脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究進(jìn)展

1、韓祝平，葉鵬，王新平( 浙江理工大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州310018)摘 要: 將脂肪酶固定化可提高酶的選擇性、穩(wěn)定性等，已廣泛應(yīng)用于手性拆分等研究。常用的高分子固定化載體有聚丙烯酸多孔樹脂及帶功能基團(tuán)的共聚物等。從脂肪酶結(jié)構(gòu)的角度介紹其手性拆分機(jī)理，并具體討論了一些商 品化固定化脂肪酶在手性拆分中的應(yīng)用及固定化載體材料對手性拆分的影響。關(guān)鍵詞: 脂肪酶; 手性拆分; 酶固定化; 功能化載體中圖分類號: tq 932文獻(xiàn)標(biāo)識碼: a文章編號: 1671 3206( 2011) 10 1823 05lipase immobilization and research progress in ch

2、iral resolutionhan zhu-ping，ye peng，wang xin-ping( department of chemistry，zhejiang sci-tech university，hangzhou 310018，china)abstract: immobilized lipase is widely applied in chiral resolution research recently，for which can en-hance its enantioselectivity，stability and so on macroporous polyacryla

3、te resin and functionalized copoly- mers are the most common polymer immobilized supports this review summarized the influence of struc- ture on the resolution mechanism，the application of commercial immobilized lipase and the influence of immobilized methods or support materialskey words: lipase; c

4、hiral resolution; enzyme immobilization; functional support將生物 催 化 劑“酶”固定化可以有 效 提 高 酶 的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，而固定化載體材料的選擇和 設(shè)計(jì)則是酶固定化研究的關(guān)鍵之一，常用的固定化載體材料有天然高分子材料、合成高分子材料及無 機(jī)材料等。其中一些合成高分子材料( 如聚丙烯酸 樹脂、共聚樹脂等) 便宜易得，且易于進(jìn)行功能基團(tuán)化改性，具有很好的研究意義及應(yīng)用前景。脂肪酶具有高度的立體選擇性，可以催化手性 拆分制備單一手性醇類、胺類和酯類等有機(jī)合成中間體。目前已有一些商品化固定化脂肪酶被有機(jī)化 學(xué)家應(yīng)用于藥品手性拆分研

5、究中，其中諾維信公司 的 novozyme 435( 以聚丙烯酸樹脂為 載 體 ) 的 報(bào) 道最為廣泛。關(guān)于脂肪酶手性拆分的研究報(bào)道，主要 集中于動力學(xué)拆分、動態(tài)動力學(xué)拆分以及反應(yīng)介質(zhì)、溫度等方面1，而從載體材料角度研究脂肪酶固定化后催化拆分的文獻(xiàn)較少。本綜述簡單介紹脂肪酶 結(jié)構(gòu)及其手性拆分機(jī)理，并總結(jié)了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的應(yīng)用及載體材料對手性拆分影響的研究，提出通過設(shè)計(jì)功能化固定化載體以 控制脂肪酶手性拆分性能的思路。1脂肪酶手性拆分機(jī)理脂肪酶的催化活性中心是由絲氨酸( ser) 殘基、天冬氨酸( asp) 和組氨酸( his) 組成的三元體系，正常情況下，該 中心埋在一個(gè)或

6、數(shù)個(gè) -螺 旋 結(jié) 構(gòu) 的 “蓋子”下面，并受其保護(hù)。催化時(shí)，蓋子打開，脂肪 酶活性中心暴露，處于活性構(gòu)象，但也有些脂肪酶和 脂酶中沒有“蓋子”。來源不同的脂肪酶，往往會表現(xiàn)出不同的手性 選擇性，如脂肪酶 candida antarctica b 被認(rèn)為是在 寬的底物( 仲醇類、胺類及酯類等) 范圍內(nèi)可優(yōu)先對r-構(gòu)型底物反應(yīng)2，且反應(yīng)速度快，選擇性高。而脂 肪酶 candida rogusa lipase 則 優(yōu) 先 對 s-構(gòu) 型 底 物 反應(yīng)3。表 1 列舉了幾種不同來源脂肪酶應(yīng)用于手性 拆分報(bào)導(dǎo)中的選擇性。收稿日期: 2011-08-20修改稿日期: 2011-09-01基金項(xiàng)目: 國家

