生物工程實驗

1、實驗一 克隆載體重組子的抽提 （重組質粒的提取、電泳鑒定及酶切鑒定） 一、實驗目的 1、掌握堿裂解法提取質粒DNA。 2、掌握質粒的電泳鑒定 3、學習質粒的酶切鑒定 1）堿裂解提取質粒原理：）堿裂解提取質粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質粒與質粒DNA之間的結構和大小的之間的結構和大小的 差異進行分離提取的。差異進行分離提取的。 二、實驗原理 染色體DNA質粒DNA 二、實驗原理 1）堿裂解提取質粒原理：）堿裂解提取質粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質粒與質粒DNA之間的結構和大小的差異進行分離之間的結構和大小的差異進行分離 提取的。提取的。 收集菌

2、收集菌 體并用體并用 GTEGTE懸浮懸浮 NaOHNaOH SDSSDS 裂解裂解 變變 性性 二者都沉淀二者都沉淀 加入加入KACKAC 小分子小分子 蛋白蛋白 大分子不溶性大分子不溶性 蛋白和殘渣蛋白和殘渣 離心離心 分離分離 取上清取上清 異丙醇沉淀異丙醇沉淀 質粒質粒DNADNA 苯酚苯酚- -氯仿除蛋白氯仿除蛋白 獲得較純凈質粒獲得較純凈質粒 染色體染色體 DNADNA 二、實驗原理 2）瓊脂糖凝膠電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-

3、60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動速率越慢，而且還與分子構型有關。如質粒開環(huán)移動速率越慢，而且還與分子構型有關。如質粒開環(huán)DNA線性線性DNA 共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA 染色體DNA 質粒DNA 3）限制性核酸內切酶）限制性核酸內切酶: 是一類能夠識別雙鏈是一類能夠識別雙鏈DNA分子內部的特異序列，并在識分子內部的特異序列，并在識 別位點或其周圍產生切割作用的核酸水解酶，它存在于細菌別位點或其周圍產生切割作用的核酸水解酶，它存在于細菌 體內

4、與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)即保護自身體內與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)即保護自身 DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6堿基對，具有回紋結構的堿基對，具有回紋結構的DNA 片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵切割方式有兩種：黏切割方式有兩種：黏 性末端和平末端性末端和平末端 切切4堿基，平均堿基，平均256bp出現(xiàn)一次切點，切出現(xiàn)一次切點，切6-8堿基堿基 時，每隔時，每隔4-65kb出現(xiàn)一次切點出現(xiàn)一次切點 二、實驗原理 三、實驗步驟三、實驗步驟 1、質粒、質粒DNA的提取：的提?。?在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上隨機挑出數(shù)個白色菌落，接種到

5、5ml LB- AMP液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。 取1.5ml對數(shù)生長期的菌體與EP管中，在臺式離心機上8000rpm離心30秒收集 菌體。 棄上清，將EP管倒置在吸水紙上，吸干溶液。 加100ul GTE緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放置5分鐘。 加入200ul NaOH-SDS溶液，顛倒混勻10次，然后置冰浴5分鐘。 加入150ul預冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴5分鐘。 在4下于臺式高速離心機12000rpm離心5分鐘，并將上清移至另一支新的EP 管中。 加等體積的酚、氯仿抽提一次，12000rpm離心5分鐘，取上層水相至另一支 新的 EP管中，加等體

6、積氯仿抽提一次，12000rpm離心5分鐘，取上層水相至另一 支新的EP管中。 加等體積異丙醇，置冰浴30min，12000rpm離心10分鐘，棄上清。 沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，棄上清并真空干燥。用30ulTE溶解沉淀的DNA， 加入2ug/ul Rnase溶液 2ul，3710min，置于4保存。 三、實驗步驟 2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時間為電泳時間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托

7、盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠。 3）?。┤?0ulPCR產物，加入產物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微 量進樣器小心加入樣品孔。量進樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結果 三、實驗步驟 3、質粒的酶切鑒定：、質粒的酶切鑒定： 1） 質粒質粒DNA酶

8、切反應體系酶切反應體系 10 酶切酶切buffer 3 l 質粒質粒DNA 10 l EcoR1（10u/ l） 1 l BamH1（ 10u/ l ） 1 l ddH2O加至加至 20 l 37水浴保溫水浴保溫1-2h；72 水浴水浴15min終止反應。終止反應。 3、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前）、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前） 4、結果分析、結果分析 四、注意事項 1、抽提質粒過程應盡量保持低溫 2、質粒制備過程中要盡量除去蛋白，否則會影響后面的酶 切或連接 3、沉淀DNA常用等體積的異丙醇，但易將鹽也沉淀下來，可 以用二倍體積的冰乙醇避免鹽的沉淀。 4、EB是強致癌物，注意

