食品科學(xué)和生物技術(shù)專業(yè)原創(chuàng)畢業(yè)論文

1、論文題目：論文題目：大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫檢測(cè)方法的建立大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫檢測(cè)方法的建立 學(xué)院及專業(yè)：學(xué)院及專業(yè)：食品與生物工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 食科食科 本科生：本科生： 指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師： 摘摘要要 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)物理、化學(xué)方法的對(duì)比及探索改進(jìn)，找出一種檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)源 過(guò)氧化氫的模型方法。 本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌突變體為研究對(duì)象，首先以 30%的 h2o2為研究對(duì)象，確定 其原液的濃度，然后通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶 酚紅法、熒光法、硫酸鈦法三種不 同方法繪制出不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出20 個(gè)大腸 桿菌抗氧化基因突變體菌株在同一生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)內(nèi)源過(guò)氧化氫的釋放量。 結(jié)果顯示：30%

2、的 h2o2原液濃度為 6.9m，三種檢測(cè)方法繪制出來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 的線性相關(guān)系數(shù)分別是 0.9963、0.9936、0.997，根據(jù)辣根過(guò)氧化物酶 酚紅 法和熒光法不同的線性關(guān)系計(jì)算出來(lái)不同菌株h2o2的釋放量都有明顯的差異， 范圍在 1m10m 之間。硫酸鈦法的檢測(cè)區(qū)間在 10m500m 之間，明顯檢 測(cè)不到大腸桿菌抗氧化基因突變體菌株中內(nèi)源過(guò)氧化氫的釋放量。 通過(guò)分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)三種方法中辣根過(guò)氧化物酶 酚紅法和熒光法都可以檢 測(cè)到大腸桿菌抗氧化基因突變體菌株中內(nèi)源過(guò)氧化氫的釋放量，硫酸鈦法檢測(cè) 不到，但是辣根過(guò)氧化物酶 酚紅法比較繁瑣且需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，而 熒光法的靈敏度比較高，操作也比

3、較簡(jiǎn)單方便。 關(guān)關(guān) 鍵鍵 詞：詞：內(nèi)源過(guò)氧化氫，檢測(cè)方法，大腸桿菌，突變體 subject: measure assays establishment of endogenous hydrogen peroxide in escherichia coli college and specialty: college of food 8.5u/ml）), 氫氧化鈉（1m，10ul） ，大腸桿菌各種突變體（如下表） 標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào)突變體突變體標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào)突變體突變體標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào)突變體突變體標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào)突變體突變體 1 2 3 4 5 as240 as291 as356 as396 as290 6 7 8 9 10

4、mc4100 mc4100ahp:kan gs022 lc70 lc74 11 12 13 14 15 ji360 ji361 ji362 ji367 ji370 16 17 18 19 20 ji372 ji374 ji377 ab1157 mg1655 3.1.2 儀器儀器 酸度計(jì)，水浴鍋，超凈工作臺(tái)，722s 可見(jiàn)分光光度計(jì)，tgl-18c 型高速臺(tái)式 離心機(jī)，chas 氣浴恒溫振蕩器，ldzx-50kb 立式壓力蒸汽滅菌器 3.1.3 溶液的配制溶液的配制 配制 40mm 的 nacl、ph=7.0 10mm 的磷酸鉀溶液、0.1g/l 酚紅溶液和 hrpo;8.5u/ml 辣根過(guò)氧化

5、物酶, 1m，10ul 的氫氧化鈉溶液，1m 的鹽酸溶液。 注：氯化鈉，磷酸鉀溶液和酚紅溶液一次各配注：氯化鈉，磷酸鉀溶液和酚紅溶液一次各配 500ml 備用，辣根過(guò)氧化物酶在使用前加入。備用，辣根過(guò)氧化物酶在使用前加入。 3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 使用緩沖液配制酚紅-過(guò)氧化物酶試劑，包含 nacl(40mm)、磷酸鉀（ph=7.0 10mm） 、酚紅（0.1g/l）和辣根過(guò)氧化物酶（hrpo;8.5u/ml）,使用前加入酚紅和 hrpo 到緩沖液中。每 1.0ml 酚紅試劑加入 0.5ml 樣品溶液，h2o2標(biāo)準(zhǔn)液也類似 處理，混勻并 25保溫 5 分鐘，加入氫氧化鈉（1m，10ul）使