7、自然科學(xué)基金 ( 50803059) ; 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( y407275)作者簡介: 韓祝平( 1987 ) ，女，浙江海寧人，浙江理工大在讀碩士研究生，師從葉鵬副教授，主要從事酶固定化和生物材 料方面的研究。電話: 0571 86843691，e mail: han_pipi 126 com表 1table 1來源不同脂肪酶的手性選擇性the chiral selectivity of different sources of lipase肪酶對底物鏈長的選擇性密切相關(guān)。不同脂肪酶隧道區(qū)的長度差別很大，對于 crl 隧道區(qū)的長度可以 容納至少 18 個(gè)碳原子的碳鏈，而 rml

8、活 性 中 心 到 酶表面的隧道區(qū)的長度很短。因此，不同脂肪酶適 用于不同大小底物分子，表現(xiàn)出的選擇性也不同。研究脂肪酶手性拆分機(jī)理，需要考慮脂肪酶與 底物復(fù)合體的結(jié)合情況。通過定向進(jìn)化技術(shù)，還可 以改變脂肪酶與底物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，從而改變選 擇性。karin 等10利用定向進(jìn)化將 candida antarc- tica lipase a ( cala) 活性位處的苯丙氨酸用甘氨酸 來替代，由于甘氨酸體積小減小了空間位阻，有利于 r-構(gòu)型底物進(jìn)入，而野生型的脂肪酶對 s-構(gòu)型底物 有選擇性。2商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的應(yīng) 用隨著酶固定化技術(shù)的不斷成熟，一些固定化脂 肪酶已經(jīng)獲得商業(yè)化生

9、產(chǎn)，并在手性拆分等領(lǐng)域得 到廣泛地研究和應(yīng)用。表 2 為一些商品化固定化脂 肪酶的信息。脂肪酶來源a優(yōu)先選擇性文獻(xiàn)22-345-678cablr-crls-pflr-pclbcl rmlr-r-s-a: cabl: candida antarctica b; crl: candida rogusa lipase; pfl:pseudomonas fluorescence lipase; pcl: pseudomonas cepacia lipase;bcl: burkholderia cepacia lipase; rml: rhizomucor miehei lipase脂肪酶的結(jié)構(gòu)決定其所

10、能催化的底物及其底物 的立體選擇性，這主要與脂肪酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)不同 有關(guān)。pleiss 等9研究了 6 種脂肪酶上脂肪酸結(jié)合 位點(diǎn)的幾何形狀，分為三類: 疏水狹縫狀結(jié)合位點(diǎn)( 來源于根酶菌類，如 rml) ; 漏斗狀結(jié)合位點(diǎn)( 來 源于 南 極 假 絲 酵 母、假 單 胞 菌 屬 等，如 cabl 和 pfl) ; 隧道狀結(jié)合位點(diǎn)( 來源于假絲皺落酵母，如 crl) 。這些結(jié)合位點(diǎn)的大小、形狀及理化性質(zhì)與脂表 2 商品化固定化脂肪酶table 2 commercial immobilized lipase商品名生產(chǎn)商或供應(yīng)商脂肪酶載體酶活性ae 或 ee % be 20011，e 20012，

11、e = 277 713，e 10014，e 10015，dkrc ，ee% = 9516e = 10 12;e = 1512，ee% = 8318e 20011，e = 10912e = 24920，dkr，ee% 9921dkr，ee% 9922ee% 99e 20011，e = 54 813novozyme 435novozyme corp( sigma)calb聚丙烯酸樹脂10 000 u /glipozyme rm imlipozyme tl imnovozyme corp( sigma)novozyme corprmltlld陰離子交換樹脂二氧化硅5 800 u /g170 iun