9、操作安全； 5、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 6、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 1、堿裂解法提取質粒的原理？ 實驗二 目的基因的回收、連接反應 （酶切體系的電泳鑒定、回收、純化、與載體連接） 一、實驗目的 1、掌握目的片段的電泳鑒定。 2、 DNA的膠回收實驗 3、掌握克隆的原理 二、實驗原理 1）瓊脂糖凝膠電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電

10、泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子量的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子量的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動速率越慢，而且還與分子構型有關。移動速率越慢，而且還與分子構型有關。 二、二、 實驗原理實驗原理 2）T4DNA連接酶連接酶: DNA連接酶是一種封閉連接酶是一種封閉DNA鏈上的缺口的酶，借助于鏈上的缺口的酶，借助于ATP或或 NAD+水解提供的能量，催化水解提供的能量，催化DNA的的3-OH與與5的磷酸基團生成磷酸二酯健。的磷酸基團生成磷酸二酯健。 T4DNA連接酶則連接雙鏈連接酶則連接雙鏈DNA分子的粘性末端或平端。分子的粘性末端或平端。 二、二、 實驗原理實

11、驗原理 3）TA克隆克隆;利用利用Taq酶在延伸過程中會在酶在延伸過程中會在DNA的末端加的末端加A的特性，使的特性，使PCR擴增產擴增產 物和帶物和帶T尾的載體在連接酶的作用下連接起來。尾的載體在連接酶的作用下連接起來。 三、實驗步驟 1、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時間為電泳時間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳

12、緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠。 3）?。┤?0ulPCR產物，加入產物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微 量進樣器小心加入樣品孔。量進樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結果 三、實驗步驟 2、DNA的膠回收：的膠回收： 切取瓊脂糖凝膠上目的片段，稱量膠的重量切取瓊脂糖凝膠上目的片段，稱量膠的重量 1、按、按Binding Buffe ：

13、PCR產物產物=4：1比例加入比例加入Binding Buffer，混勻；置于，混勻；置于50-60 水浴10min，使膠徹底融化 2、把混合液轉移到收集管的、把混合液轉移到收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置柱中，室溫放置 2min，8000rpm離心離心1min 3、倒掉收集管中的廢液，加、倒掉收集管中的廢液，加500ul Wash Solution 到到 UNIQ-10柱子中，柱子中，8000rpm室溫離心室溫離心1min 4、重復步驟、重復步驟3 5、倒掉收集管中的廢液，將、倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集柱放入同一收集 管中，管中，12000rpm離心離心15s 6

14、、將、將UNIQ-10柱放入新的柱放入新的1.5ml離心管中，在柱子膜中離心管中，在柱子膜中 央加央加30ul Elution Buffer或者水，室溫或或者水，室溫或37放置放置2min 7、12000rpm室溫離心室溫離心1min，離心管中的液體即為回收，離心管中的液體即為回收 的的DNA片段。片段。 三、實驗步驟 3、與載體連接、與載體連接 PCR產物克隆試劑盒產物克隆試劑盒 連接反應體系：連接反應體系： 10 Ligation Buffer 1ul pUCm-T vector 1ul 純化的純化的PCR產物產物 3ul dd H2O 3ul T4 DNA Ligase 1ul Fina

15、l Volume 10ul 16 連接過夜連接過夜 四、注意事項 1、EB是強致癌物，注意操作安全； 2、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 3、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 1、T4連接酶與大腸桿菌DNA連接酶作用上有何區(qū)別 ？ 實驗三 感受態(tài)細胞的制備、轉化、培養(yǎng) 一、實驗目的 1、掌握感受態(tài)細胞的制備。 2、掌握DNA轉化過程 3、掌握藍白斑篩選的原理 二、實驗原理 1）感受態(tài)細胞轉化的原理：）感受態(tài)細胞轉化的原理： 受體細胞處于感受態(tài)即能從環(huán)境中吸取受體細胞處于感受態(tài)即能從環(huán)境中吸取DNA的一種生理狀態(tài)。在冰浴條的一種生理狀態(tài)。在冰浴條 件

16、先，用件先，用0.1M的的CaCl2溶液懸浮活化的溶液懸浮活化的E.coli DH5a菌，使其膜的通透性菌，使其膜的通透性 增大而成為感受態(tài)細胞，當外源重組增大而成為感受態(tài)細胞，當外源重組DNA與感受態(tài)細胞混合后在冰浴中與感受態(tài)細胞混合后在冰浴中 孵育后，外源重組質粒孵育后，外源重組質粒DNA就有可能進入感受態(tài)細胞內，并通過自我復就有可能進入感受態(tài)細胞內，并通過自我復 制實現(xiàn)遺傳信息轉移，使宿主細胞出現(xiàn)新性狀，即感受態(tài)細胞轉化制實現(xiàn)遺傳信息轉移，使宿主細胞出現(xiàn)新性狀，即感受態(tài)細胞轉化 2）轉化子藍白斑篩選的原理）轉化子藍白斑篩選的原理: 使用的載體帶有大腸桿菌的使用的載體帶有大腸桿菌的DNA短

