實(shí)驗(yàn)6 血糖的酶法測(cè)定20151109

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七七 葡萄糖葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖含量氧化酶法測(cè)定血糖含量 一一. 目的要求目的要求 掌握葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖含量的原理與方法。 了解臨床測(cè)定血糖的主要方法及意義。 二實(shí)驗(yàn)原理二實(shí)驗(yàn)原理 葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化下生成葡萄糖酸，同時(shí)生成過(guò)氧化 氫（H2O2），后者通過(guò)氧化氫酶催化供氫體（底物） 4-氨基安 替比林與酚的反應(yīng)，生成紫紅色的醌亞胺。產(chǎn)物顏色的深淺與血清 中葡萄糖的含量成正比。在同樣條件下，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和血 清樣品的吸光度（A）值，即可求出血清樣品中葡萄糖的含量。 三器材及試劑三器材及試劑 1. 器材器材: 酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀，移液槍。 2. 試劑試劑: u0.1mm

2、ol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱(chēng)取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH7.0， 用蒸餾水稀釋至1000ml. u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液（55.6mmol/L）：將葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器內(nèi)過(guò)夜后精確稱(chēng)取1000.0mg，于100ml容量瓶?jī)?nèi)以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，置冰箱可長(zhǎng)期保存。 u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液防于 100ml容量瓶?jī)?nèi)，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度。 三器材及試劑三器材及試劑 1. 器材器材: 酶標(biāo)板

3、，酶標(biāo)儀，移液槍。 2. 試劑試劑: u0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱(chēng)取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH7.0， 用蒸餾水稀釋至1000ml. u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液（55.6mmol/L）：將葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器內(nèi)過(guò)夜后精確稱(chēng)取1000.0mg，于100ml容量瓶?jī)?nèi)以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，置冰箱可長(zhǎng)期保存。 u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液防于 100ml容量瓶?jī)?nèi)，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度。

4、三器材及試劑三器材及試劑 2. 試劑試劑: 酚試劑：取酚1g溶于1000ml蒸餾水中。 酶試劑：取葡萄糖氧化酶1200U、過(guò)氧化氫酶1200U、4-氨基 安替比林10mg、疊氮鈉100mg，加上述磷酸鹽緩沖液80ml，調(diào) 節(jié)pH7.0，再以磷酸鹽緩沖液稀釋至100ml，置冰箱內(nèi)至少可存 放3個(gè)月。 酶-酚混合試劑：取等量酶試劑和酚試劑混合。置冰箱內(nèi)可存 放1個(gè)月。 3. 樣品樣品 新鮮兔血 四四實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 1.兔血清的制備兔血清的制備 兔全血標(biāo)本（每排一份）于37度水浴孵育1小時(shí)以上，于離心 機(jī)中3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清即可。 2.各組取酶標(biāo)條各組取酶標(biāo)條2個(gè)，編號(hào)后個(gè)，編號(hào)后按下

5、表操作，每組各設(shè)按下表操作，每組各設(shè)2個(gè)重復(fù)。個(gè)重復(fù)。 試劑（試劑（ul）測(cè)測(cè)定定孔孔標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)孔孔空白空白孔孔 血清血清5 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液5 蒸餾水蒸餾水5 血糖測(cè)定（工作液）血糖測(cè)定（工作液）195195195 混合各孔溶液，室溫反應(yīng)30min，以空白管調(diào)零，設(shè)測(cè)定波長(zhǎng)于 550nm，讀取測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管的A值。 五五計(jì)算計(jì)算 人人空腹血糖參考值：空腹血糖參考值：3.89-6.11mmol/L （標(biāo)準(zhǔn)液濃度（標(biāo)準(zhǔn)液濃度=10mmol/L） （mmol/L） 六六注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 避免血樣品溶血。 反應(yīng)體系中的過(guò)氧化氫酶易受維生素C、谷胱甘肽等的影響。 酶-酚混合試劑應(yīng)在臨用前配制

6、。 移液槍?zhuān)笜?biāo)儀的使用。 用移液槍混勻液體的時(shí)候盡量不要產(chǎn)生氣泡。 七七思考題思考題 該法的測(cè)定原理如何？有何優(yōu)缺點(diǎn)？ 該法的關(guān)鍵反應(yīng)是什么？實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意哪些因素？ 八八血糖測(cè)定的其他方法血糖測(cè)定的其他方法 無(wú)機(jī)化學(xué)法：Folin-Wu法，基于葡萄糖醛基的還原性 （特異性差） 有機(jī)化學(xué)法：鄰甲苯胺法 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 血糖血糖水平恒定的生理意義：水平恒定的生理意義： 保證重要組織器官的能量供應(yīng)，特別是某些依賴葡萄糖供能的 組織器官。 腦組織不能利用脂酸，正常情況下主要依賴葡萄糖供能； 紅細(xì)胞沒(méi)有線粒體，完全通過(guò)糖酵解獲能； 骨髓及

