微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌病原生物防治作用的研究

1、1 微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌病原生物防治作用的研究微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌病原生物防治作用的研究 鄭雪芳 1，劉波1 ，藍江林1，蘇明星1， 盧舒嫻 1，朱昌雄2，關(guān)雄3 （1、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與可可持續(xù) 發(fā)展研究所，北京 100081；3、福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福州 350002） 摘要摘要：【目的】通過調(diào)查微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬基質(zhì)墊層大腸桿菌及基其毒素基因的數(shù)量分布變化動態(tài)，分析微生物發(fā) 酵床對豬舍大腸桿菌病原的生物防治作用。 【方法】分離不同使用時間、不同層次基質(zhì)墊層的大腸桿菌，利用 pcr 擴增特

2、異性 udia 基因鑒定來鑒定檢測大腸桿菌，并對大腸桿菌 12 種毒素基因進行多重 pcr 檢測。構(gòu)建大腸桿菌 種群分布的動態(tài)模型，分析微生物發(fā)酵床對大腸桿菌病原的生防效果。 【結(jié)果】從不同使用時間不同層次基質(zhì)墊層 分離鑒定出大腸桿菌 419 株，并從這些菌株中檢測出 59 株攜帶大腸桿菌毒素基因大腸桿菌，毒素基因為 8 種， 。其 中 1 個月的基質(zhì)墊層的毒素基因陽性檢出率最高為 22.47%，其次是 7 個月的基質(zhì)墊層大腸桿菌毒素基因陽性檢出率 為 16.50%，9 個月基質(zhì)墊層大腸桿菌毒素基因陽性檢出率最低為 4.23%。其中基質(zhì)墊層的毒素基因陽性檢出率最高 在 1 個月，為 22.47

3、%，其次在 7 個月，為 16.5%,檢出率最低的在 9 個月，為 4.23%大腸桿菌在微生物發(fā)酵床基質(zhì)墊 層種群數(shù)量時間變化規(guī)律為：隨著使用時間的增加種群數(shù)量逐步減少；種群數(shù)量空間變化規(guī)律為：在表層（第 1 層 010cm） 和底層（第 4 層 6070cm）分布量最大，在第 2 層（2030cm）分布量最少。大腸桿菌毒素基因的分布 規(guī)律與之類似。從構(gòu)建的大腸桿菌種群分布動態(tài)模型可以看出，基質(zhì)墊層第 1 層（y=169.67x-1.0137）和第 3 層 （y=313.11x-2.1885）大腸桿菌種群數(shù)量隨使用時間呈指數(shù)線性方程分布，；第 2 層（y=0.1006x3-2.3733x2+1

4、6.094x- 22.454）和第 4 層（y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513）大腸桿菌種群數(shù)量隨使用時間呈一元三次方程分布，基 質(zhì)墊層能明顯抑制大腸桿菌的生長，?；|(zhì)墊層使用后期（第 9 個月）比使用初期（第 1 個月）大腸桿菌種群數(shù)量 明顯減少，降低幅度在 67.45%96.53%，說明微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌病原能起到顯著的生物防治作用?！窘Y(jié) 論】微生物發(fā)酵床能夠抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因大腸桿菌的生長，且其對大腸桿菌病原的生防效果隨著使 用時間的延長而增加。 關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：微生物；發(fā)酵床養(yǎng)豬；生物防治；大腸桿菌；毒素基因。 study on t

5、he biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathogen escherichia coli in the piggery zheng xuefang1, liu bo1*, lan jianglin1,shu mingxing1, lu shuxian1, zhu changxiong2, guan xiong3 (agricultural bio-resources research institute, fujian academy of agricultural sciences, fujian fuz

6、hou 350003; 2. institute of environment and sustainable development in agriculture, chinese academy of agricultural sciences, beijing 100081; 3. key laboratory of biopesticide and chemical biology, fujian 基金項目：基金項目：國家水體污染控制與治理科技重大專項-華南村鎮(zhèn)塘壩地表飲用水安全保障適用技術(shù)研究與示范（no.2008zx07425-002） ；福建 省財政專項-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新

7、團隊建設(shè)基金（no.stif-y03） supported by the national key technology program for water body pollution control and rectification（no.2008zx07425-002） and the financial department of fujian government-science；technology innovation foundation of faas(no.stif-y03) 作者簡介作者簡介：鄭雪芳（1977） ，女，助理研究員,e-mail: ；*通訊作者（責(zé)任作者）

8、通訊作者（責(zé)任作者） ，e - mail： biography: zheng xuefang(1977), female, assistant professor, e-mail: ; *corresponding author, e - mail： 2 agriculture and forestry university, ministry of education, fuzhou 350002) abstract: 【objective】 the present paper dealt with the distribution features of escherichia coli