17、區(qū)段，含有短區(qū)段，含有 -半乳糖苷半乳糖苷 酶基因（酶基因（lacZ）的調控序列和）的調控序列和N端端146個氨基酸的編碼信息，個氨基酸的編碼信息， 這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，宿這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，宿 主細胞攜帶編碼主細胞攜帶編碼 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列，雖然宿主和質端部分序列，雖然宿主和質 粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性 的酶蛋白質的酶蛋白質- -半乳糖苷酶，這種互補現(xiàn)象叫半乳糖苷酶，這種互補現(xiàn)象叫 互補，在生色互補，在生色 物質物質X-gal存在下形成

18、藍色菌落，但在外源基因插入到多克存在下形成藍色菌落，但在外源基因插入到多克 隆位點后，破壞了質粒載體隆位點后，破壞了質粒載體 -半乳糖苷基因讀框，不能編碼半乳糖苷基因讀框，不能編碼 -半乳糖苷酶，就形成白色菌落。半乳糖苷酶，就形成白色菌落。 二、實驗原理 三、實驗步驟 1、感受態(tài)細胞的制備：、感受態(tài)細胞的制備： 1）新活化的E.coli DH5菌平板挑取一單菌落，接種于3-5ml的LB液 體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12小時左右，至對數(shù)生長期。 2.）上述菌液以1：50量接種到100ml液體培養(yǎng)基中。擴大培養(yǎng)至 A600nm=0.7（振蕩培養(yǎng)2小時） 3）培養(yǎng)液在水浴中冷卻片刻后，取1.5ml菌液

19、用冰預冷的1.5ml離心管 0-4 8000rpm離心5min收集菌體。 4） 去上清，用0.5ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰 裕 放置，15-30分鐘 5）0-4 4000rpm離心10分鐘收集菌體 6）傾去上清，加入200ul預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心懸浮細胞 置于冰裕中3-5min后待用轉化，或加15-20%的甘油置于-40保存 備用。 三、實驗步驟 2、重組、重組DNA的轉化：的轉化： 1） 上述上述Ep管中加入管中加入10ul連接反應混合物，輕輕連接反應混合物，輕輕 搖勻，搖勻， 冰裕中放置冰裕中放置30分鐘。分鐘。 2） 再于再于42

20、水浴中保溫水浴中保溫90秒，然后迅速在冰裕中冷卻秒，然后迅速在冰裕中冷卻 3-5分鐘。分鐘。 3） 加入加入500ul LB培養(yǎng)液，搖勻后于培養(yǎng)液，搖勻后于37溫裕溫裕30-60分鐘。分鐘。 4） 將上述轉化反應原液涂于含氨芐青霉素、將上述轉化反應原液涂于含氨芐青霉素、IPTG和和X- Gal的的LB固體培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)基中。 5） 待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，37培培 養(yǎng)過夜，觀察菌落。養(yǎng)過夜，觀察菌落。 四、注意事項 1、轉化實驗必須在低溫中進行，溫度波動嚴重影響轉化效 率，所用的試劑均應冰浴，細菌保持在4以下； 2、轉化實驗要做好對照，以

21、檢測感受態(tài)的細胞和重組質粒； 以已知質粒轉化感受態(tài)細胞做陽性對照；以TE緩沖也轉化 感受態(tài)細胞做陰性對照 五、思考題 1、重組DNA導入原核細胞有哪些方法？ 2、藍白斑篩選的原理？ 實驗四 pET-28a-SOD表達重組質粒的鑒定 （重組質粒的提取、酶切及電泳鑒定） 一、實驗目的 1、學習掌握重組子的篩選與驗證 2、掌握堿裂解法提取質粒DNA。 3、掌握質粒的酶切電泳鑒定 1）堿裂解提取質粒原理：）堿裂解提取質粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質粒與質粒DNA之間的結構和大小的之間的結構和大小的 差異進行分離提取的。差異進行分離提取的。 二、實驗原理 二、實驗原理 1）堿裂

