實驗十二金黃色葡萄球菌

1、 金葡菌鏡下特征 檢樣檢樣25g(mL) +稀釋液稀釋液225mL，均質(zhì)，均質(zhì) 血漿凝固酶試驗血漿凝固酶試驗 7.5%氯化鈉肉湯或氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯氯化鈉胰酪胨大豆肉湯） BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面 Baird-Parker平板，血平板平板，血平板 涂片染色涂片染色 361 ， 18h24h 結(jié)果報告結(jié)果報告 361 B-P平板平板18h24h或或45h48h 觀察溶血觀察溶血 血平板血平板 18h24h 典型菌落特征：典型菌落特征：黑色黑色, , 有光澤有光澤, , 突起菌落并突起菌落并 伴有透明圈，通常外層有清晰圈伴有透明圈，通常外層有清晰圈 三、實驗器

2、材三、實驗器材 n2 設(shè)備和材料設(shè)備和材料 n除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè) 備和材料如下：備和材料如下： n恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、 恒溫水浴箱、恒溫水浴箱、 天平、天平、 均質(zhì)均質(zhì) 器、器、 振蕩器、無菌吸管：振蕩器、無菌吸管：1 mL（具（具 0.01 mL 刻刻 度）、度）、10 mL（具（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及刻度）或微量移液器及 吸頭、吸頭、 無菌錐形瓶：容量無菌錐形瓶：容量 100 mL、500 mL、 無無 菌培養(yǎng)皿、菌培養(yǎng)皿、 注射器：注射器：0.5 mL、 pH計或計或 pH比色比色 管或精密

3、管或精密 pH試紙。試紙。 n3 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑 n3.1 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄 A中中 A.1。 n3.2 7.5 %氯化鈉肉湯：見附錄氯化鈉肉湯：見附錄 A中中 A.2。 n3.3 血瓊脂平板：見附錄血瓊脂平板：見附錄 A中中 A.3。 n3.4 Baird-Parker瓊脂平板：見附錄瓊脂平板：見附錄 A中中 A.4。 n3.5 腦心浸出液肉湯腦心浸出液肉湯(BHI) ：見附錄：見附錄 A中中 A.5。 n3.6 兔血漿：見附錄兔血漿：見附錄 A中中 A.6。 n3.7 稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄 A中中

4、 A.7。 n3.8 營養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄營養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄 A中中 A.8。 n3.9 革蘭氏染色液：見附錄革蘭氏染色液：見附錄 A中中 A.9。 n3.10 無菌生理鹽水：見附錄無菌生理鹽水：見附錄 A中中 A.10。 四、實驗內(nèi)容及操作四、實驗內(nèi)容及操作 n金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖 5.1 樣品的處理樣品的處理 n稱取稱取 25 g 樣品至盛有樣品至盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，的無菌均質(zhì)杯內(nèi)， 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)均質(zhì) 1 min2 min，或，或 放入盛有

5、放入盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉氯化鈉 胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì) 器拍打器拍打 1 min2 min。 n若樣品為液態(tài)，吸取若樣品為液態(tài)，吸取 25 mL 樣品至盛有樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的 無菌錐形瓶無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠) 中，振蕩混勻。中，振蕩混勻。 5.2 增菌和分離培養(yǎng)增菌和分離培養(yǎng) n5.2.1 將上述樣品勻液于將上述樣品勻液于 36 1 培養(yǎng)培

6、養(yǎng) 18 h24 h。金黃色葡萄球菌在。金黃色葡萄球菌在 7.5%氯化鈉肉湯氯化鈉肉湯 中呈混濁生長，污染嚴重時在中呈混濁生長，污染嚴重時在 10%氯化鈉胰酪氯化鈉胰酪 胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。 n5.2.2 將上述培養(yǎng)物，將上述培養(yǎng)物， 分別劃線接種到分別劃線接種到 Baird- Parker平板和血平板平板和血平板， 血平板血平板 36 1 培培 養(yǎng)養(yǎng) 18 h24 h。Baird-Parker平板平板 36 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 18 h24 h 或或45 h48 h。 n5.2.3 金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，平板上， 菌落直徑為菌

7、落直徑為 2 mm3 mm，顏色呈灰色到黑，顏色呈灰色到黑 色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外 層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油 至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的 類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存 的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌 落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干 燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形

8、、光 滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌 落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落 進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。 5.3 鑒定鑒定 n5.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏 陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無 莢膜，直徑約為莢膜，直徑約為0.5 m1 m。 n5.3.2 血漿凝固酶試驗：血漿凝固酶試驗： 挑取、挑取、 Baird- Parker平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落1個或以上，

9、個或以上， 分別接種到分別接種到5 mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面和營養(yǎng)瓊脂小斜面， 36 1 培養(yǎng)培養(yǎng)18 h24 h。 n取新鮮配置兔血漿取新鮮配置兔血漿 0.5 mL，放入小試管中，放入小試管中， 再加入再加入 BHI培養(yǎng)物培養(yǎng)物 0.2 mL0.3 mL，振蕩搖，振蕩搖 勻，置勻，置 36 1 溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時 觀察一次，觀察觀察一次，觀察 6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管，如呈現(xiàn)凝固（即將試管 傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于 原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以 血漿凝固酶

10、試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的 肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑， 按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。 n結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 18 h48 h，重復(fù)，重復(fù) 試驗。試驗。 樣品稀釋度樣品稀釋度 1010-2 典型菌落數(shù)典型菌落數(shù)66，646，6 用于做血漿凝固酶用于做血漿凝固酶 的菌落數(shù)的菌落數(shù) 55 血漿凝固酶陽性菌血漿凝固酶陽性菌 落數(shù)落數(shù) 44 樣品稀釋度樣品稀釋度 1010-2 典型菌落數(shù)典型菌落數(shù) 150，16018，16 用于做血漿凝固酶用于做血漿凝固酶 的菌落數(shù)的菌落數(shù) 55 血