12、/gl17amano pharmaceutical( aldrich)1 638 u /g19amano lipase ps-c ipcl陶瓷lipase ps-damano pharmaceuticalpcl硅藻土10 500 u /glipase b candidaantarctica immobilizedon immobead 150immobead 150( 交聯(lián)甲基丙 烯酸與環(huán)氧樹 脂共聚物)sigmacalb18 000 u /gimmcalby-t1-350c-lectacalb聚丙烯顆粒2 500 tbu /ga: 固定化脂肪酶活性測定方法各有不同，故所表示酶活性值僅作為參考

13、; b: 外消旋轉(zhuǎn)化率 ( c) ，底物對映體過量值 ( ees ) ，產(chǎn)ln1 c( 1 + eep) ees srrs物對映體過量值 ( eep ) ，對映體選擇率 ( e) 計(jì)算如下式: e = ln1 c( 1 ee ) ，eep =，ees =，c =，r+sr+see + eepspr 和s分別表示 r-對映體濃度和 s-對映體濃度; c: dkr( 動態(tài)動力學(xué)拆分 dynamic kinetic resolution) ; d: thermomyceslanuginosus lipase 米曲脂肪酶。由表 2 可知，國外大的固定化脂肪酶生產(chǎn)商主要有 novo、sigma、aman

14、o，采用的酶源主要有 candi- da antarctica lipase b( calb) 、rhizomucor miehei li-pase( rml) 、pseudomonas cepacia lipase( pcl) 等，選用的載體大多是比較便宜易得的聚丙烯酸、聚丙烯樹脂類及功能化共聚物，另外也有硅藻土、硅膠、陶 瓷等無機(jī)載體以及離子交換樹脂等。其中 novo 公 司的 novozyme 435 是以 calb( 相對其他酶源較便 宜) 作 為 酶 源，聚丙烯酸樹脂為載體，應(yīng) 用 非 常 廣泛。不僅因?yàn)?novozyme 435 相對比較便宜易得，還 由于它的耐熱穩(wěn)定性及重復(fù)使用性

15、也較好，在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出很好的活性19，23，對許多藥物中間體 表現(xiàn)出很 好 的 選 擇 性8，13-15，尤 其是可催化一些仲 醇類在有機(jī)溶劑中水解、酯交換、酯化拆分，故經(jīng)常被研究者選用。foresti 等8研究利用 novozyme 435 催化拆分布洛芬，在不加有機(jī)共溶劑的情況下，控制 反應(yīng)物乙醇與布洛芬摩爾比為 7，對映體過量值 ee= 54% ，轉(zhuǎn)化率 63% 。novozyme 435 在催化動態(tài)動 力學(xué)學(xué) 拆 分 ( dkr) 中也顯示很好的活性選擇性， vallin 等16研究動態(tài)動力學(xué)拆分 1-芳基乙醇類，對于大多數(shù)底物 ee% 95。de souza 等12 研 究 5

16、種 商 用 固 定 化 脂 肪 酶 催 化拆分外消旋苯乙醇，發(fā)現(xiàn)同時(shí)在微波輻射加熱下，3 1吸附法操作簡便，載體選擇范圍廣，吸附量大，并 能 對一些底物也表現(xiàn)出較好的選擇性，故應(yīng)用較為普遍。da silva 等26將 aspergillus niger 脂肪酶通過簡單的 吸附固定，載體為 accurel ep-100( 疏水性聚丙烯顆 粒) 、amberlite mb-1( 疏水性離子交換樹脂) ，celite( 硅藻土) ，montmorillonite k10( 蒙脫土) 和 silica gel( 硅膠) ，發(fā)現(xiàn)具有疏水性的離子交換樹脂載體具有 最高的選擇性( e = 19) ，而脂肪酶