22、解提取質粒原理：）堿裂解提取質粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質粒與質粒DNA之間的結構和大小的差異進行分離之間的結構和大小的差異進行分離 提取的。提取的。 收集菌收集菌 體并用體并用 GTEGTE懸浮懸浮 NaOHNaOH SDSSDS 裂解裂解 變變 性性 二者都沉淀二者都沉淀 加入加入KACKAC 小分子小分子 蛋白蛋白 大分子不溶性大分子不溶性 蛋白和殘渣蛋白和殘渣 離心離心 分離分離 取上清取上清 異丙醇沉淀異丙醇沉淀 質粒質粒DNADNA 苯酚苯酚- -氯仿除蛋白氯仿除蛋白 獲得較純凈質粒獲得較純凈質粒 染色體染色體 DNADNA 二、實驗原理 2）瓊脂糖凝膠

23、電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動速率越慢，而且還與分子構型有關。如質粒開環(huán)移動速率越慢，而且還與分子構型有關。如質粒開環(huán)DNA線性線性DNA 共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA 3）限制性核酸內切酶）限制性核酸內切酶: 是一類能夠識別雙鏈是一類能夠識別雙鏈DNA分子

24、內部的特異序列，并在識分子內部的特異序列，并在識 別位點或其周圍產生切割作用的核酸水解酶，它存在于細菌別位點或其周圍產生切割作用的核酸水解酶，它存在于細菌 體內與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)即保護自身體內與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)即保護自身 DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6堿基對，具有回紋結構的堿基對，具有回紋結構的DNA 片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵切割方式有兩種：黏切割方式有兩種：黏 性末端和平末端性末端和平末端 切切4堿基，平均堿基，平均256bp出現(xiàn)一次切點，切出現(xiàn)一次切點，切6-8堿基堿基 時，每隔時，每隔4-65kb出現(xiàn)一次切點

25、出現(xiàn)一次切點 二、實驗原理 實驗步驟-PET-28a-Mn-SOD表達重組 質粒的鑒定 1、用滅菌牙簽分別挑取5個菌落接種到2ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中，37振 蕩培養(yǎng)過夜； 2、用堿裂解法提取質粒； 3、用限制性內切酶EcoR I和Hind III酶切質粒， 1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果： 切出600bp Mn-SOD基因DNA片段的為陽 性克隆。 流流 程程 圖圖 三、實驗步驟三、實驗步驟 一、質粒一、質粒DNA的提?。旱奶崛。?1. 在含抗生素、在含抗生素、IPTG和和X-gal的平板上隨機挑出數(shù)個白色菌落，接種到的平板上隨機挑出數(shù)個白色菌落，接種到

26、5ml LB-AMP液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。 2. 取取1.5ml對數(shù)生長期的菌體與對數(shù)生長期的菌體與EP管中，在臺式離心機上管中，在臺式離心機上8000rpm離心離心 30秒收集菌體。秒收集菌體。 3. 棄上清，將棄上清，將EP管倒置在吸水紙上，吸干溶液。管倒置在吸水紙上，吸干溶液。 4. 加加100ul GTE緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放 置置5分鐘。分鐘。 5. 加入加入200ul NaOH-SDS溶液，顛倒混勻溶液，顛倒混勻10次，然后置冰浴次，然后置冰浴5分

27、鐘。分鐘。 6. 加入加入150ul預冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴預冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴5分鐘。分鐘。 7. 在在4下于臺式高速離心機下于臺式高速離心機12000rpm離心離心5分鐘，并將上清移至另一分鐘，并將上清移至另一 支新的支新的EP管中。管中。 加等體積的酚、氯仿抽提一次，加等體積的酚、氯仿抽提一次，12000rpm離心離心5分鐘，取上層水相至分鐘，取上層水相至 另一支新的另一支新的EP管中，加等體積氯仿抽提一次，管中，加等體積氯仿抽提一次，12000rpm離心離心5分鐘，分鐘， 取上層水相至另一支新的取上層水相至另一支新的EP管中。管中。 8. 加加0.6倍體積異丙醇

28、，置冰浴倍體積異丙醇，置冰浴30min，12000rpm離心離心10分鐘，棄上清。分鐘，棄上清。 9. 沉淀用沉淀用70%乙醇乙醇0.5ml洗一次，棄上清并真空干燥。用洗一次，棄上清并真空干燥。用30ulTE（已加（已加 入入2ug/ul Rnase）溶液溶解沉淀的）溶液溶解沉淀的DNA，3710min，置于，置于4保存。保存。 三、實驗步驟 3、質粒的酶切鑒定：、質粒的酶切鑒定： 1） 質粒質粒DNA酶切反應體系酶切反應體系 10 酶切酶切buffer 3 l 質粒質粒DNA 10 l EcoR1（10u/ l） 1 l BamH1（ 10u/ l ） 1 l ddH2O加至加至 20 l

29、37水浴保溫水浴保溫1-2h；72 水浴水浴15min終止反應。終止反應。 3、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前）、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前） 4、結果分析、結果分析 三、實驗步驟 2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時間為電泳時間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠

