表5。.表3 ATS+Taxol不同配比對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h的增殖抑制作用（第一次檢測）Table 3 Effects of different proportion of ATS with Taxol on the proliferation of B16 mouse melanoma cells in 48 h(1st).藥物/組合物各劑量濃度的

22、抑制率/%0.5 molL-11 molL-12 molL-14 molL-1ATS33.6542.3145.7751.25Taxol40.1550.9357.3159.75AT（1:1）40.3853.2158.8062.31AT（3:2）39.7654.9859.2363.9AT（7:3）51.1956.8661.8767.03表4 ATS+Taxol不同配比對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h的增殖抑制作用（第二次檢測）Table 4 Effects of different proportion of ATS with Taxol on the proliferation of B16

23、mouse melanoma cells in 48 h(2nd) .藥物/各劑量濃度的抑制率/%組合物0.5 molL-11 molL-12 molL-14 molL-1ATS34.8843.8045.4049.97Taxol44.0953.5262.1663.63AT（1:1）44.2256.2161.5564.71AT（3:2）55.7160.2263.9070.89AT（7:3）55.1459.7964.6170.26表5 ATS+Taxol不同配比對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h的增殖抑制作用（第三次檢測）Table 5 Effects of different proportio

24、n of ATS with Taxol on the proliferation of B16 mouse melanoma cells in 48 h(3rd).藥物/組合物各劑量濃度的抑制率/%0.5 molL-11 molL-12 molL-14 molL-1ATS45.3051.0959.0362.91Taxol50.7458.8064.5268.67AT（1:1）50.4358.7364.9069.29AT（3:2）54.3866.1768.8972.68AT（7:3）54.4965.1674.6475.69根據(jù)AT（1:1）、AT（3:2）和AT（7:3）三次實(shí)驗(yàn)的抑制率，運(yùn)用Co

25、mpusyn1.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算，可得以下參數(shù)表6，經(jīng)過三次重復(fù)試驗(yàn)的質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)r均值大于0.95，表示參數(shù)的擬合良好。三個(gè)聯(lián)合用藥濃度組合物的Dm值（半數(shù)抑制濃度）均比ATS和Taxol單獨(dú)用藥時(shí)的Dm值要低，與ATS相比差異有極顯著意義（P0.01），與Taxol相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。其中AT（7:3）組合物Dm值下降最為明顯，但三個(gè)聯(lián)合用藥濃度組合物的Dm值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。.表6 ATS+Taxol不同配比對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h的相關(guān)參數(shù)（,n=3）Table 6 The Parameters of differe

26、nt proportion of ATS with Taxol on the proliferation of B16 mouse melanoma cells in 48 h.藥物/組合物DmmolL-1mrATS2.5731.2400.3240.0330.9760.016Taxol0.7720.2960.3820.0170.9690.017AT（1:1） 0.7110.226*0.3990.0150.9710.016AT（3:2） 0.4970.354*0.3840.0710.9600.019AT（7:3） 0.3590.067*0.3980.0810.9860.018注:與ATS組比較，

27、*P0.01。圖4 Fa-CI值曲線圖Figure 4 Fa-CI plot由Fa-CI曲線圖可以發(fā)現(xiàn)，組合物在1:1、3:2和7:3時(shí)，CI值均小于1，兩個(gè)組合物有較好的協(xié)同作用，其中以7:3的藥物組合協(xié)同作用最為明顯。.3 討論雖然晚期黑色素瘤的治療取得了突破性進(jìn)展，個(gè)體化靶向治療和免疫靶向治療是目前的研究熱點(diǎn)，但對于黑色素瘤患者來說化療藥物仍然是重要的治療手段。臨床上，化學(xué)治療多選擇包括達(dá)卡巴嗪，替莫唑胺，白蛋白紫杉醇，紫杉醇卡鉑，達(dá)卡巴嗪替莫唑胺為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案7。已知青蒿琥酯具有抗腫瘤增殖的潛在作用8，有臨床研究證明，青蒿琥酯作為腫瘤治療用藥，具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和一般耐受性良好的特性

28、9。而且雙氫青蒿素被認(rèn)為能夠選擇性地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，而不影響人原代黑色素細(xì)胞的生存能力，具有用作化學(xué)治療的前景10。青蒿素類藥物與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用治療黑色素瘤是否能減少紫杉醇單一用藥所帶來的毒副作用，并且療效穩(wěn)定，值得進(jìn)一步研究和探討。.本實(shí)驗(yàn)研究表明了青蒿琥酯、雙氫青蒿素和紫杉醇對小鼠黑色素瘤具有抑制作用。結(jié)果顯示，三種藥物對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制增殖作用效果顯著，有明顯的時(shí)間-劑量關(guān)系。而且在作用48 h時(shí)，青蒿琥酯的半數(shù)抑制濃度與紫杉醇的基本相當(dāng)。另外，雙氫青蒿素對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞也有很好的抑制增殖作用，在作用24h時(shí)，效果比青蒿琥酯要顯著。可見雙氫青蒿素除了可以選擇性

29、誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡10外，其抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)也較顯著。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素對細(xì)胞的作用抑制率有時(shí)差別比較大，這可能與雙氫青蒿素結(jié)構(gòu)中存在不穩(wěn)定基團(tuán)，而存在降解現(xiàn)象，從而引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差或者得到錯(cuò)誤的結(jié)論11。.聯(lián)合用藥的評價(jià)參考了Chou-Talalay提出的評價(jià)體系6，青蒿琥酯與紫杉醇對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h的IC50值都約為1M，因此設(shè)置0.5、1、2、4M四個(gè)濃度梯度的藥物濃度組合。無論是1:1組（即是按照周廷潮先生的IC50：IC50組進(jìn)行設(shè)置），還是3:2組和7:3組，與單一用藥相比抑制效果均較理想。三個(gè)聯(lián)合用藥濃度組合物的Dm值（半數(shù)抑制濃度）雖然與Taxol

30、單一用藥相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是聯(lián)合用藥減少了Taxol的用量，能夠減少紫杉醇單一用藥所帶來的毒副作用。聯(lián)合用藥組合物從結(jié)果中都可以明顯得出CI值小于1，兩藥聯(lián)合有一定的協(xié)同作用。而兩藥聯(lián)合作用，抑制率和協(xié)同用藥指數(shù)CI值尤其以7:3濃度組較為明顯。.綜上所述，青蒿琥酯聯(lián)合紫杉醇對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增值抑制協(xié)同作用明顯，有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。參考文獻(xiàn)：.1王紅，王京燕. 青蒿素類抗瘧藥的作用機(jī)制及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展J. 國際藥學(xué)研究雜志，2007，34(3)：187-189，193.2 Efferth T，Dunstan H，Sauerbrey A，et al. The anti-malarial artesunate is also active against cancerJ. International journal of oncology，2001，18(4)：767-773.3 張澤舜，陳忠平.青蒿素類化合物抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展 J. 中國神經(jīng)腫瘤雜志， 2011，1：16.4曹智剛，袁守軍，陳惠鵬.雙氫青蒿素對腫瘤細(xì)胞及腫瘤動物模型的抑制作用J. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(24)：2835-2837.5 Efferth T，Sauerbrey A，Olb