9、and its virulent genes in the stroma cushion of piggery to clear the biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathogen e. coli.【method】the bacterium, e. coli isolated from the different period in each layer of the stroma cushion were analyzed by the method of eosin methylene blue

10、(emb) medium. polymerase chain reaction (pcr) procedure was applied for identification of e. coli by amplifying udia gene dna fragments of e. coli. multiplexpcr was used to detect the virulence genes types of e. coli. a simulation model of e. coli distribution was constructed to analyzse the biocont

11、rol effect in the microbial-fermentation bed.【result】the result showed that 419 isolates were detected to be e. coli among 433 suspected isolates, of which 59 isolates carried the special virulent genes. a total of 8 types of virulent genes were found out, including estb, esta, elt, faeg, feda, aida

12、i, stx2e and sepa. in the samples, e. coli in the one-month- used microbial-fermentation bed had the highest positive rate (22.47%), while that in the nine-months-useds microbial-fermentation bed had the lowest positive rate (4.23%). the distribution rule displayed that the population of e. coli in

13、each layer decreased as the time increased. the less distribution of e. coli population was accrued in the layer 1, while the largest in the layer 4 as well as the least in the layer 2. the distribution rule of virulent genes for e. coli was the similar to the distribution rule of e.coli population.

14、 from the dymamic model of e. coli population, it could be seen that the e. coli populations in the layer 1 (y=169.67x-1.0137) and the layer 3 (y=313.11x-2.1885) were fitted to the exponential distributions, as e. coli population in the layer 2 (y=0.1006x3- 2.3733x2+16.094x-22.454) and the layer 4 (

15、y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513) were followed to simple cubic equation. the cushion stroma of piggery could inhibit the growth of e. coli and the amount of e. coli in the nine-months-used stroma cushion was much more less than that in the one-month-used stroma cushion with decreases ranged from

16、 67.45% to 96.53%, indicating that the microbial-fermentation bed could play an important role in biogicontrol of e.coli in the piggery.【conclusion】the microbial-fermentation bed could restrain the growth of e.coli, especially for the bacteria carried with the virulent genes. the longer the microbia

17、l-fermentation bed was used the more biocontrol effect was on the population of e.coli. key words: microbe; microbial-fermentation bed for raring pig; biocontrol; escherichia coli; virulence gene 【研究意義】生豬疫病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的一道難題。許多研究13表明，豬舍的不良環(huán)境是 許多疾病的誘因，只有給豬提供舒適、干凈的生活環(huán)境才能減少生豬疫病的發(fā)生，提高生豬的生 產(chǎn)能力。微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬是近年我國引進

18、的一種新興養(yǎng)豬模式，它給農(nóng)戶和養(yǎng)殖戶帶來可觀的 經(jīng)濟效益的同時也減輕了對環(huán)境的污染，是一種無污染、無排放、無臭氣的環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù)46。應(yīng) 用微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)，可徹底解決養(yǎng)豬對環(huán)境的污染，改善豬舍環(huán)境，減少生豬疫病。 【前人 研究進展】許多研究表明1,79，微生物發(fā)酵床的基質(zhì)墊層能形成以有益微生物為優(yōu)勢菌群的生物 保護屏障，阻止有害微生物的侵入，對致病菌的定殖產(chǎn)生抑制作用。有些專家1012則認為微生物 發(fā)酵床通過微生物發(fā)酵，使墊料里層溫度高達較高（6070） ，殺滅或抑制細菌、病毒繁殖，從 而有利于生豬健康生長。劉振欽等13調(diào)查發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬與傳統(tǒng)養(yǎng)豬相比，豬死亡率下 降 96% ，可

19、能原因可能是微生物發(fā)酵床墊層形成的平衡穩(wěn)定的微生態(tài)區(qū)系能抑制有害微生物的生 長，有利于保持豬腸道健康，減少豬的腸道疾病。李榮林等14對發(fā)酵床養(yǎng)豬和常規(guī)養(yǎng)豬進行對比 分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵床養(yǎng)豬出現(xiàn)疾病的情況明顯少于常規(guī)養(yǎng)豬，且發(fā)酵床養(yǎng)豬的各項肉質(zhì)指標(biāo)均優(yōu)于 常規(guī)養(yǎng)豬。許多研究已證明微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬能夠降低生豬疫病的發(fā)生，但微生物發(fā)酵床對豬舍 大腸桿菌病原生物防治作用的相關(guān)研究未見報道。 【本研究切入點】 為了闡明微生物發(fā)酵床基質(zhì) 墊層對豬腸道疾病的生防機理，筆者擬以大腸桿菌為耙標(biāo)靶標(biāo)菌，調(diào)查大腸桿菌特別是致病性大 腸桿菌在基質(zhì)墊層的分布動態(tài)，分析微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌病原的防治作用。首先，根據(jù) 大

