利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子.doc

1、利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院摘要:本實(shí)驗(yàn)通過使用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,通過定向克隆相連,重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌.然后對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了篩選和鑒定.從所得的三個轉(zhuǎn)化子中,經(jīng)過pcr、瓊脂糖電泳鑒定重組質(zhì)粒大小與酶切后電泳的鑒定,最終從三個轉(zhuǎn)化子中篩選出一個重組子.關(guān)鍵詞:質(zhì)粒提取 凝膠電泳 pcr 酶切1 引言質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn).再實(shí)際工作中,由于量少,連接產(chǎn)物沒有也不可能再經(jīng)過分離純化而獲得純的重組質(zhì)粒,連接產(chǎn)物中混有載體自連而成的空載體、載體與目的片段連接而成的目的重組質(zhì)粒和載體與非目的片段連接而成的非目的重組質(zhì)粒.同時,細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率極低,進(jìn)行轉(zhuǎn)化后,絕大部

2、分細(xì)菌是沒有被轉(zhuǎn)化的.因此有必要對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選和鑒定.首先,通過抗生素抗性從轉(zhuǎn)化后代中篩選出轉(zhuǎn)化子.將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選.只有含有相應(yīng)抗性的抗生素抗性基因才能生長繁殖形成菌落.其次,通過菌落直接pcr從轉(zhuǎn)化子中篩選出轉(zhuǎn)基因生物,擴(kuò)增出特殊目的基因片段,判斷所得轉(zhuǎn)化子是否為重組子.但因?yàn)閜cr技術(shù)的高靈敏性,往往會產(chǎn)生假陽性結(jié)果.因此有必要進(jìn)一步進(jìn)行鑒定.最后從候選重組子中提取質(zhì)粒,通過凝膠電泳觀察質(zhì)粒的大小,再利用限制性內(nèi)切酶切割大小符合的質(zhì)粒.電泳觀察酶切片段的大小是否與預(yù)期的一致.2 材料與方法2.1 材料:實(shí)驗(yàn)十所得轉(zhuǎn)化子2.2 用具:儀器:pcr儀,恒溫?fù)u床

3、,臺式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋,瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀,超凈臺,移液槍,1.5ml離心管2.3 試劑rtaq酶;10pcr buffer;dntp mixtures(10mm)前向引物p1:5-cgcgaattcatggcagatcag-3反向引物p2:5-agagcggccgcctttgccatcataactttgacacaaa-3限制性核酸內(nèi)切酶hind;ddh2o;限制性核酸內(nèi)切酶緩沖液:10m buffer,0.5tbe buffer;eb母液;質(zhì)粒提取試劑;酶切試劑;酶反應(yīng)終止液;1%瓊脂糖;無菌蒸餾水;6loading buffer;礦物油.溶液:50m mol/

4、l葡萄糖,10m mol/l edta,25m mol/l tris-hcl(ph8.0),用前加溶菌酶4mg/l;溶液:naoh溶液(內(nèi)含1%sds),0.2mol/l,現(xiàn)配現(xiàn)用;溶液(ph4.8):60ml 5mol/l乙酸鉀,11.5ml冰醋酸,28.5ml h2o;lb液體培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨0.25g,酵母提取物0.25g,nacl 0.5g,加入50ml蒸餾水使其完全溶解.高溫蒸汽滅菌(1.034mpa,1530min),待培養(yǎng)基降溫至5560時,加入50l的100g/ml的氨芐青霉素母液,搖勻.按照比例配置培養(yǎng)基.2.2 方法2.2.1 轉(zhuǎn)化子的篩選選出在實(shí)驗(yàn)十中,lb固體培養(yǎng)基

5、上生長出來的白色菌落.選取三個,做好標(biāo)記.2.2.2 菌落直接pcr用無菌牙簽分別挑取3個白色單菌落,在編好號碼的pcr反應(yīng)管中的底部分別涂抹,然后在pcr管仲配制20l反應(yīng)體系.反應(yīng)體系如下:dna template buffer 用牙簽挑取菌落在pcr管中涂抹10pcr buffer 2ldntp mixture 1.6lforward primer(p1) 0.8lreverse primer(p2) 0.8lrtaq enzyme 0.2lddh2o 14.6l所有試劑按量仔細(xì)添加后,輕輕混勻,稍離心即可.為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā),最后添加20l礦物油.pcr儀的參數(shù)設(shè)置94 4min9

6、4 30s62 30s 35 cycles72 30s72 5min瓊脂糖凝膠電泳檢測:反應(yīng)結(jié)束后,取5l產(chǎn)品,加入1l 6loading buffer,混勻后點(diǎn)樣,電泳15min.觀察產(chǎn)物帶.2.2.3 質(zhì)粒提取及大小鑒定:照上述電泳的結(jié)果,用無菌牙簽從平板上挑選pcr反應(yīng)陽性菌落,與沒有檢測出特異性條帶的假陽性菌落,接種于含amp 50g/ml的5ml lb液體培養(yǎng)基中,37下震蕩培養(yǎng)12h.2.2.3.1 質(zhì)粒提取1.吸取1.4ml菌液至1.5ml離心管中.2.離心(8000rpm,1min),棄去上清液.3.加入150l溶液,用旋渦振蕩器充分懸浮菌體.4.加入200l溶液,加蓋后溫和顛

