端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺癌組織中的表達及意義

1、端粒酶、p16、rb、pcna在胰腺癌組織中的表達及意義端粒酶、p16、rb、pcna在胰腺癌組織中的表達及意義 作者：許元鴻 歐陽兵 于國志 郭仁宣 郭克建 作者單位：110001 沈陽，中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普通外科 【摘要】 目的 探討端粒酶活性、p16、rb、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,pcna)在胰腺癌組織中的表達及意義。方法 對39例胰腺癌及11例胰腺良性病變采用pcrtrap方法檢測端粒酶活性，免疫組化sp法定位觀察p16、rb、pcna表達。結(jié)果 端粒酶、p16、rb、pcna標記指數(shù)(labeling index,l

2、i)在胰腺癌中表達陽性率分別為92.3%(36/39)、43.6%(17/39)、71.9%(28/39)、(47.811.3)%。與胰腺良性病變比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。端粒酶陽性、p16和rb表達缺失者pcna li顯著增高(p0.05)。端粒酶活性與p16表達、p16與rb表達均呈顯著負相關(guān)(p0.05)。p16/rb失活組端粒酶陽性率顯著高于p16陽性/rb陽性組(p0.05)。p16表達缺失和pcna高值組臨床病期較晚，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p0.05)。結(jié)論 端粒酶激活、p16、rb表達缺失在胰腺癌發(fā)生中起重要的調(diào)節(jié)作用，而且是促進細胞增殖重要因素之一。p16表達缺失與胰腺

3、癌的轉(zhuǎn)移和浸潤可能有密切關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 胰腺腫瘤； 端粒酶； p16； rb； pcna； 基因 expressions of telomerase, p16, rb and pcna in pancreatic cancer tisseus and their significance xu yuanhong, ouyang bing, yu guozhi, guo renxuan, guo kejian. department of general surgery, the first affiliated hospital, china medical university, she

4、nyang 110001, china corresponding author: xu yuanhong, email: yuanhongxu 【abstract】 objective to investigate expressions of significance of telomerase, p16, rb and pcna in pancreatic cancer tissues and their significance. methods expressions of p16, rb and pcna in tissues from 39 cases with pancreat

5、ic cancer and 11 benign leisions were observed by means of immunohistochemical method. in the meantime, telomerase activity was investigated by using telomeric repeat amplification protocal (trap) assay. results the positive expression rate of telomerase, p16, rb, pcnal1 in pancreatic cancer tissues

6、 were 92.3%, 43.6%, 71.9% and (47.811.3)%, respectively, with statistica difference compared with benign leisions (p0.05 or p0.01). the cases with expression deletion of telomerase activation, p16 and rb showed significanty higher level level pcna li （p0.05）. there found negative correlation between

7、 expression of p16 and that of rb as well as expression of telomerase and that of p16 (p0.05). the positive rate of telomerase in p16/rb deletion group was significantly higher than that in p16+/rb+ group (p0.05). the expression deletion of p16 and high level of pcna were correlated closely with lym

8、ph node metastasis (p0.05). conclusions telomerase activation, expression deletion of p16 and rb genes may be important molecular event in occurrence of pancreatic cancer and is one of vital factors pomoting cell proliferation. the loss expression of p16 is probably correlated closely with infiltrat

9、ion and metastasis of pancreatic cancer. 【key words】 pancreatic cancer; telomerase; p16; rb; pcna; gene 端粒酶、p16、rb是調(diào)控腫瘤細胞永生化和癌變的重要基因，與腫瘤細胞增殖失控、轉(zhuǎn)移和浸潤關(guān)系密切1-3。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，pcna)作為腫瘤群體增殖動力學參數(shù)對研究腫瘤生物學行為有很高價值4。本文應(yīng)用pcrtrap和免疫組化染色對胰腺癌的端粒酶、p16、rb、pcna進行檢測，探討它們在胰腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤中的作用及相

10、互關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 材料 39例胰腺癌(31例導管細胞癌、3例漿液性囊腺癌、3例黏液性囊腺癌、2例胰島細胞癌)，11例胰腺良性病變(6例胰腺囊腺瘤、1例胰腺腺瘤、4例慢性胰腺炎)，均取自中國醫(yī)科大學第一臨床學院和遼寧省腫瘤醫(yī)院1998年5月至1999年10月手術(shù)切除標本。 1.2 試劑 trap端粒酶檢測試劑盒購自美國intergen公司；taq酶購自日本takara公司；p16、rb多克隆抗體、pcna單克隆抗體、生物素標記的二抗購自北京中山生物技術(shù)有限公司；sp試劑盒購自zymed公司。 1.3 方法 (1)端粒酶檢測：取組織標本50100 mg用液氮在高壓消毒過的研缽中研成

11、粉末，轉(zhuǎn)入2 ml玻璃勻漿器，加入200 l 1chaps裂解液制成勻漿，冰上孵育30 min，4 以下12 000 r/min離心20 min，取上清液，以液氮速凍后置-80 保存?zhèn)溆谩?pcrtrap方法檢測：25 l反應(yīng)體系中depc水19.8 l，10trap緩沖液2.5 l，50dntps 0.5 l，ts引物0.5 l，trap混合引物0.5 l，taq酶0.2 l(1 u)，最后加入端粒酶提取液1 l。ts引物在端粒酶介導下30 延伸30 min，混勻后在熱循環(huán)儀上進行35個循環(huán)的pcr反應(yīng)，循環(huán)條件為：94 45 s，55 45 s，72 1 min。 選用12%的非變性聚丙烯