6、溶液 ph 為 12.5 并 且有穩(wěn)定染色，當(dāng)測(cè)定大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫含量時(shí)，要先離心，去上清液，然 后用無(wú)菌水重懸，放置 10min，再按 2:：1 與緩沖液混勻。水浴后，調(diào) ph 時(shí)，用 對(duì)照調(diào)，然后每個(gè)樣品按比例加入氫氧化鈉，確保每個(gè)樣品中氫氧化鈉含量相同， 在可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè) a610。 3.1.4.1.確定酚紅法測(cè)定時(shí)的上下限確定酚紅法測(cè)定時(shí)的上下限 將過(guò)氧化氫原液按梯度稀釋：100mm，10 mm，1 mm，0.1 mm，0.01 mm，0.001 mm，并測(cè)其吸光值（a610） 。確定上下限（見(jiàn)表 3-1） 3.1.4.2 用普通酚紅法制標(biāo)準(zhǔn)曲線用普通酚紅法制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在上下限

7、之間稀釋幾個(gè)濃度梯度，并在可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè)其吸光值 （a610） 。 （見(jiàn)表 3-2 和圖 3-3） 3.1.4.2 用改進(jìn)酚紅法制標(biāo)準(zhǔn)曲線用改進(jìn)酚紅法制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在上下限之間稀釋幾個(gè)濃度梯度，并在可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè)其吸光值 （a610） 。 （見(jiàn)表 3-4 和 3-5） 3.1.4.3 普通的酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫普通的酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫 原始菌體使用無(wú)菌水重懸，然后和甘油按比例混勻，冰箱冷凍保存。在 lb 培養(yǎng)基上接種后 37振蕩培養(yǎng)，12 小時(shí)后看菌體的生長(zhǎng)情況開(kāi)始下一步實(shí)驗(yàn)。 菌體培養(yǎng)好后，將各突變體的菌懸液調(diào)至吸光值為 1.070 左右的統(tǒng)一濃度，調(diào)好 后，菌懸液在

8、 3500 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心 10min，去上清，用無(wú)菌水重懸，然后離心除去 菌體，上清中加酚紅-過(guò)氧化物酶試劑，然后按比例每 1.0ml 酚紅試劑加入 0.5ml 樣品溶液，混勻并 25保溫 5 分鐘，加入氫氧化鈉（1m，10ul）使溶液 ph 為 12.5 并且有穩(wěn)定染色，測(cè)定上清在 a610 條件下的吸光值。 （見(jiàn)表 3-6） 3.1.4.4 改進(jìn)的酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫改進(jìn)的酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫 菌體培養(yǎng)好后，將各突變體的菌懸液調(diào)至吸光值為 1.070 左右的統(tǒng)一濃度， 調(diào)好后，菌懸液在 3500 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心 10min，去上清，用無(wú)菌水重懸，振蕩 2min，再放置 10m

9、in 后，加酚紅-過(guò)氧化物酶試劑，然后按比例每 1.0ml 酚紅試劑 加入 0.5ml 樣品溶液，混勻并 25保溫 5 分鐘，加入氫氧化鈉（1m，10ul）使溶 液 ph 為 12.5 并且有穩(wěn)定染色（調(diào) ph 時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)空白進(jìn)行，記下調(diào)至 12.5 時(shí) 需要的氫氧化鈉的量，對(duì)其它樣品按相同比例加入氫氧化鈉溶液） ，然后離心除 去菌體，測(cè)定上清在 a610 條件下的吸光值（見(jiàn)表 3-7） 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表表 3-1 不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液在不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液在 610nm 處的吸光值處的吸光值 table 3-1 a610 of different concentra

10、tion gradient stock solution of hydrogen peroxide 梯度梯度100m 10m 1m100m10m1m 吸光值吸光值 吸光值吸光值 平均值平均值 1.697 1.640 1.667 2.010 1.921 1.966 1.959 1.963 1.961 0.408 0.669 0.539 0.080 0.085 0.083 0.006 0.002 0.004 該表顯示出酚紅法的檢測(cè)下限低，濃度為 1m 時(shí)能測(cè)量出。 表表 3-2 不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液在不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液在 610nm 處的吸光值處的吸光值 table 3-2 a610