7、神經(jīng)組織代謝活躍，經(jīng)常利用葡萄糖供能。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 血糖水平的平衡主要是受到激素調(diào)節(jié)：血糖水平的平衡主要是受到激素調(diào)節(jié)： 血糖水平保持恒定是糖、脂肪、氨基酸代謝協(xié)調(diào)的結(jié)果，也是 肝、肌、脂肪組織等各器官組織代謝協(xié)調(diào)的結(jié)果。 機(jī)體的各種代謝以及各器官之間能這樣精確協(xié)調(diào)，以適應(yīng)能量、 燃料供求的變化，主要依靠激素的調(diào)節(jié)。 酶水平的調(diào)節(jié)是最基本的調(diào)節(jié)方式和基礎(chǔ)。 主要調(diào)節(jié)主要調(diào)節(jié) 激素激素 降低血糖：胰島素降低血糖：胰島素(insulin) 升高血糖：升高血糖：胰高血糖素胰高血糖素(glucagon) 糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素 腎上腺素腎上腺素 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床

8、意義 胰島素胰島素是體內(nèi)唯一降低血糖的激素：是體內(nèi)唯一降低血糖的激素： 胰島素(Insulin)是體內(nèi)唯一的降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促 進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。 胰島素的分泌受血糖控制，血糖升高立即引起胰島素分泌；血 糖降低，分泌即減少。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 血糖血糖水平異常及糖尿病是最常見(jiàn)的糖代謝水平異常及糖尿病是最常見(jiàn)的糖代謝紊亂：紊亂： 正常人體內(nèi)存在一套精細(xì)的調(diào)節(jié)糖代謝的機(jī)制，在一次性食入大 量葡萄糖后，血糖水平不會(huì)出現(xiàn)大的波動(dòng)和持續(xù)升高。 人體對(duì)攝入的葡萄糖具有很大的耐受能力的現(xiàn)象稱(chēng)為葡萄糖耐量葡萄糖耐量 (glucose tolerence)。 空腹血

9、糖（空腹血糖（FPG）: 3.9-6.1 mmol/L 糖尿病糖尿病 7.0 mmol/L 低血糖低血糖 2.8 mmol/L T1DM (Type I diabetes mellitus) T2DM (Type II diabetes mellitus) 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 臨床臨床上因糖代謝障礙可發(fā)生血糖水平紊亂，常見(jiàn)有以下上因糖代謝障礙可發(fā)生血糖水平紊亂，常見(jiàn)有以下 兩種類(lèi)型兩種類(lèi)型： 低血糖低血糖 (hypoglycemia) 高血糖高血糖 (hyperglycemia) 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 低血糖：低血糖：血糖濃度低于2.8mmol/L 低血糖的危

10、害：低血糖的危害： 低血糖影響腦的正常功能，因?yàn)槟X細(xì)胞所需要的能量主要 來(lái)自葡萄糖的氧化。當(dāng)血糖水平過(guò)低時(shí)，就會(huì)影響腦細(xì)胞的功 能，從而出現(xiàn)頭暈、倦怠無(wú)力、心悸等，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)昏迷，稱(chēng) 為低血糖休克。如不及時(shí)給病人靜脈補(bǔ)充葡萄糖，可導(dǎo)致死亡。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 低血糖：低血糖：血糖濃度低于2.8mmol/L 低血糖低血糖的原因的原因： 胰性(胰島-細(xì)胞機(jī)能亢進(jìn)、胰島-細(xì)胞機(jī)能低下等)； 肝性（肝癌、糖原累積病等）； 內(nèi)分泌異常（垂體機(jī)能低下、腎上腺皮質(zhì)機(jī)能低下等）； 腫瘤（胃癌等）； 饑餓或不能進(jìn)食者等。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 臨床上將空腹血糖濃度高于6.1mmol/L 稱(chēng)為高血糖 (hyperglycemia)。 當(dāng)血糖濃度超過(guò)了腎小管的重吸收能力(腎糖閾)，則可出現(xiàn)糖尿。 持續(xù)性高血糖和糖尿，特別是空腹血糖和糖耐量曲線高于正常范 圍，主要見(jiàn)于糖尿病(diabetes mellitus)。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意義本實(shí)驗(yàn)的臨床意義 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 高血糖高血糖的原因：的原因： 糖尿病； 遺傳性胰島素受體缺陷 某些慢性腎炎、腎病綜合癥等； 生理性高血糖和糖尿。 九九本實(shí)驗(yàn)的臨床意