17、吸附在親水的硅 藻土( e = 1 5) 和硅膠上選擇性較差。原因可能有: 在親水性載體上酶固定量少; 吸附后酶構(gòu)象變化而 失活; 減少了疏水性底物靠近酶活性位的能力; 載體 基 質(zhì)產(chǎn)生的立體位阻限制了脂 肪 酶 的 柔 性。 wang27等從 10 種不同脂肪酶選出活性和選擇最 高的 candida rugosa lipase，將其分別固定于同類 型 的離子交換 樹 脂、天然高分子載體等，發(fā) 現(xiàn) 其 中 以 deae-sephadex a-25( 二乙基氨基功能化改性交聯(lián) 葡聚糖，一種陰離子交換劑) 為載體拆分薄荷醇選 擇性最高，ee = 95% ，且重復(fù)使用性好。3 2共價(jià)結(jié)合法此法往往固

18、定化牢固，穩(wěn)定性好，對一些底物表 現(xiàn)出很好的選擇性，但操作復(fù)雜，對脂肪酶結(jié)構(gòu)變化 影響較大，還易使其變性，改變立體專一性，應(yīng)用受 到一定限制。fernandez-lorente 等28 對脂肪酶 ba- cillus thermocatenulatus ( btl2) 進(jìn)行氨化改性，通過 多點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，固定在環(huán)氧瓊脂糖上，活性保持原來 的 65% ，但穩(wěn)定 性 得 到 大 大 提 高，在水解拆分消旋 體中，s 構(gòu)型對映體選擇率 e 100。bhushan 等29 自制了一系列大孔珠狀共聚物( 甲基丙烯酸縮水甘 油酯與二甲基丙烯酸乙二醇酯 ) 作 載 體，通 過 共 價(jià) 結(jié)合方法( 載體上環(huán)氧基

19、團(tuán)與脂肪酶上氨基形成共對映體選擇率 novozym 435( e 200) amano ak( e = 115) amano ps-c i( e = 109) lipozyme tlim( e = 15 ) lipozyme rl im ( e = 10 ) 。 yadav等24選用 5 種 脂 肪 酶 ( 其 中 3 種 商 用 固 定 化 脂 肪 酶) 催化 合成月桂酸香茅醇酯，發(fā) 現(xiàn) 催 化 活 性 no-vozym 435 lipozyme im 20 lipozyme tl im ak。在 這 些 比 較 中，novozymelipase ps lipase435 都保持有最好的選擇

20、性( 對映體選擇率 e 值大都在 100 以上) 和 活 性，原 因 從 mei 等25 的 研 究 中 可知，novozyme 435 中 脂 肪 酶 ( calb) 固 定 在 大 孔樹脂上，同步加速紅外顯微光譜顯示，calb 的二級 結(jié)構(gòu)不因固定化而發(fā) 生 變 化，novozyme 435 顆 粒 的 孔徑從掃描電鏡圖可知比 calb 大 10 倍，故對酶和 底物的進(jìn)出沒有障礙，從而仍可表現(xiàn)出好的選擇性 和活性。其它幾種商品化的固定化脂肪酶，如 lipozymerm im、lipozyme tl im、amano lipase ps-c i、amanolipase ak 在手性拆分應(yīng)用中

21、也較多，其中 amano li- pase ps-c i 還作為動態(tài)動力學(xué)拆分 ( dkr) 中 的 催 化劑，在文獻(xiàn)21-22中，對映體過量值 ee% 99，表現(xiàn) 出很好的選擇性。目前，盡管一些固定化脂肪酶已商業(yè)供應(yīng)，且有 些在手性拆分中表現(xiàn)出很好的性 能，如 novozym435，然而商品化固定化脂肪酶的價(jià)格相對還是較 高，很難應(yīng) 用 于 工業(yè)化催化拆分制備手性化合物。 因此，對于固定化脂肪酶的研究仍吸引了眾多研究 者。價(jià) 鍵 結(jié) 合 ) 固 定 脂 肪 酶arthrobacter sp lipase( abl) ，發(fā)現(xiàn)中等疏水 性載體含環(huán)氧基團(tuán)分別為 80% 和 70% 固定脂肪酶后活性