7、倒56次,直至透明狀.(此步驟在5分鐘內(nèi)完成)5.加入150l遇冷的溶液,加蓋后反復(fù)顛倒混勻,直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀,冰浴5分鐘.6.離心(14000rpm,10min,4),移取上清液于另一干凈離心管中.7.向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異丙醇(25:24:1),振蕩后均勻抽提,離心(14000rpm,5min),溶液將出現(xiàn)分層.8.移取上層水相溶液(約450l)于另一干凈離心管,加等體積氯仿,振蕩混勻抽提,離心(14000rpm,5min)9.移取上層水相溶液于另一干凈離心管,加入1/10體積的醋酸鈉(ph5.2)和2倍體積無水乙醇混勻,冰浴30min.10.離心(14000rpm,10m

8、in,4),倒掉上清液.11.加0.5ml預(yù)冷的70%酒精振蕩,洗dna沉淀一次,離心5分鐘,倒掉上層清液.12.真空抽干或自然風(fēng)干沉淀.13.加20l30l te緩沖液使dna完全溶解,降解rna雜質(zhì),室溫放置10min.用作瓊脂糖電泳.14.各取5l質(zhì)粒dna加入1l 6loading buffer混勻,進(jìn)行點(diǎn)樣.15.電泳條件:120v,25min.電泳完成后,膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并拍照記錄.2.2.3.2 dna濃度純度的測定1.空白測定:吸取200l蒸餾水至比色杯,進(jìn)行紫外光空白測定.2.dna測定:取質(zhì)粒dna 1l至一干凈的離心管,加入199l蒸餾水稀釋混勻,

9、所有溶液加入到干凈的比色杯中,測定260nm及280nm的光吸收值,記錄dna濃度及od260nm/od280nm比值.2.2.4 質(zhì)粒酶切鑒定酶切反應(yīng)液的配制hind 1l10m buffer 2ldna 5lddh2o 13l酶切反應(yīng)條件:37 水浴23h.電泳檢測:反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)液中加入2.2l 10loading buffer,混勻后停止酶切反應(yīng),所有22.2l樣品.均在同一點(diǎn)樣孔中.電泳條件:120v,45min.觀察遷移率,對比marker.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 pcr產(chǎn)物電泳圖圖 1菌落直接pcr產(chǎn)物電泳圖3.2 質(zhì)粒dna濃度純度的測定序號dna濃度(g/ml)od260/o

10、d28014356.18951.861923151.55861.89443.3 質(zhì)粒大小鑒定圖 2質(zhì)粒提取電泳圖3.4 質(zhì)粒酶切電泳鑒定圖 3質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論4.1 菌落直接pcr結(jié)果由于在前次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)基表面只長出了三個白色單菌落.于是,便直接挑取了三個菌落和陽性對照平板上的某個菌落直接pcr.結(jié)果如圖1所示.從圖1可以看出,編號為2的菌落并沒有擴(kuò)增出特異性條帶.為了排除在操作上因?yàn)樘羧∵^多菌落而導(dǎo)致不能擴(kuò)增出特異性條帶的情況,選取了轉(zhuǎn)化菌落平板上能擴(kuò)增出特異性條帶的1號和不能擴(kuò)增出特異性條帶的2號進(jìn)行搖菌.4.2 質(zhì)粒提取與大小鑒定由圖2可以看出,條帶位于20

11、00bp處,符合質(zhì)粒的理論大小.質(zhì)粒dna的圖譜上,兩個菌落均只看到了一個條帶,其余條帶很弱,并沒有顯示出來.在質(zhì)量相同的情況下,各種dna的遷移率為超螺旋線性開環(huán).由于dna分子的構(gòu)型不同,電泳時受到阻力不同,導(dǎo)致了泳動速率的不同.對于相對分子質(zhì)量相同的dna分子,其物理構(gòu)象越接近球狀,泳動時遇到的阻力就越小,速率越快.所以,共價閉合環(huán)狀超螺旋的構(gòu)象最接近球狀,速率最快.由于兩者都只看到了亮度不高的一個條帶,表明所提取的質(zhì)粒dna濃度不會很高.與旁邊的電泳條帶相比,本組得出的電泳圖譜說明,所含的開環(huán)dna較多,提取質(zhì)粒時的損傷可能較多.od260/od280值均在適合的范圍內(nèi),沒有過多的蛋白質(zhì)雜質(zhì)和已降解的dna.4.3 質(zhì)粒酶切電泳鑒定圖3為兩種質(zhì)粒dna酶切后電泳所得的圖譜.編號為1的菌落,在dna marker的250bp處有一個非常微弱的條帶.下部分接近2000bp的條帶,亮度較高.菌落2的圖譜上只出現(xiàn)了1個dna條帶,在marker 250bp附近并沒有出現(xiàn)相應(yīng)條帶,證明菌落直接pcr所得的結(jié)果沒錯.酶切所得的兩個片段分別為6131bp和219bp.由于質(zhì)量較小,cam5的片段的電泳速率要快很多. 在蛋白質(zhì)雜質(zhì)很多的情況下,也會在6131bp的片段下端出現(xiàn)第三個條帶.圖中只看到了兩個條帶,說明全部質(zhì)粒dna已經(jīng)被充分酶切,從