30、。 3）?。┤?0ulPCR產物，加入產物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍），混合后用微 量進樣器小心加入樣品孔。量進樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結果 四、注意事項 1、抽提質粒過程應盡量保持低溫 2、質粒制備過程中要盡量除去蛋白，否則會影響后面的酶 切或連接 3、沉淀DNA常用等體積的異丙醇，但易將鹽也沉淀下來，可 以用二倍體積的冰乙醇避免鹽的沉淀。 4、

31、EB是強致癌物，注意操作安全； 5、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 6、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 無 實驗四(續(xù)) pET-28a-SOD表達重組質粒的鑒定 （重組質粒的提取、酶切及電泳鑒定） 1 1、菌落、菌落PCRPCR擴增目的片段擴增目的片段-初步鑒初步鑒 定表達轉化子的正確定表達轉化子的正確 2 2、電泳鑒定目的條帶的存在否？、電泳鑒定目的條帶的存在否？ 3 3、驗證正確后用于誘導表達目的蛋、驗證正確后用于誘導表達目的蛋 白白 實驗六 重組蛋白的誘導 一、實驗目的 1、學習目的蛋白誘導表達的原理。 2、掌握接種、培養(yǎng)定時取樣、蛋白的

32、提 取分離純化 3、掌握目的蛋白的分離鑒定方法 二、實驗原理 1 1）誘導表達的原理：）誘導表達的原理：pETpET系統(tǒng)也是在大腸桿菌系統(tǒng)也是在大腸桿菌E.coliE.coli中克隆表達重組蛋白功能最強中克隆表達重組蛋白功能最強 大的系統(tǒng)。目的基因的表達受噬菌體大的系統(tǒng)。目的基因的表達受噬菌體T7T7強轉錄及翻譯信號的調控。表達系統(tǒng)是強轉錄及翻譯信號的調控。表達系統(tǒng)是 以大腸桿菌以大腸桿菌laclac操縱子調控機理為基礎設計的，操縱子調控機理為基礎設計的，laclac操縱子的轉錄受正調控因子操縱子的轉錄受正調控因子 CAPCAP和負調控因子和負調控因子lacIlacI的調控，在無誘導物情況下，

33、的調控，在無誘導物情況下， lacIlacI形成四聚體阻遏蛋白，形成四聚體阻遏蛋白， 與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始，在與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始，在IPTG(IPTG( -D-D-硫代半乳糖硫代半乳糖 苷苷) )等乳糖類似物是等乳糖類似物是laclac操縱子的誘導物，它與阻遏蛋白結合使之改變構象，導操縱子的誘導物，它與阻遏蛋白結合使之改變構象，導 致其與操縱基因的結合而解離出來。致其與操縱基因的結合而解離出來。LacLac操縱子的轉錄因此激活。操縱子的轉錄因此激活。 LacLac操縱子具操縱子具 有可誘導調控基因轉錄的性質，因此用來構建到表達載體中。有可誘

34、導調控基因轉錄的性質，因此用來構建到表達載體中。PET28PET28就有就有l(wèi)acIlacI基基 因，可用因，可用IPTGIPTG誘導。誘導。 三、實驗方法三、實驗方法 一、一、PET-28a-Mn-SOD表達重組質粒的誘導表達表達重組質粒的誘導表達 （1）用滅菌牙簽分別挑取陽性克隆和1個含PET-28a表達質 粒菌落接種到2ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中， 37振蕩培養(yǎng)過夜； （2）按1：10接種到3ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中， 37 250rpm振蕩培養(yǎng)2小時（OD值約為0.2-0.6）； （3）于各管中加100mM IPTG 30ul（終濃度為1mM）

35、， 37 250rpm振蕩培養(yǎng)，分別在1小時、2小時和3小時各 取1ml菌液，6000rpm離心2分鐘收集菌體，用2ml PBS重 懸菌體，加10mg/ml溶菌酶至終濃度為0.3mg/ml，冰上放 置30分鐘，加入10% TritonX-100（終濃度為0.1%），混 勻，超聲（200W 3秒,間隔3秒，60次）破碎細菌至細菌 懸液變的清亮透明，12000rpm離心10分鐘，收集上清和 沉淀待用。 （4）取上清和沉淀分別加等體積2蛋白上樣液，沸水浴5分 鐘變性，SDS-PAGE（12%的分離膠）電泳，考馬斯亮藍染色分 析，見圖2。 （5）結果：發(fā)現(xiàn)分子量約為30 KD， IPTG誘導3小時時重