20、腸桿菌普遍存在的 udia 基因15,16（-d-半乳糖苷酶基因）設(shè)計大腸桿菌的特異檢測引物，用于 微生物發(fā)酵床基質(zhì)墊層大腸桿菌的檢測。其次，采用多重 pcr 法對大腸桿菌攜帶的毒素基因進行 檢測和定型。最后，建立大腸桿菌在基質(zhì)墊層分布的動態(tài)模型。 【擬解決關(guān)鍵問題】本研究通過分 析大腸桿菌及其毒素基因在不同使用時間、不同層次基質(zhì)墊層分布的數(shù)量和類型，得出其分布規(guī) 3 律，旨在為微生物發(fā)酵床規(guī)?；B(yǎng)豬場豬疫病爆發(fā)做出有效的預(yù)測預(yù)報，同時也為今后豬舍環(huán)境 污染及防治提供臨床依據(jù)。 1 材料與方法材料與方法 1.1 材料材料 培養(yǎng)基和試劑：大腸桿菌鑒別選擇性培養(yǎng)基伊紅美藍（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司

21、） ，dna 聚 合酶（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司） ，100bp marker（上海英駿生物技術(shù)有限公司） 。參考 菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株 ro8c（estb+esta+elt+faeg） 、b44a（fana） 、f107a（feda） 、pd20c（aidai） 、 p16ma（fasa） 、amr-47c（stx2e)、jg280c（asta+paa+sepa）由加拿大農(nóng)業(yè)部南方研究中心 edward topp 博士惠贈。 1.2 方法方法 1.2.1 微生物發(fā)酵床大腸桿菌種群動態(tài)調(diào)查 豬舍基質(zhì)墊層取樣于按零污染養(yǎng)豬標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行墊層配比和相關(guān)管理的“零污染排放”養(yǎng)豬 示范基地寧德新科

22、農(nóng)牧發(fā)展有限公司，按照零污染養(yǎng)豬標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行墊層配比和相關(guān)管理。取 樣方法：選擇飼養(yǎng)豬 1 個月、3 個月、5 個月、7 個月和 9 個月的基質(zhì)墊層，進行 4 層取樣（第 1 層 010cm ，第 2 層 2030cm ，第 3 層 4050cm ，第 4 層 6070cm），）。每層取樣方法為采用 五點取樣法，每層的樣本充分混合后取出小樣（10g） ，進行大腸桿菌的分離。 1.2.2 微生物發(fā)酵床大腸桿菌的分離與培養(yǎng) 采用伊紅美藍鑒別特異培養(yǎng)基進行分離。每份個樣品分別稱取 10g，于 90ml 無菌水中進行稀 釋在 90ml 無菌水中。按 10-2、10-3、10-4梯度稀釋樣品，然后各

23、取 200l 稀釋液涂布于伊紅美藍鑒 別特異培養(yǎng)基平板上，處理后倒置于 30暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至長出單菌落。根據(jù)大腸桿菌在伊紅 美藍鑒別培養(yǎng)基會形成黑色帶金屬光澤的菌落形態(tài)特征菌落形態(tài)、色澤、邊緣狀態(tài)、表面干濕狀態(tài) 等特征，挑取各部位出具有代表性的單菌落，并計數(shù)、純化、保存分離得到的菌株。 1.2.3 微生物發(fā)酵床大腸桿菌毒素基因檢測 dna 模板的制備：將分離到的疑似大腸桿菌菌株在用 lb 平板培養(yǎng)基平板上 37純培養(yǎng) 24h， 各挑取 1 個單菌落，分別均勻懸浮于 50l 超純水中；100 10min 后，迅速冰浴 5min，4 10000r/min 離心 1min.，取上清于-20保存?zhèn)溆?/p>

24、。引物設(shè)計：針對大腸桿菌的 udia 基因而設(shè)計 1 對大腸桿菌的特異檢測引物。引物序列如下：udia:5-aaaacggcaagaaaaagcag-3；5- acgcgtggttacagtc ttgcg-3。針對大腸桿菌 12 種毒素基因 （estb、esta、elt、faeg、fana、feda、aidai、stx2e、asta、paa、fasa、sepa）設(shè)計 12 對毒素 基因檢測引物1720，引物序列見表 1。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將 12 種毒素基因分為 3 組進行 4 重 pcr 反應(yīng)。 表表 1 12 種毒素基因的引物分組和序列種毒素基因的引物分組和序列 table