11、 of different concentration gradient stock solution of hydrogen peroxide 500m100m80m60m40m20m 1.6250.5000.4210.3490.2590.152 該表顯示出濃度在 500m 和 20m 之間時(shí)吸光值成線性關(guān)系。 20406080100 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 y=0.0043x+0.0788 r 2=0.9937 圖圖 3-3 20 至至 100m 濃度梯度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度梯度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線 fig. 3-

12、3 the standard curve of hydrogen peroxide at concentration gradient from 20 to 100m 表表 3-4 不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液不同濃度梯度的過(guò)氧化氫原液 610nm 下的吸光值下的吸光值 table 3-4 a610 of different concentration gradient stock solution of hydrogen peroxide 該表顯示出濃度在 100m和 1m之間時(shí)吸光值成線性關(guān)系。 在上下限之間取 7 個(gè)濃度梯度，測(cè)吸光值 020406080100 0.0 0.1 0.2 0.

13、3 0.4 0.5 0.6 0.7 y=0.0059x+0.0108 r2=0.9971 圖圖 3-5 0-100m 濃度梯度的吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度梯度的吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線 fig. 3-5 the standard curve of concentration gradient from 0 to 100m 濃度濃度 梯度梯度 100m80m60m40m20m10m1m 吸光吸光 值值 0.6080.4610.3750.2480.1340.0570.022 表表 3-6 普通酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫普通酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫 table 3-6 common determinatio

14、n of phenol red endogenous hydrogen peroxide in the sample a a610 610 h h2 2o o2 2的釋放量（的釋放量（mm）大腸桿菌菌種大腸桿菌菌種a a420 420( (稀 稀 釋前釋前) ) a a420 420( (稀 稀 釋后釋后) ) 平行平行 1 1平行平行 2 2平行平行 1 1平行平行 2 2 as240 1.6251.0800.0180.0191.761.93 as291 1.7471.0780.0150.0131.250.92 as356 1.8251.0790.0090.0130.240.92 as396

15、 1.8391.0760.0220.0212.442.27 as290 1.8181.0740.0220.0202.442.1 mc4100 1.6741.0720.0190.0151.931.25 mc4100 ahp:kan 1.6931.0810.0110.0120.580.75 gs022 1.9761.0810.0170.0191.591.93 lc70 1.5511.0720.0240.0212.782.27 lc74 1.1841.0700.0190.0191.931.93 ji360 1.6361.0730.0050.004-0.4-0.6 ji361 1.8341.0700.

16、0090.0110.240.58 ji362 1.9901.0720.0250.0282.953.46 ji367 1.1641.0710.0340.0364.474.81 ji370 1.5271.0720.0320.0324.144.14 ji372 1.5421.0720.0330.0324.314.14 ji374 1.3051.0760.0270.0293.293.63 ji377 1.1961.0750.0260.0273.123.29 ab1157 1.3171.0690.0190.0201.932.1 mg1655 1.3451.0700.0230.0232.612.61 注：

17、注： 代表負(fù)值，即內(nèi)源過(guò)氧化氫的量不在硫酸鈦法的測(cè)量范圍內(nèi)代表負(fù)值，即內(nèi)源過(guò)氧化氫的量不在硫酸鈦法的測(cè)量范圍內(nèi) 表表 3-7 改進(jìn)酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫改進(jìn)酚紅法測(cè)定樣品中內(nèi)源過(guò)氧化氫 table 3-7 the improved phenol red method for determining endogenous hydrogen peroxide in samples 菌體菌體 標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào) 重懸后未離心重懸后未離心 a610 重懸后離心重懸后離心 a610 大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫含量大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫含量 （m） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0.21

18、6 0.239 0.305 0.228 0.268 0.099 0.134 0.217 0.281 0.180 0.318 0.236 0.281 0.057 0.038 0.035 0.038 0.022 0.071 0.061 0.035 0.073 0.063 0.072 0.019 0.081 7.831 4.610 4.102 4.610 1.898 10.203 8.508 4.102 10.542 8.847 10.373 1.390 11.898 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 2 4 6 8 10 12 14 m 圖圖