36、組 蛋白表達量最高，約占總蛋白的50%，將3號菌種接種到另一 含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上并用15%甘油保種。 參考內容 5SDS上樣緩沖液上樣緩沖液10ml 1.0mol/L TrisHCl（pH6.8） 0.6 ml 2-巰基乙醇 0.5 ml 10%SDS 2.0 ml 1%溴酚藍 1.0 ml 50%甘油 5.0 ml DTT 300 mM 去離子水 0.9 ml （混勻后，分裝于1.5 ml離心管中，4保存） 考馬斯亮藍染液考馬斯亮藍染液 1000 ml 考馬斯亮藍R-250 1.0 g 甲醇 450 ml 冰醋酸 100 ml 去離子水 450 ml 考馬斯亮藍脫色液考馬斯亮藍脫色

37、液 1000 ml 甲醇 100 ml 冰醋酸 100 ml 蛋白樣品的電泳檢測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 1）用洗衣粉輕輕擦洗玻璃板，兩面都擦洗過后用自來水）用洗衣粉輕輕擦洗玻璃板，兩面都擦洗過后用自來水 沖，再用去離子水沖洗干凈后晾干備用。沖，再用去離子水沖洗干凈后晾干備用。 2）灌膠與上樣）灌膠與上樣 。將玻璃板對齊后放入制膠板中卡緊，加。將玻璃板對齊后放入制膠板中卡緊，加 入去離子水試漏，若不漏將水倒干凈。入去離子水試漏，若不漏將水倒干凈。 3）配）配12的分離膠，加入的分離膠，加入TEMED后立即搖勻，馬上注入后立即搖勻，馬上注入 兩玻璃板中。灌膠時，可用兩玻璃板中。灌

38、膠時，可用1 ml微量加樣器沿玻璃一側緩微量加樣器沿玻璃一側緩 緩傾注以防氣泡產生，待膠面升到離玻璃板口緩傾注以防氣泡產生，待膠面升到離玻璃板口2cm-3cm 時即可。時即可。 4）然后膠上加一層水趕走氣泡，且起到封閉的作用，水）然后膠上加一層水趕走氣泡，且起到封閉的作用，水 封后膠凝得更快并且膠面更平（灌膠時開始可以動作快一封后膠凝得更快并且膠面更平（灌膠時開始可以動作快一 些，膠面快到所需高度時放慢速度。加水封膠面時要慢，些，膠面快到所需高度時放慢速度。加水封膠面時要慢， 否則膠會被沖變型而且會使水混入膠內改變膠的濃度）。否則膠會被沖變型而且會使水混入膠內改變膠的濃度）。 蛋白樣品的電泳檢

39、測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 5）放置約）放置約50 min左右，當水和膠之間有一條折射線時，左右，當水和膠之間有一條折射線時， 或者灌膠剩下的膠液已經凝固了，說明膠已凝固完好。這或者灌膠剩下的膠液已經凝固了，說明膠已凝固完好。這 時輕輕傾斜膠板倒去上面的水樣。時輕輕傾斜膠板倒去上面的水樣。 6）按上述方法配）按上述方法配5的濃縮膠，加入的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻，后立即搖勻， 迅速灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，迅速將梳子水平插入迅速灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，迅速將梳子水平插入 濃縮膠中。由于膠凝固時體積會收縮減小，減小加樣孔的濃縮膠中。由于膠凝固時體積會收縮減小，減小加

40、樣孔的 上樣體積，所以在濃縮膠凝固的過程中要在兩邊補膠。約上樣體積，所以在濃縮膠凝固的過程中要在兩邊補膠。約 30-50 min后，待濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩后，待濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩 邊豎直向上輕輕將其拔出。邊豎直向上輕輕將其拔出。 7）將膠板放入電泳槽中，加入足夠的電泳緩沖液（電泳）將膠板放入電泳槽中，加入足夠的電泳緩沖液（電泳 緩沖液至少要漫過內測的小玻璃板），用微量加樣器的緩沖液至少要漫過內測的小玻璃板），用微量加樣器的 Tip插至加樣孔中緩慢加入樣品，并同時加入蛋白插至加樣孔中緩慢加入樣品，并同時加入蛋白Marker （加樣不要太快，太快可使樣品沖出加樣孔，如

41、果有氣泡（加樣不要太快，太快可使樣品沖出加樣孔，如果有氣泡 可能會使樣品溢出）?？赡軙箻悠芬绯觯?。 蛋白樣品的電泳檢測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 8）接通電源電泳，電泳時間一般）接通電源電泳，電泳時間一般23 h，調節(jié)電壓為：，調節(jié)電壓為： 濃縮膠用濃縮膠用80-100V，到分離膠以后加大到，到分離膠以后加大到120-150V。電泳。電泳 至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。 9）染色：小心將膠削離，放入盛有考馬斯亮藍（）染色：小心將膠削離，放入盛有考馬斯亮藍（20 ml已已 足夠）較大容器內，對于足夠）較大容器內，對于0.75 mm的膠可在搖床上緩慢震的膠