25、1 primers groups and sequences of 12 virulence genes pcr 基因 gene 堿基序列 primer sequence 退火溫度/ annealing() 片段/bp fragment size(bp) 陽性對照 positive control 1 for-tgcctatgcatctacacaat55113 ro8c 1 estb rev-ctccagcagtaccatctcta 1 for-caactgaatcacttgactctt55158 ro8c 1 esta rev-aa ata acatccagcacagg 1 for-ggcg

26、ttactatcctctctat55272 ro8c 1 elt rev-tggtctcggtcagatatgt 1 faegfor-gaatctgtccgagaatatca55499 ro8c 4 1 rev-gttggtacaggtcttaatgg 2 for-aatacttgttcagggagaaa59230 b44a 2 fana rev-aactttgtggttaacttcct 2 for-tggtaacgtatcagcaacta59313 f107a 2 feda rev-acttacagtgctattcgacg 2 for-acagtatcatatggagcca59585 pd2

27、0c 2 aida-1 rev-tgtgcgccagaactatta 2 for-aatagtatacggacagcgat59733 amr-47c 2 stx2e rev-tctgacattctggttgacgc 3 for-tcggatgccatcaacacagt62125 jg280c 3 asta rev- gtcgcgagtgacggctttgtaag 3 for-ggcccgcatacagccttg62282 jg280c 3 paa rev-tctggtcaggtcgtcaatactc 3 for-gta actccaccgtttgtatc62409 p16ma 3 fasa r

28、ev-aagttactgccagtctatgc 3 for-taa aacccgccgcctgagta62611 jg280c 3 sepa rev-tgccggtga acaggaggttt 大腸桿菌的特異檢測：反應(yīng)體系 25l 。總體系為 25l，其中 10pcr buffer 成分為：2.5 l 的 10pcr buffer，10 mm dntp 0.5l 的 10 mm 的 4 種 dntp，10m 引物 1l 的 10m 的引物， taq 酶 1 個單位的 taq 酶和，dna 模板 25 ng 的 dna 模板。pcr 反應(yīng)程序：94 預(yù)變性 3min；94變性 1min，55 退

29、火 30 sec，72 延伸 1min，重復(fù) 35 個循環(huán)；，最后 72延伸 7 min。大腸桿菌毒素基因檢測：采用多重 pcr 法進行大腸桿菌毒素基因檢測，分 3 組 4 重 pcr 不， 反應(yīng)體系均為 25 l，含有 1u taq 酶 1u，10pcr buffer 2.5 l 的 10pcr buffer，10 mm dntp 0.5l 的 10 mm 的 4 種 dntp，10m 引物 1l 的 10m 的引物和 dna 模板 25 ng 的 dna 模板。 3 組反應(yīng)的 pcr 程序，組 i 為預(yù)變性 15 min（95 ） ；變性 1 min（95 ） ，退火 1 min（55 ）

30、 ，延 伸 2 min（72 ） ，重復(fù) 30 個循環(huán)（每下一個循環(huán)退火時間加 3 s） ；最后延伸 10 min（72 ） 。組 ii 為預(yù)變性 15 min（95 ） ；變性 1 min（95 ） ，退火 1 min（59 ） ，延伸 2 min（72 ） ，重復(fù) 30 個循環(huán)（每下一個循環(huán)退火時間加 3 s） ；最后延伸 10 min（72 ） 。組 iii：預(yù)變性 15 min（94 ） ；變性 1 min（94 ） ，退火 1 min（62 ） ，延伸 1 min（72 ） ，重復(fù) 35 個循環(huán)；最后延伸 10 min（72 ） 。pcr 產(chǎn)物的檢測：取 10 l pcr 產(chǎn)物，點樣

31、于 1.5%的瓊脂糖凝膠中，以 100 bp marker 作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，120 v 電壓、1 倍 tae 緩沖液中電泳 2 h，eb 染色，采用凝膠成像系統(tǒng)觀 察結(jié)果。 2 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 2.1 大腸桿菌毒素基因檢測大腸桿菌毒素基因檢測 2.1.1 大腸桿菌的特異檢測大腸桿菌的特異檢測 從不同使用時間、不同層次的基質(zhì)墊層中分離的 433 株疑似大腸桿菌經(jīng)大腸桿菌特異檢測引物 的鑒定結(jié)果如圖 1 所示，這對引物在大腸桿菌菌株擴增出大小約 150bp 的條帶，在清水對照和不是 大腸桿菌的菌株中沒有擴增出相應(yīng)的片段，說明這對引物對大腸桿菌是特異的，同時，也說明零污 染養(yǎng)豬豬舍基質(zhì)墊層有大