22、最高，比其它兩類超 疏水性載體和親水性載體脂肪酶結(jié)合量高，主要是 因?yàn)橹久甘且环N疏水活性酶，易于吸附在疏水性 載體上。將其用于拆分藥物中間體，乙基-3-羥基-3- 苯基丙酸酯對映體過量 值 達(dá) 到 98% ，轉(zhuǎn) 化 率 為45% ，相應(yīng)的自由酶 ee = 80% ，轉(zhuǎn)化率 35% ，選擇性 得到了提高，并且重復(fù)使用 15 次酶活性和選擇性下 降很小。3 3包埋法固定此法可較少改變酶的結(jié)構(gòu)，且條件溫和，故在手3脂肪酶固定化方法對手性拆分的影響脂肪酶固定化后它的微環(huán)境發(fā)生改變，選擇性性拆分的應(yīng)用中具有較好的研究前景。han 等30將脂肪酶 candida antarctica lipase b

23、( calb) 采用加 壓的方法固定在疏水性介孔氧化硅載體上，傳統(tǒng)的也會發(fā)生改變，因此，可以通過設(shè)計(jì)固定化載體和方法來研究固定化脂肪酶手性拆分機(jī)理。方法是通過攪拌包埋，新型的固定化方法是將脂肪酶包埋在多 孔 硅 酸 介 孔 泡 沫 ( mcf) 上，壓 力 為 21 35 mpa，負(fù)載量達(dá)到 275 mg /g 氧化硅，可重復(fù)使 用性 和對溫度穩(wěn)定性高于 商 業(yè) 購 買 的 novozyme435，應(yīng)用于催化拆分 1-苯乙醇，底物為乙酸乙丙烯 基酯，ee 99 7% ，與自由酶相似。定化載體。其中固定在一些疏水性的載體上通常表現(xiàn)出更好的 活 性，這可能與脂肪酶的結(jié)構(gòu) ( 具 有 疏 水活 性

24、口 袋 ) 有 關(guān)。脂肪酶固定化后對映體選擇 性、穩(wěn)定性相比自由酶大多都得到了提高，但活性有 所下降，穩(wěn)定性提高可能由于固定化后酶剛性結(jié)構(gòu)增多34-35。另外，固定化后脂肪酶一般不改變原自 由酶的手性選擇性，但也有文獻(xiàn)報(bào)道固定化后酶的手性選擇性發(fā)生 改 變31。關(guān)于固定化方法和載體 對脂肪酶固定化后手性選擇性的影響目前仍缺乏明 確的機(jī)理解釋。因此，可以通過設(shè)計(jì)功能化固定化 載體以控制脂肪酶手性拆分性能，從而進(jìn)一步探討 其拆分機(jī)理。多種方法固定palomo 等31對不同載體固定化脂肪酶 ( candi- da rugosa) 催化拆分不同底物進(jìn)行了研究，通過表面 吸附法得到的固定化酶對于 拆分結(jié)

25、構(gòu)簡單的底物 ( 丁酸乙酯) 比較有效，而離子吸附法得到的固定化酶對于復(fù)雜底物顯示出更高的選擇性。另外，對于 同一底物，可以通過酶固定化過程中采用不同載體 改變酶的 選 擇 方 向。如 拆 分 ( r，s ) -2-苯 基-2-丁 酰 基乙酸反應(yīng)中，對 candida rugosa lipase ( crl) 采用 吸附法固定于疏水載體上優(yōu)先選擇 s-對映體反應(yīng)，而采用共價(jià)法固定于戊二醛 改性載體上優(yōu)先選擇 r-對映體反應(yīng)，且 e 400，酶的立體專一性發(fā)生了 改變。andrade 等32 采 用 3 種不同的方法將 burk- holderia cepacia lipase 固定在超順磁納米

26、顆粒上( 堿性條件下 fe3 o4 用氨丙基三乙 氧基硅烷改性后所 得) ，分別通過物理吸附法、通過 4-羧基苯甲醛化學(xué)吸附法、通過戊二醛化學(xué)吸附法，將固定化酶用于動力學(xué)拆分( r，s) -2-溴-1-( 苯基) 乙醇，發(fā)現(xiàn)固定化酶 選擇 性得到了很大提 高，e 200，而 自 由 酶 僅 有 e 30。其中用戊二醛化學(xué)吸附法固定脂肪酶對溫 度穩(wěn)定性最好，且產(chǎn)率最高。chaubey 等33采用 包 埋 法、共 價(jià) 結(jié) 合 法、包 埋-共價(jià)結(jié)合 3 種方法固定脂肪酶( arthrobacter sp) ，載 體為含磁性 f2 o3 和不含磁性 f2 o3 的氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙腈共聚產(chǎn)物