42、可在搖床上緩慢震 蕩蕩5-10 min，對于，對于1.5 mm的膠則需要的膠則需要10-20 min。 10）棄去染液，將膠在水中漂洗數(shù)次后，放入考馬斯亮藍）棄去染液，將膠在水中漂洗數(shù)次后，放入考馬斯亮藍 脫色液中（約脫色液中（約50 ml），在搖床上緩慢震蕩約），在搖床上緩慢震蕩約1 h，清晰條，清晰條 帶很快會顯現(xiàn)出來。帶很快會顯現(xiàn)出來。 11）將膠放入掃描儀中掃描拍照。）將膠放入掃描儀中掃描拍照。 四、注意事項 1、SDS-PAGE膠含有丙烯酰胺等有毒化合物物，注意操作安 全； 2、膠的濃度要根據(jù)分離鑒定蛋白的大小不同而配制不同的 濃度(有一表格)； 3、看清梳子插孔上樣，注意梳子孔不要

43、倒，倒下的，用上 樣針撥起； 五、思考題 實驗七 重組蛋白免疫印跡分析 一、實驗目的 1、學習目的蛋白表達鑒定的原理。 2、掌握蛋白的SDS-PAGE、膠的制作、 染色、脫色鑒定的方法 3、掌握目的蛋白Western Blot鑒定方法 二、實驗原理 1 1）實驗原理：經過）實驗原理：經過SDS-PAGESDS-PAGE蛋白質樣品，轉移到固相載體硝蛋白質樣品，轉移到固相載體硝 酸纖維素膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能酸纖維素膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能 保持電泳分離的多肽類型及生物學活性不變。以固相載體上保持電泳分離的多肽類型及生物學活性不變。以固相載體上 的蛋白或多

44、肽作為抗原與對應的抗體起免疫反應，再與酶或的蛋白或多肽作為抗原與對應的抗體起免疫反應，再與酶或 同位素標記的第二抗體結合，經過底物顯色或放射自顯影以同位素標記的第二抗體結合，經過底物顯色或放射自顯影以 檢查電泳分離的特異性目標蛋白檢查電泳分離的特異性目標蛋白 同樣樣品同時上樣到兩塊膠上，同時電泳，一塊膠 染色，一塊膠轉膜western blot 三、實驗方法三、實驗方法 一、轉膜一、轉膜 （1）切除凝膠多余的邊緣部分，用直尺量出膠的長 與寬，估算面積，將膠浸入轉移到緩沖液中平衡 10min(搖床) （2）剪切8張與膠同樣大小的濾紙和一張硝酸纖維 膜，均用轉移緩沖液平衡10min（搖床上）； （

45、3）從電極負極到正極依次順序為：海綿濾紙一 層電泳凝膠硝酸纖維膜-三層濾紙海綿， 操作時不要有氣泡夾在里面，固定好后放入電泳 槽中，接通電源。轉移30-45min 三、實驗方法三、實驗方法 二、封閉二、封閉 轉膜結束，關閉電源，取出硝酸纖維膜，將膜浸入封閉液中 搖床上緩慢震蕩30min 三、加一抗 將膜用PBST洗3次，5min/次，然后加入已作稀釋的一抗， 37震蕩1h，或室溫緩慢震蕩2h，或4 過夜。 四、加酶標二抗 用PBST洗膜3次， 5min/次，然后加入酶標二抗， 37震蕩 1h，或室溫緩慢震蕩2h。 五、顯色 用PBST洗膜3次， 5min/次，然后將膜浸入到底物液中，輕 輕晃動

46、數(shù)秒后避光靜止，待特異性條帶清晰顯現(xiàn) 時換ddH2O以終止反應。 四、注意事項 1、接觸硝酸纖維膜時要帶手套 2、轉移電流不能太大以免產熱過多，影響條帶清 晰度； 3、封閉液中有小牛血清、脫脂奶粉等，若封閉液 中含有能與一抗結合的蛋白，就要避免使用這種 封閉液 五、思考題 生化工程學實驗 一、實驗目的目的 (1) 通過超氧化物歧化酶的分離純化,了解有機溶劑沉淀蛋 白質以及纖維素離子交換層析方法的原理。 (2) 掌握測定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。 二二 、原理、原理 超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase) 簡稱SOD, 它廣 泛存在于各類生物體內, 按其所含金屬離子