32、腸桿菌的存在。分離的 433 株疑似大腸桿菌中檢測出 419 株為陽性，陽性 率為 96.77%，分別是在 1 個月基質(zhì)墊層分離的 94 株疑似大腸桿菌中檢測出 89 株陽性，3 個月基質(zhì) 墊層分離的 63 株疑似大腸桿菌中檢測出 60 株陽性菌株，5 個月基質(zhì)墊層分離的 96 株疑似大腸桿 5 菌中經(jīng)檢測全部為陽性菌株，7 個月基質(zhì)墊層分離的 106 株疑似大腸桿菌中檢測出株 103 株陽性菌 株，9 個月基質(zhì)墊層分離的 74 株疑似大腸桿菌中檢測出 71 株陽性菌株。 圖 1 大腸桿菌特異檢測圖譜 注：111 為大腸桿菌陽性檢測；1215 為大腸桿菌陰性檢測；16 為陽性對照；17 為陰性

33、對照；m 為分子量標(biāo)準(zhǔn) （3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10 0bp） fig.1 pattern of pcr specifically amplification with e.coli note：lanes 111：escherichia coli positive by pcr ; lanes 1215 : escherichia coli negative; lane 16 is positive control; lane 17 is negati

34、ve control; lane m is dna size marker 2.1.2 大腸桿菌毒素基因的檢測大腸桿菌毒素基因的檢測 （1）大腸桿菌毒素基因檢測：利用建立的多重 pcr 對 419 株經(jīng)鑒定為大腸桿菌的菌株進行毒 素基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中存在 12 種毒素基因中的 8 種毒素基因，分別是第 1 組毒素基因 estb、esta、faeg、 elt，第 2 組毒素基因 feda、aidai、stx2e 和第 3 組毒素基因 sepa。擴增產(chǎn)物 大小與陽性對照一致（圖 2） 。 圖 2 大腸桿菌毒素基因 pcr 檢測圖譜 注：15 為大腸桿菌毒素基因第 1 組檢測結(jié)果，其中 4

35、為陽性對照 ro8c，5 為空白對照；611 為大腸桿菌毒素基 因第 2 組檢測結(jié)果，其中 9 為陽性對照 pd20c，10 為陽性對照 amr-47c，11 為空白對照；1217 為大腸桿菌毒素 基因第 3 組檢測結(jié)果，其中 15 為陽性對照 p16ma，16 為陽性對照 jg280c，17 為空白對照；m 為分子量標(biāo)準(zhǔn) （3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10 0bp） fig.2 pcr electrophoretogram for detection of

36、 virulence genes of escherichia coli note: 15 is the result of pcr detection of virulence genes of escherichia coli with primer group, and no.4 is positive control ro8c, no.5 is negative control; 611 is the result of pcr detection of virulence genes of escherichia coli with primer group, and no.9 is

37、 positive control pd20c, no.10 is negative control; 1217 is the result of pcr detection of 6 virulence genes of escherichia coli with primer group, and no.15 is positive control p16ma, no.17 is negative control; m is dna marker(3000bp, 2000bp, 1500bp, 1200bp, 1031bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500b

38、p, 400bp, 300bp, 200bp,100bp) （2）大腸桿菌毒素基因數(shù)量分布：結(jié)果見表 2。從在 1 個月基質(zhì)墊層中分離到的 89 株大腸桿 菌中檢測到 20 株含有毒素基因，陽性檢出率為 22.47%；，其中 5 株攜帶 estb 基因，2 株攜帶 elt 基因，6 株攜帶 faeg 基因，1 株攜帶 aidai 基因，2 株攜帶 sepa 基因， 1 株攜帶 faeg +sepa 2 種 毒素基因的菌株，1 株攜帶 faeg +stx2e 2 種毒素基因，1 株攜帶 estb+faeg+elt 3 種毒素基因，1 株 攜帶 estb+esta+feda 3 種毒性因；3 個月

39、基質(zhì)墊層分離到的 60 株大腸桿菌中檢測出 7 株含有毒素 基因，陽性檢出率為 11.67%，基中 1 株攜帶 esta 基因，4 株攜帶 faeg 基因，1 株攜帶 aidai 基 因，1 株攜帶 esta+faeg 2 種毒素基因；5 個月基質(zhì)墊層分離的 96 株大腸桿菌中檢測出 13 株含有毒 素基因，陽性檢出率為 13.54%；其中 1 株攜帶 esta 基因，1 株攜帶 faeg 基因，2 株攜帶 feda 基因、 2 株攜帶 stx2e、2 株攜帶 aidai 基因，2 株攜帶 stx2e+aidai 2 種毒素基因，3 株攜帶 feda+stx2e+aidai 3 種毒素基因；7