19、3-8 酚紅法測(cè)大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫的含量酚紅法測(cè)大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫的含量 fig. 3-8 determine the content of endogenous hydrogen peroxide in escherichia coli using phenol red method 3.3 結(jié)果分析結(jié)果分析 （1）由表 3-1 和 3-2 知上限為 100m 左右，下限為 1m 左右。 （2）由表 3-3 和表 3-5 知，普通酚紅法做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性很好，改進(jìn)的酚 紅法做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線比普通酚紅法更精確。 （3）由表 3-6 知，不同的大腸桿菌突變體菌株釋放 h2o2的能力是不同的，與

20、 野生型菌株 mg1655 相比，都有明顯的增加或者減少，這說(shuō)明對(duì)于不同的基因突 14 15 16 17 18 19 20 0.173 0.286 0.306 0.221 0.192 0.143 0.252 0.029 0.036 0.021 0.020 0.023 0.098 0.029 3.084 4.271 1.729 1.559 2.068 14.780 3.085 變體來(lái)說(shuō)，基因突變對(duì) h2o2的釋放量是有影響的。用普通酚紅法測(cè)量?jī)?nèi)源過(guò)氧化 氫時(shí)，由于內(nèi)源過(guò)氧化氫的量較低，不能測(cè)出來(lái)。數(shù)據(jù)結(jié)果偏小，數(shù)據(jù)不太穩(wěn)定， 有負(fù)值的情況，原因可能是方法有問(wèn)題和菌懸液稀釋時(shí)沒(méi)有稀釋到統(tǒng)一的精確濃

21、 度，菌懸液離心重懸，重懸的時(shí)間短，過(guò)氧化氫還沒(méi)有進(jìn)入重懸水中，所以測(cè)得 的過(guò)氧化氫吸光值偏低，即濃度偏低，針對(duì)這些問(wèn)題，對(duì)辣根過(guò)氧化物酶酚紅法 進(jìn)行改進(jìn)，并在稀釋菌懸液時(shí)盡可能將其稀釋到固定的統(tǒng)一吸光值。 （4）由表 3-7 知，改進(jìn)酚紅法可以測(cè)得突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫的量。說(shuō)明菌體 中過(guò)氧化氫的量不易釋放到外面，重懸離心后震蕩有助于過(guò)氧化氫的釋放，并且 重懸后沒(méi)有離心除去菌體時(shí)吸光值比離心除去菌體時(shí)吸光值大。這說(shuō)明，當(dāng)測(cè)吸 光值時(shí)，菌體能影響測(cè)得的結(jié)果。 第第 4 章章 熒光法測(cè)定大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫熒光法測(cè)定大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫 4.1 材料和方法材料和方法 4.1.1 試劑試劑 ar，二甲

22、基亞砜，磷酸鉀溶液（ph=7.8） ，辣根過(guò)氧化物酶，30%過(guò)氧化氫 4.1.2 儀器儀器 722s 可見(jiàn)分光光度計(jì)，tgl-18c 型高速臺(tái)式離心機(jī)，chas 氣浴恒溫振蕩器， ldzx-50kb 立式壓力蒸汽滅菌器，hitachi f-4500 型熒光光譜儀，超凈工作臺(tái)。 4.1.3 溶液配制溶液配制 ar 溶液：1mg 的 ar 溶解在 0.78ml 的二甲基亞砜中，取 0.75ml 該溶液至 18ml 的 50mm 的磷酸鉀溶液中（ph=7.8） hrp 溶液：hrp 溶解于 50mm 的磷酸鉀溶液中（ph=7.8） ，配成濃度為 0.02mg/l 的溶液。 4.1.44.1.4 實(shí)驗(yàn)

23、方法實(shí)驗(yàn)方法 4.1.4.14.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 （1）配制不同濃度梯度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，梯度為 100m，40m，20m，10m，1m （2）用熒光光譜儀掃描出最大激發(fā)波長(zhǎng)為525nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)595nm，在 最大發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)測(cè)上述濃度梯度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度 （3）在大致的線性范圍內(nèi)配不同的濃度梯度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)其熒光 強(qiáng)度。 （4）根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 4.1.4.24.1.4.2 熒光法測(cè)突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫熒光法測(cè)突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫 0.45ml樣品與0.25ml的hrp溶液和0.25ml的ar溶液混合，然后在最大發(fā)射波 長(zhǎng)時(shí)測(cè)上述濃度梯度的過(guò)氧化