47、的不同, 可分為 3種: CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。 SOD催化如下反應 : O2.- + O2- +2H+ H202+02 -自由基清除劑 實驗一、SOD酶粗酶液的分離純化 分離純化的原理（1）Mn-SOD易溶于乙醇； （2）K2HP04極易溶于水；（3）極性有機 溶劑丙酮沉淀SOD;(4)纖維素陰離子交換柱 純化。 X X X X X X Y X Z X Y Z Z Y Y Y X Z X Z X Z Z X X X Y Z Y Z X X X X X X X OH nX 平衡上樣吸附洗雜 洗脫 三、實驗步驟： 1、粗酶液的獲得：收集50 mL發(fā)酵液菌體，離心收集菌體。

48、 15mL磷酸鉀緩沖液重懸菌體，并加入75ul Triton冰上裂解 菌體10min，超聲破碎（400w,5-3,90次），8000rpm離 心10，上清即為SOD粗酶液,取上清12ml（留樣1mL測酶 活和蛋白含量-A）。 2、氯仿去蛋白： 上清中緩慢加入1/4體積的 4 下預冷過 的95% 乙醇 3mL, 然后再緩慢加入在4下預冷過的氯仿 1.8mL(0.15倍體積),充分攪拌, 8000 rpm離心10min, 棄去 沉淀, 收集上清液約 10mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量- -B)。 3、 K2HP04去水：加入K2HP04 3H20(按43g k2HP043H20/100mL粗

49、提液的比例), 約4g充分振搖，靜 止分層，收集上層，離心8000rpm，10min, 棄沉淀, 得上 清液約8mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量-C ) 4、丙酮沉淀蛋白并透析：、丙酮沉淀蛋白并透析：上一步得到的上清液加 入0.75 倍體積在4下預冷過的丙酮 , Mn-SOD 便沉淀下來。離心8000rpm，10min, 收集灰白色 沉淀物。將沉淀物溶于約3mLddH2O中,在4下, 對250mL pH7.6,2.5mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析, 每隔20 以上, 換透析外液1次, 共換 2-3 次。透析 內液如出現(xiàn)沉淀, 需8000rpm，10min,棄去沉淀, 收集上清液約5ml(留

50、樣 0.3mL-D) 。 5、DE-52纖維素柱層析：纖維素柱層析： 將上一步所得離心上 清液過 DE-52 纖維素柱。用 pH7.6,2.5mmol/L磷 酸鉀緩沖液作層析柱平衡液, 用 pH7.6,2.5mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL) 的 磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫。流速 30mL/h, 每管 收集3mL ,記錄總體積。 實驗二、SOD蛋白濃度及酶活測定 一、實驗目的一、實驗目的 掌握蛋白含量和SOD酶活性的測定方法。 二、原理二、原理 酶的比活性用每毫克蛋白質具有的活性單位來表示，因 此，測定樣品的比活性必須測定：（1）每毫升樣品中的 蛋白質毫克數(shù)。（2）每毫

51、升樣品中的酶活性單位數(shù)。 SOD測定方法采用鄰苯三酚自氧化法:鄰苯三酚在堿性條 件下, 能迅速自氧化,釋放出 O2-, 生成帶色的中間產物。 中間物在420nm波長處有強烈光吸收, 當有SOD存在時, 由于它能催化O2-與 H+ 結合生成02和H202, 從而阻止了 中間物的積累, 因此,通過計算就可求出SOD的酶活性。 非變性電泳分離膠分離膠配方 分離膠10%共12ml H2O5ml 30%凝膠貯存液4ml 4X分離膠緩沖液 （PH=8.8） 3ml 10%過硫酸銨200ul TEMED16ul 非變性電泳濃縮膠濃縮膠配方 濃縮膠4.5%共8ml H2O4.8ml 30%凝膠貯存液1.2ml

52、 4X濃縮膠緩沖液 （PH=8.8） 2ml 10%過硫酸銨100ul TEMED10ul 三、實驗步驟 1.1.測蛋白標準曲線的繪制測蛋白標準曲線的繪制 （1 1）蛋白標準樣）蛋白標準樣0.4mg/ml0.4mg/ml： 立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調零。 （2 2）計算出各階段樣品的蛋白濃度。）計算出各階段樣品的蛋白濃度。 mlABCDE空白 蛋白標 準樣ml 0.050.100.150.200.25 DD水0.200.150.100.050.25 G2505.05.05.05.05.05.0 三、實驗步驟 1.1.卡馬斯亮藍法測蛋白卡馬斯亮藍法測蛋白 （1 1）?。┤?7 7只試管，編號，按下表操作：只試管，編號，按下表操作： 立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調零。 （2 2）計算出各階段樣品的蛋白濃度。）計算出各階段樣品的蛋白濃度。 mlABCDE空白 各段樣 品ml 0.010.010.010.050.25 DD水0.240.240.240.200.25 G2505.05.05.05.05.05.0 三、實驗步驟 2.2.酶活性的測定酶活性的測定 （1 1） 鄰苯三酚自氧化速率的測定鄰