40、 個月基質(zhì)墊層分離的 103 株大腸桿菌中檢測出 14 株含有毒素 基因，陽性檢出率為 13.59%；其中 1 株攜帶 estb 毒素基因，4 株攜帶 faeg 基因，2 株攜帶 elt 基因， 4 株攜帶 aidai 基因，1 株攜帶 elt+faeg 2 種基因，1 株攜帶 esta+ faeg 2 種基因，1 株攜帶 estb+esta+ faeg 3 種毒素基因。 ；9 個月基質(zhì)墊層分離的 71 株大腸桿菌中檢測出 3 株含有毒素基因， 陽性檢出率為 4.23%。其中 1 株攜帶 feda 基因、1 株攜帶 elt 基因，1 株攜帶 stx2e+aidai 2 種毒素 基因。見表 2。

41、 表 2 不同使用時間基質(zhì)墊層大腸桿菌毒素基因的檢測結(jié)果 table 2 result of escherichia coli virulence genes detection from different using time stroma cushion 使用時間 using time 檢測數(shù)量 amount of detection 毒素基因類型 types of virulence gene 毒素基因檢出量 quantities of virulence genes 毒素基因檢出率 raitio of virulence genes（%） estb55.62 elt22.25 fae

42、g66.74 aidai11.12 sepa22.25 faeg +sepa 22.25 faeg +stx2e11.12 estb+faeg+elt11.12 1 個月 基質(zhì)墊層 one month stroma cushion 89 estb+esta+feda11.12 esta11.67 faeg46.67 aidai11.67 3 個月基質(zhì)墊層 three months stroma cushion 60 esta+faeg11.67 esta11.04 faeg11.04 feda22.08 stx2e22.08 aidai22.08 5 個月基質(zhì)墊層 five months st

43、roma cushion 96 stx2e+aidai22.08 7 feda+stx2e+aidai33.13 estb10.97 faeg43.88 elt21.89 aidai43.88 elt+faeg10.97 esta+ faeg10.97 7 個月基質(zhì)墊層 nine months stroma cushion 103 etb+esta+ faeg10.97 feda11.41 elt11.41 9 個月基質(zhì)墊層 nine months stroma cushion 71 stx2e+aidai11.41 （3）大腸桿菌毒素基因特征分布：從不同使用時間、不同層次基質(zhì)墊料分離的攜帶毒

44、素基因 的大腸桿菌菌株中分析，只攜帶單一的毒素基因菌株占 74.14%，同時攜帶兩種毒素基因的菌株占 15.52%，同時攜帶 3 種毒素基因的菌株占 10.34%。毒素基因 aida-1 在不同使用時間的基墊料中均 有分布，而毒素基因 faeg 和 esta 只在基質(zhì)墊料使用的前期中分布，在基質(zhì)墊料使用的后期（9 個 月開始）并沒有分布。毒素基因 faeg、estb 和 feda 在不同層次的基質(zhì)墊料中均有分布，而毒素基 因 elt、esta、aida-1、stx2e 和 sepa 只分布在基質(zhì)墊料的第 1、3、4 層，在基質(zhì)墊料的第 2 層沒有 分布。 2.2 微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊層大腸桿菌種

45、群毒素基因分布動態(tài)微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊層大腸桿菌種群毒素基因分布動態(tài) （1）大腸桿菌種群毒素基因時間分布動態(tài)：不同使用時間的基質(zhì)墊層大腸桿菌毒素基因類型 和分布數(shù)量存在較大差異（表 3） 。1 個月新鮮墊層分布的毒素基因種類和數(shù)量最多，毒素基因分布 總量為 2.08105 cfu/mlg， ；9 個月基質(zhì)墊層大腸桿菌毒素基因分布數(shù)量最低，毒素基因分布總量為 5.0104 cfu/mlg。1 個月新鮮墊層分布 912 種毒素基因中的 8 種毒素基因，分別是 faeg、elt、esta、estb、feda、aida-1、stx2e 和 sepa，其中 sepa 基因（耐藥性因子）分布量最大， 為 7

46、.0104 cfu/mlg，stx2e 基因（志賀氏毒素）分布量最低，為 1.0103 cfu/mlg；3 個月基質(zhì)墊層 分布 3 種毒素基因，分別是 faeg、esta 和 aida-1；5 個月基質(zhì)墊層分布 5 種毒素基因，分別是 faeg、esta、feda、aida-1 和 stx2e，其中 feda 基因（菌毛 a 亞單位基因）分布量最大，為 5.9104 cfu/mlg，faeg 基因（菌毛蛋白基因）分布量最低，為 1.0103 cfu/mlg；7 個月基質(zhì)墊層分布 6 種 毒素基因，分別是 faeg、elt、esta、estb、feda 和 aida-1，其中 faeg 基因分布