24、氫標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度。 4.24.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)濃度梯度為100m，40m，20m，10m，1m的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行熒光光 譜分析，結(jié)果有兩個(gè)最大激發(fā)波長(zhǎng)，525nm和256nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為595nm。 表表4-14-1 濃度梯度梯度為濃度梯度梯度為1 1m100100m的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液熒光強(qiáng)度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液熒光強(qiáng)度 tabletable 4-14-1 thethe fluorescencefluorescence intensityintensity ofof concentrationconcentration gradientgradient forfor 1 1m m 1

25、00100m m hydrogenhydrogen peroxideperoxide standardstandard solutionsolution 濃度梯度濃度梯度100m40m20m10m1m 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度9921773065045790 該表顯示1m到100m之間不成線性關(guān)系 表表4-24-2 濃度梯度為濃度梯度為0.80.8m m10m m的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得其熒光強(qiáng)度的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得其熒光強(qiáng)度 tabletable 4-24-2 thethe fluorescencefluorescence intensityintensity ofof concentrationc

26、oncentration gradientgradient forfor 1 1m m 100100m m hydrogenhydrogen peroxideperoxide standardstandard solutionsolution 濃度梯度濃度梯度10m 8m6m4m2m1m0.8m 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度32601146976656385256220 該表顯示0.8m到8m之間成線性關(guān)系，濃度在10m時(shí)線性很差 0123456789 200 400 600 800 1000 1200 y=132.64x+124.58 r 2=0.9936 圖圖4-34-3熒光法標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光法標(biāo)準(zhǔn)曲線

27、fig.4-3fig.4-3 thethe fluorescencefluorescence methodmethod standardstandard curvecurve 表表4-44-4 用熒光法在發(fā)射波長(zhǎng)為用熒光法在發(fā)射波長(zhǎng)為591nm591nm測(cè)突變體的內(nèi)源過(guò)氧化氫測(cè)突變體的內(nèi)源過(guò)氧化氫 tabletable 4-44-4 measuremeasure mutantmutants s endogenousendogenous hydrogenhydrogen peroxideperoxide atat emissionemission wavelengthwavelength 591

28、nm591nm usingusing fluorescencefluorescence methodmethod 菌體標(biāo)號(hào)菌體標(biāo)號(hào)離心重懸后用熒光法測(cè)得熒光離心重懸后用熒光法測(cè)得熒光 強(qiáng)度值強(qiáng)度值 算出突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫的含算出突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫的含 量量 y=132.64x+124.58 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1181 971 740 665 596 918 1116 1046 1013 907 1047 935 742 1030 867 841 850 750 705 681 7.965 6.381 4.640

29、 4.074 3.554 5.982 7.475 6.947 6.698 5.898 6.954 6.110 4.655 6.826 5.597 5.401 5.470 4.715 4.376 4.195 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m 圖圖 4-5 不同大腸桿菌菌株內(nèi)源過(guò)氧化氫含量柱狀圖不同大腸桿菌菌株內(nèi)源過(guò)氧化氫含量柱狀圖 fig. 4-5 different e es sc ch he er ri ic ch hi ia a coli strains endogenous hydrogen p

30、eroxide content bar chart 4.3 結(jié)果分析結(jié)果分析 （1）在 595nm 下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度靈敏度最高。 （2）由表 4-2 知，濃度梯度梯度為 100m，40m，20m，10m，1m 時(shí)熒光 強(qiáng)度不成線性關(guān)系。由于熒光法靈敏度高，在高濃度時(shí)容易發(fā)生簇變，使熒光強(qiáng) 度變?nèi)酢?（3）由表 4-2 和表 4-3 知，當(dāng)濃度很低時(shí)，在濃度梯度為 10m，8m，6m，4m，2m，1m，0.8m 時(shí)，熒光強(qiáng)度成線性，且線性很好。 （4）由表 4-4 知，由于不同突變體的生長(zhǎng)速度不同，用熒光法對(duì)不同突變 體的過(guò)氧化氫水平進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同突變體過(guò)氧化氫含量