12、酰胺凝膠，以250 v電壓電泳30 min左右，取下凝膠，經(jīng)eb染色后，在gds8000upv成像儀上觀察，保存所得圖像。 結(jié)果判定：如果在內(nèi)對照帶以外，出現(xiàn)其間隔6 bp的梯帶，則判斷為端粒酶陽性；如果只有內(nèi)對照帶，則為端粒酶陰性。 (2)p16、rb、pcna表達：免疫組化染色方法sp法：按說明書嚴格操作。 結(jié)果判定：以已知陽性切片作陽性對照，用pbs代一抗作陰性對照。rb、pcna陽性物質(zhì)定位于細胞核；p16定位于胞質(zhì)。pcna標記指數(shù)(labeling index,li)=陽性細胞數(shù)/500(雙盲法，記數(shù)500個腫瘤細胞，5個高倍視野，取均值)。 1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用2檢驗、t

13、檢驗和spearman等級相關(guān)檢驗。p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 2.1 端粒酶、p16、rb、pcna在胰腺良、惡性病變中的表達(表1、圖14)表1 端粒酶、p16、rb在胰腺良、惡性病變中的表達 2.2 端粒酶、p16、rb表達與pcna li的關(guān)系(表2)表2 端粒酶、p16、rb與pcna表達間的關(guān)系 2.3 端粒酶、p16、rb表達間的相互關(guān)系 端粒酶陽性/p16陽性者14例，端粒酶陽性/p16陰性者22例，端粒酶陰性/p16陽性者3例，端粒酶陰性/p16陰性者0例，spearman相關(guān)分析檢驗r-0.794 3，p0.05。 p16陽性/rb陽性者6例，p16陽性/rb

14、陰性者11例，p16陰性/rb陽性者22例，p16陰性/rb陰性者0例，r=-0.874 9，p0.01。 p16/rb失活組共計33例，32例表達端粒酶陽性，占96.9%；p16陽性/rb陽性組共計6例，1例表達端粒酶陽性，占16.6%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。 2.4 端粒酶、p16、rb、pcna表達與胰腺癌分化、臨床分期和轉(zhuǎn)移的關(guān)系(表3)表3 端粒酶、p16、rb、pcna表達與胰腺癌相關(guān)指標的關(guān)系 3 討論 1989年morin等首次在人的癌細胞系中發(fā)現(xiàn)端粒酶以來，腫瘤細胞永生化的端粒端粒酶假說已被越來越多的研究成果所證實。認為人體細胞的死亡過程有兩種程序控制，即第

15、一致死期m1期和第二致死期m2期，m1期由p53、p16、rb等正常抑癌基因所產(chǎn)生的蛋白控制，m2期由端粒酶控制5。由此可見端粒酶、p16、rb基因表達的蛋白在腫瘤細胞永生化過程中起至關(guān)重要的作用。 胰腺癌的端粒酶活性檢測，國內(nèi)外報道較少6。本研究顯示，端粒酶在胰腺癌組織中的表達陽性率顯著高于胰腺良性病變，p16、rb基因表達蛋白陽性率顯著低于胰腺良性病變，提示端粒酶激活、p16、rb表達蛋白的缺失，在胰腺癌的發(fā)生中起重要作用，是良好的腫瘤標記物。pcna在胰腺癌中表達明顯增多，分布呈異質(zhì)性，提示胰腺癌細胞生長調(diào)節(jié)失控,dna合成紊亂，反應(yīng)出腫瘤增殖細胞群中并非所有細胞均同步增殖。在胰腺癌組織

16、中端粒酶陽性、p16、rb表達缺失，其pcna表達明顯增多。這說明端粒酶激活、p16、rb表達缺失是促進細胞增殖重要因素之一。 p16、rb蛋白是一類負性細胞周期的調(diào)控蛋白，相關(guān)分析證實p16與rb表達間存在顯著負相關(guān)性。同時，這一結(jié)果也證實了p16、rb基因表達蛋白調(diào)控胰腺細胞癌變的機理是一個負反饋環(huán)路。在此反饋環(huán)內(nèi)，p16、rb表達蛋白任何之一表達缺失，都將導致調(diào)節(jié)環(huán)路的中斷，造成細胞的異常增殖，最終導致胰腺癌的發(fā)生。 調(diào)控細胞永生化的端粒酶和p16蛋白在胰腺癌中的表達呈顯著的負相關(guān)性，提示p16蛋白表達缺失結(jié)合端粒酶激活，可能在胰腺癌的發(fā)生上起著十分重要作用，與腫瘤發(fā)生的端粒端粒酶假說相

17、吻合。tresnasari等7在研究淋巴瘤形成中提出，p16/rb通路失活或p16表達下調(diào)結(jié)合端粒酶活性增強是導致淋巴瘤形成的致癌理論。在本研究中，p16/rb失活組端粒酶表達陽性率顯著高于p16陽性/rb陽性組。這說明p16/rb通路失活和端粒酶激活是原發(fā)性胰腺癌發(fā)生中的重要組成因素。 本研究顯示，p16表達缺失的患者臨床分期較晚，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這提示p16表達缺失，不僅在胰腺實體瘤的形成過程中起重要作用，而且對周圍臟器的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能也起著十分重要的作用。pcna作為原位檢測腫瘤細胞增殖活性的指標，其表達與腫瘤的分化、浸潤、轉(zhuǎn)移均有密切相關(guān)性，可作為腫瘤鑒別診斷和預后的參考指標

18、。 【參考文獻】 1 sampedro camarena f, cano serral g, sampedro santalo f. telomerase and telomere dynamics in ageing and cancer: current status and future directions. clin transl oncol,2007,9(3):145-154. 2 matsuda y, ichida t. p16 and p27 are functionally correlated during the progress of hepatocarcinogenesis. med mol morphol,2006,39(4):169