47、量最大，為 1.0105 cfu/mlg，feda 基因分布量最低，為 1.0103 cfu/mlg；9 個月基質(zhì)墊層分布 4 種毒素基因，分別是 elt、feda、aida-1 和 stx2e，feda 分布量為 2.0104 cfu/mlg，elt、aida-1 和 stx2e 分布量為 1.0104 cfu/mlg。隨著墊料使用時間的延長，毒素基因在基質(zhì)墊層中的分布漸少，說明基質(zhì)墊層使用一段 時間后的使用能抑制以大腸桿菌為耙標(biāo)靶標(biāo)菌的病原菌的生長。 表 3 大腸桿菌不同毒素基因類型時間分布特征（cfu/mlg） table 3 quantities of escherichia coli

48、 virulence gene in the stroma cushion of non-pollution pigsty 毒素基因類型 types of virulence gene（103）基質(zhì)墊層使用時間 using time of stroma cushionfaegeltestaestbfedaaida-1stx2esepa 1 個月基質(zhì)墊層 one month stroma cushion 35.030.011.049.02.010.01.070.0 3 個月基質(zhì)墊層 three months stroma cushion 71.00.040.00.00.040.00.00.0 5

49、 個月基質(zhì)墊層1.00.020.00.059.016.03.40.0 8 five months stroma cushion 7 個月基質(zhì)墊層 nine months stroma cushion 1.060.010.05.04.070.00.00.0 9 個月基質(zhì)墊層 nine months stroma cushion 0.010.00.00.020.010.010.00.0 （2）大腸桿菌種群毒素基因空間分布動態(tài)：大腸桿菌毒素基因在微生物發(fā)酵床基質(zhì)墊層的空 間分布動態(tài)如表 4 所示，各毒素基因基本上都是在第 1 層分布量最大，在第 2 層分布量最低。 faeg、estb 和 feda

50、3 種毒素基因在基質(zhì)墊層各層次均有分布；elt、stx2e 和 sepa 3 種毒素基因毒素 基因分布規(guī)律相同，只分布在基質(zhì)墊層的第 1、3 和 4 層，且第 1 層分布量最大，其次是第 3 層， 第 2 層沒有分布；esta 毒素基因 和 aida-1 毒素基因分布規(guī)律相同，都只分布在第 1、3、4 層，且 第 3 層分布量最大，其次是第 1 層，第 2 層沒有分布。 表 4 大腸桿菌不同毒素基因類型在基質(zhì)墊層空間分布特征（cfu/mlg） table 3 quantities of escherichia coli virulence gene in the stroma cushion

51、of non-pollution pigsty 毒素基因類型 types of virulence gene（103）基質(zhì)墊層使用時間 using time of stroma cushionfaegeltestaestbfedaaida-1stx2esepa layer 1150.060.026.05.023.050.033.030.0 layer 230.00.00.02.033.00.00.00.0 layer 3100.030.045.027.017.070.011.020.0 layer 410.010.010.020.012.026.01.120.0 2.3 微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊層大

52、腸桿菌種群空間分布動態(tài)微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊層大腸桿菌種群空間分布動態(tài) 不同使用時間、不同層次的基質(zhì)墊層大腸桿菌的分布見圖 2，從基質(zhì)墊層的不同使用時間來看， 隨著使用時間的增加，基質(zhì)墊層大腸桿菌分布量減少，這可能是因為基質(zhì)墊層使用一段時間后，墊 層 c 源和 n 源等微生物生長的必須營養(yǎng)成分含量降低，從而限制微生物的生長包括大腸桿菌的生 長；從基質(zhì)墊層的不同層次來看，基質(zhì)墊層的表層（layer1）大腸桿菌分布量最多，其次是底層 （layer4） ，基質(zhì)墊層的第二層（layer2 離表層 3040cm）分布量最少，大腸桿菌在基質(zhì)墊層的這 種分布規(guī)律與大腸桿菌的生長條件相關(guān)。大腸桿菌屬兼性厭氧菌，適

53、宜生長溫度為 15-46，最適 生長溫度為 37?；|(zhì)墊層表層通氣量好，且溫度（25-35）適宜，故大腸桿菌在基質(zhì)墊層的表 層分布量最大；基質(zhì)墊層底層雖通氣量差，但為大腸桿菌的生長營造了厭氧環(huán)境，且溫度適宜，所 以也分布量較大；基質(zhì)墊層的第二層溫度高達 55-65，不適大腸桿菌生長，故大腸桿菌在基質(zhì)墊 層的第二層分布量最少。大腸桿菌屬兼性厭氧菌，在有氧條件下生長良好，在無氧條件下也能生長， 生長溫度范圍為 15-46，最適生長溫度為 37，基質(zhì)墊層表層通氣量最好，溫度 25-35（夏季） 最適大腸桿菌生長，所以，大腸桿菌在基質(zhì)墊層的表層分布量最大，基質(zhì)墊層底層雖然通氣量差， 但是大腸桿菌屬于兼