31、有明顯差 別。如上表 as240 突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫濃度最大，as290 突變體內(nèi)源過(guò)氧化氫濃 度最大。 第第 5 章章 結(jié)論結(jié)論 （1）h2o2極不穩(wěn)定，見(jiàn)光后易發(fā)生分解，所以一般情況下要用棕色試劑瓶 避光保存，以免造成結(jié)果的不準(zhǔn)確，我們?cè)诖_定 h2o2原液濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)它的檢 測(cè)出來(lái)的濃度比實(shí)際濃度要低，這可能有以下幾個(gè)原因：a.過(guò)氧化氫在運(yùn)輸過(guò)程 中沒(méi)有避光保存造成的；b.放置時(shí)間較長(zhǎng) c.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中見(jiàn)光分解造成的。 （2）硫酸鈦法檢測(cè)過(guò)氧化氫時(shí)，檢測(cè)范圍區(qū)間在 10m100m 之間，而大 腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫的釋放量在 10m 以下，所以無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。因此，使用硫 酸鈦法檢測(cè)內(nèi)源過(guò)氧化

32、氫時(shí)有局限性，不能對(duì)低濃度的內(nèi)源過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè)。 （3）因?yàn)榧?xì)菌釋放的 h2o2大多數(shù)在細(xì)胞壁上，有一部分在培養(yǎng)基中，所以 我們對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了調(diào)整，離心后和辣根過(guò)氧化物酶-酚紅試劑反應(yīng)，水浴后 加入氫氧化鈉終止反應(yīng)，然后離心用上清測(cè) a610。這樣辣根過(guò)氧化物酶-酚紅試 劑可以與細(xì)胞壁上的 h2o2充分反應(yīng)也避免了培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 （4）熒光法具有很高的靈敏性，且當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與 該物質(zhì)的濃度通常會(huì)有良好的正比關(guān)系。根據(jù)辣根過(guò)氧化物酶酚紅法測(cè)得的實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出大腸桿菌內(nèi)源 h2o2的釋放量大約在 10m 以下，所以我們?cè)诖?腸桿菌內(nèi)源 h2o2的釋放量附近做

33、了一組濃度梯度，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度與濃度之間有 很好的線性關(guān)系。熒光法檢測(cè)過(guò)氧化氫的一個(gè)最大的優(yōu)點(diǎn)就是靈敏度比較高而且 操作也比較簡(jiǎn)單。 （5）通過(guò)酚紅法和熒光法的對(duì)比，60%突變體的內(nèi)源過(guò)氧化氫含量使用兩種 方法測(cè)量時(shí)差別不大，在 1-2m 左右（如編號(hào)為 1、2、3、4、7、8、9、10、15、20 的突變株），其它的由于實(shí)驗(yàn)誤差的存在， 內(nèi)源過(guò)氧化氫的含量有些差別，但總的來(lái)說(shuō)，無(wú)論是高還是低，使用兩種方法測(cè) 得內(nèi)源過(guò)氧化氫含量時(shí)總的趨勢(shì)是相同的。這說(shuō)明不同的大腸桿菌突變株內(nèi)源過(guò) 氧化氫的釋放量是有明顯的差異的，不論用那一種方法檢測(cè)，結(jié)果都是一致的。 （6）使用酚紅法和熒光法時(shí)，由于酚紅法和熒光

34、法在測(cè)定大腸桿菌內(nèi)源過(guò) 氧化氫時(shí)的靈敏度不同，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不完全相同。 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 1 張亞彥，林荔，蘇必桔碘化鉀電藍(lán)分光光度法測(cè)定微量過(guò)氧化氨j 分析試驗(yàn)室， 2001，20：41-42， 2 樊義峰過(guò)氧化氫色度測(cè)定方法研究明黎明化工。1992，31：31-33 3 kiassen nv marchington d，mcgowant h c eh20determination by the 13 method and by kmn04titrationanalchem1994，66：2921-2925 4 周增枇，陳健范小芹，李芳流動(dòng)注射分析光度法測(cè)定過(guò)氧化氫j 中國(guó)紡織大學(xué)學(xué) 報(bào)1

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