27、，對氟西汀中間體進(jìn)行拆分，3 種 方 法 得 到 ee 值 均 達(dá) 到 99% ，e 值 相 比 自由酶提高了 3 4 倍，固定化后立體專一性均未改 變。yang 等34 將脂肪酶 ral( rhizopus arrhizus li- pase) 分別采用共價(jià)結(jié)合法固定于環(huán)氧樹脂和包埋 法固定于疏 水 性 改 性 ( 乙烯基和甲基丙 烯 基) 的 凝 膠，主要的立體專一性未改變，仍 是 優(yōu) 先 對 r 底 物 ?；?，選擇性相比自由酶得到提高，其中共價(jià)結(jié)合固定后對映體選擇率達(dá)到 e = 99，但固定化后活性均 有所下降。綜上可知，固定化脂肪酶采用的載體大多是聚 丙烯酸樹脂、聚甲基丙烯酸、環(huán)氧樹脂

28、及帶有功能基 團(tuán)的共聚物，另外一些功能基團(tuán)化 ( 如 氨 基、醛 基、 環(huán)氧基) 的離子交換樹脂和無機(jī)材料也是常用的固3 4結(jié)束語隨著醫(yī)藥等行業(yè)的迅速發(fā)展，利用固定化酶技 術(shù)來獲得高附加值的手性分子越來越引起科研工作 者的關(guān)注。其中固定化載體材料的選擇是這一技術(shù) 的關(guān)鍵之一。目前商業(yè)級固定化脂肪酶的載體材料 主要是一些便宜、易于工業(yè)化生產(chǎn)的功能化聚合物 載體( 如 novozyme 435 采用聚丙烯酸樹脂) 和 無 機(jī) 載體等。但固定化載體影響脂肪酶催化性能的機(jī)理 目前還沒有明確定論，同時(shí)商品化固定化脂肪酶的 價(jià)格仍較高，還難于大規(guī)模應(yīng)用于手性化合物的拆 分。載體材料的化學(xué)性質(zhì)和物理結(jié)構(gòu)直接

29、影響其與 酶分子之間的相互作用，以及酶分子的催化微環(huán)境。 因此，根據(jù)脂肪酶手性拆分的機(jī)理，研究和設(shè)計(jì)新型 的功能化載體材料，從而提高固定化脂肪酶手性拆 分性能將具有重要的使用和科研意義，尤其是對于 藥物合成等領(lǐng)域。4參考文獻(xiàn):1徐天聞，賈濤，許建和 非水介質(zhì)中脂肪酶催化的手性拆分研究進(jìn)展j 生物加工過程，2005，3( 4) : 1-8 cabrera z，gutarra m l，guisan j m，et al highly enanti-oselective biocatalysts by coating immobilized lipases with polyethyleneimine

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41、 ment in siliceous mesocellular foamj chem mater，2006，18: 643-64931 palomo j m，fernandez-lorente g，mateo c，et al modu- lation of the enantioselectivity of lipases via controlled im- mobilization and medium engineering: hydrolytic resolu- tion of mandelic acid estersj enzyme and microbial technology，

42、2002，31: 775-783( 下轉(zhuǎn)第 1852 頁)78910 engstrm k，nyhln j，sandstrm a，et al directed evo-lution of an enantioselective lipase with broad substrate scope for hydrolysis of -substituted estersj j am chem soc，2010，132: 7038-704211 andrade l h，barcellos t kinetic resolution of boron- containing chiral alcohol