54、性厭氧菌，在無氧條件下也能生長，且底層溫度 30-40（夏季）最適大腸桿 菌生長，故基質(zhì)墊層底層也分布較多的大腸桿菌，基質(zhì)墊層的第二層由于溫度高（約 55-65）不 適大腸桿菌生長，幫大腸桿菌在基質(zhì)墊層的第二層分布量最少。 9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 大腸桿菌的分布數(shù)量（104）

55、cfu/mlg amount of escherichia coli distribution in stroma cushion 圖 2 零污染養(yǎng)豬豬舍基質(zhì)墊層大腸桿菌的分布動態(tài) fig.2 distribution of escherichia coli in the stoma cushion of non-pollution pigsty 2.4 微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌生物防治的效果微生物發(fā)酵床對豬舍大腸桿菌生物防治的效果 以基質(zhì)墊層使用時間為“x”變量，以大腸桿菌在基質(zhì)墊層不同層次的分布數(shù)量為“y”變量，構(gòu)建 大腸桿菌在不同使用時間、不同層次基質(zhì)墊層的分布動態(tài)的回歸模型。從圖 3

56、 可以看出，基質(zhì)墊層 表層（第 1 層）大腸桿菌種群數(shù)量從剛開始使用第 1 個月的 4.67105 cfu/mlg 下降至使用第 9 個月 的 1.52105 cfu/mlg，下降幅度為 67.45%，基質(zhì)墊層表層大腸桿菌種群數(shù)量隨使用時間變化符合 方程 y=169.67x-1.0137（r2=0.8461），相關(guān)系數(shù) r2=0.8461；基質(zhì)墊層第 2 層大腸桿菌種群數(shù)量隨使 用時間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)在使用第 3 個月的基質(zhì)墊層，符合方程 y=0.1006x3- 2.3733x2+16.094x-22.454 （r2=0.7692），相關(guān)系數(shù) r2=0.7692；基質(zhì)墊層第 3

57、 層大腸桿菌分布數(shù)量 隨使用時間變化與第 1 層相似，符合指數(shù)線性方程 y=313.11x-2.1885（r2=0.7421），相關(guān)系數(shù) r2=0.7421，大腸桿菌種群數(shù)量從使用第 1 個月的 1.93105 cfu/mlg 下降至使用第 9 個月的 6.70103 cfu/mlg，下降幅度為 96.53%；基質(zhì)墊層最底層（第 4 層）大腸桿菌分布數(shù)量隨使用時間 呈先降后升再降的變化趨勢，大腸桿菌分布數(shù)量最大值出現(xiàn)在使用 7 個月的基質(zhì)墊層，分布量為 2.42105 cfu/mlg，基質(zhì)墊層底層大腸桿菌種群數(shù)量隨使用時間的的變化符合方程 y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634

58、x+79.513（r2=0.90），相關(guān)系數(shù) r2=0.90?？傮w上，大腸桿菌在基質(zhì)墊層不同層 次的分布數(shù)量都比豬糞便直接分離的大腸桿菌少 10000 倍，且隨著墊層的使用，基質(zhì)墊層形成平衡 穩(wěn)定的微生態(tài)體系，對大腸桿菌生物防治效果更為明顯。 y = 169.67x-1.0137 r2 = 0.8461 0 10 20 30 40 50 60 13579 使用時間（月）using period(months) 大腸桿菌分布數(shù)量（104） cfu/mlg distribution of e.coli y = 0.1006x3 - 2.3733x2 + 16.094x- 22.454 r2 = 0

59、.7692 0 2 4 6 8 10 12 14 13579 使用時間（月）using period(months) 大腸桿菌分布數(shù)量（104） cfu/mlg distribution of e.coli 大腸桿菌在不同使用時間基質(zhì)墊層第 1 層的分布動態(tài)大腸桿菌在不同使用時間基質(zhì)墊層第 2 層的分布動態(tài) 1 month litter system 3months litter system 5 months litter system 7 months litter system 9months litter system 10 distribution pattern of escher

60、ichia coli from stroma cushion of layer 1 in different using period distribution pattern of escherichia coli from stroma cushion of layer 2 in different using period y = 313.11x-2.1885 r2 = 0.7421 0 10 20 30 40 13579 使用時間（月）using period(months) 大腸桿菌分布數(shù)量（104） cfu/mlg distribution of e.coli y = -0.315