43、sj org lett，2009，14: 3052-305512 de souza r，antunes o c，kroutil w，et al kinetic resolu- tion of rac-1-phenylethanol with immobilized lipases: a critical comparison of microwave and conventional heating protocolsj j org chem，2009，74: 6157-616213 王普，祝加男，何軍邀 脂肪酶 novozyme 435 選擇性催 化 2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯合成 s-(

44、 + ) -2，2-二 甲 基環(huán)丙烷甲酸j 催化學(xué)報(bào)，2010，31( 6) : 651-65514 strohalm h，dold s，pendzialek k，et al preparation ofpassion fruit-typical 2-alkyl ester enantiomers via lipase-catalyzed kinetic resolutionj j2010，58: 6328-6333agric food chem，15 cabrera z，fernandez-lorente g，fernandez-lafuent r，etal novozym 435 disp

45、lays very different selectivity com- pared to lipase from candida antarctica b adsorbed on other hydrophobic supportsj journal of molecular ca- talysis b: enzymatic，2009，57: 171-17616 vallin k s a，posaric d w，hamer z efficient che- moenzymatic dynamic kinetic，resolution of 1-heteroarylethanolsj j or

46、g chem，2009，74: 9328-933617 khor g k，sim j h，kamaruddin a h，et al mohamad hekarl uzir thermodynamics and inhibition studies of li- pozyme tl im in biodiesel production via enzymatic transesterification j bioresource technology，2010，101: 6558-656118 cai j f，guan z，he y h the lipase-catalyzed asymmet-

47、 ric c-c michael additionj china journal of molecular catalysis b: enzymatic，2011，68: 240-24419 ribeiro a s，oliveira m v，rebocho s f，et al enzymaticproduction of decyl acetate: kinetic study in n-hexaneiii synthesis of all 4 stereoisomers of 2-methyl-4-hydroxy-5-aminopentanoic acid ( 2-me-4-oh-dava)

48、 j tetra- hedron asymmetry，1993，4( 1) : 121-13113 debendra k mohapatra stereoselective synthesis of the densely functionalized c1 c9 fragment of amphidinol- ides c and f j tetrahedron lett，2009，50( 46) : 6276-627914 tomioka k，cho y s，sato f，et al stereoselective reac- tions 14 efficient enantioselec

49、tive construction of quater- nary carbon centers by the sequential dialkylation of ( s) - -( trityloxy) methyl-butyrolactone synthesis of opti- cally active ，-disubstituted -butyrolactones j j org chem，1988，53( 17) : 4094-409815 kimura m，ezoe a，tamaru y，et al novel and highly re- gio and stereoselec

50、tive nickel-catalyzed homoallylation of benzaldehyde with 1，3-dienes j j am chem soc，1998，120( 16) : 4033-403416 armstrong a，pyrkotis c synthetic studies on amphidinol- ides c and f: synthesis of the c18 c29 segment of am- phidinolide f j tetrahedron lett，2009，50( 26) : 3325-332817 saito s，morikawa

51、y，moriwake t synthesis of opticallypure 2，3，4，5-substituted tetrahydrofurans from a bis-al-lylic framework via an osmylation-haloetherification se- quence j synlett，1990( 9) : 523-52418 zhang h，mootoo r d acetal templates for the synthesis of trans-2，5-disubstituted tetrahydrofurans j j org chem，199

52、5，60( 35) : 8134-813519 he a，sutivisedsak n，spilling c d stereoselective syn- thesis of cyclic ethers via the palladium-catalyzed intra- molecular addition of alcohols to phosphono allylic car- bonates j org lett，2009，11( 14) : 3124-312720 inoue k，sawada a，shibata i，et al indium( iii) chloride- sodi

53、um borohydride system: a convenient radical reagent for an alternative to tributyltin hydride system j j am chem soc，2002，124( 6) : 906-90721 nicholas a m，b l pagenkop gram scale synthesis of the c( 18) c( 34) fragment of amphidinolide c j org lett，2011，13( 4) : 572-57522 palmer c，morra n a，stevens a c，et al increased yields and simplified purification with a second-generation cobalt catalyst for the oxidative formation of trans-thf ringsj org