微小牛蜱4D8基因原核表達及免疫原性分析

1、動物醫(yī)學進展 ,2009 ,30 (10) :11214 pro gre s s i n vet e ri na r y me dici ne 3微小牛蜱 4d8 基因原核表達及免疫原性分析宏 3,羅建勛 3劉軍龍 ,關貴全 ,李有全 ,馬米玲 ,劉愛紅 ,任巧云 ,殷(家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 ,農業(yè)部草食動物疫病重點實驗室 ,甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 ,甘肅蘭州 730046)摘要 :按 ge nba nk 已知微小牛蜱的 4d8 基因核苷酸序列設計 1 對表達引物 。提取微小牛蜱幼蜱總rn a ,反轉錄合成雙鏈 cdn a ,用設計的表達引物擴增出

2、 4d8 基因 ,擴增得到的核苷酸長 486 bp ,編碼 161 個氨基酸 ,該蛋白預計分子質量為 18 k u 。將該基因亞克隆到原核表達載體 p gex4 t21 ,構建重組原核表達 載體 p gex4 t2124d8 ,轉化 bl 21 宿主菌 ,經 ip t g 誘導 ,可成功表達 。重組融合蛋白分子質量為 45 k u 左 右 ,與預期大小一致 。we st e r n blo t 顯示 ,兔抗微小牛蜱唾液腺 、腸道和卵巢抗體能夠識別重組表達蛋白 。關鍵詞 :微小牛蜱 ;4d8 基因 ;原核表達中圖分類號 : q786 ; s852 . 746文獻標識碼 : a文章編號 :1007

3、25038 (2009) 1020011204微小牛蜱是動物的一種重要外寄生蟲病 ,它廣泛存在于我國華北 、華中 、華東 、華南和西南地區(qū)的 大部分省區(qū) 。微小牛蜱作為一種外寄生蟲和一些病原的傳播媒介 ,它本身和它傳播的多種疾病給人類和動物生產造成了極大的危害 ,例如萊姆病 、埃里克 體病和人無形體病等 ,動物性疾病有巴貝斯蟲病 、泰 勒蟲病等 ?，F在對蜱的防控主要應用殺蟲劑滅殺 ,但蜱抗藥性 、食品和環(huán)境污染問題使藥物滅殺方法 的應用越來越謹慎 。因此 ,人們對蜱的防控轉移到 免疫學方法 ,1989 年微小牛蜱 b m86 基因的發(fā)現 1 , 在抗蜱疫苗的研究中具有突出的意義 ,b m86

4、疫苗在 國外已經商品化并在澳大利亞和古巴廣泛應用 223 ,在微小牛蜱的防治上發(fā)揮了重要作用 。隨著抗蜱疫 苗研究的深入 ,擁有良好抗原性的蛋白不斷被發(fā)現 。 ri di ng j a 等 4 發(fā)現微小牛蜱 b m91 抗原 ,澳大利亞 的 pet e r 等將 b m91 抗原與 b m86 抗原的聯合免疫 , 免疫效 果 明 顯 優(yōu) 于 b m86 單 獨 免 疫 效 果 5 。co n2suelo 等在肩板硬蜱幼蟲的 cdn a 文庫中發(fā)現 4d8 基因 ,用 4d8 基因表達的蛋白免疫動物表明 4d8 表 達蛋白對蜱的吸血與產卵都有明顯的影響 6 。相關 研究表明 4d8 基因存在于多

5、種蜱內 , rn a 干擾試驗 表明該基因對蜱的消化和生殖系統具有一定 的作用 7 。本研究對微小牛蜱的 4d8 基因進行克隆表達 , 并對表達產物進行免疫原性分析 ,為該基因在微小 牛蜱疫苗的研究提供依據 。材料與方法11 . 1 材料1 . 1 . 1 微小牛蜱 采自四川省甘孜州黃牛體表的 微小牛蜱飽血雌蜱 ,經傳代培養(yǎng)成饑餓幼蜱 。1 . 1 . 2 載體 、菌株和血清 大腸埃希菌 j m109 購 自 寶 生 物 工 程 ( 大 連 ) 有 限 公 司 ; 表 達 載 體 p gex4 t21 、大腸埃希菌 bl 21 購自 a mer sha m 公 司 ,牛抗微小牛蜱唾液腺 、腸道

6、和卵巢血清為本試驗 自行制備 。trizol 總 rn a 提取試劑盒購自 in21 . 1 . 3試劑vit ro ge n 公 司 ; u niver sal ri bo clo ne cdn a 合成 試劑盒購自 pro me ga 公司 ; 菌種 bl 21 及原核表達載 體 p gex24 t21 均由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所甘肅省寄生蟲重點實驗室保存 ;p gem2t ea sy 克 隆載體 、限制性內切酶 eco r 、n ot 、t4 dn a 連 接酶 、pcr 試劑盒 、dn a 凝膠回收試劑盒 、dn a 質 粒 提 取 試 劑 盒 、dn a ma r ke r (

7、 dl 2 000 和 dl 15 000) 、異丙基22d2硫代半乳糖苷 ( ip t g) 均購 自寶生物工程 (大連) 有限公司 。1 . 2 方法1 . 2 . 1微小 牛蜱 4d8 基 因 表達 引物 設 計根 據ge nba n k 公布的 4d8 基因序列 ,運用 oligo ( d t) 軟件設計并合成以下引物 :上 游 引 物 : 52 c g ga a t tc a t gg c t t gt gc g a ca t ta a g c gga2 3收稿日期 :2009205218基金項目 :國家自然科技資源共享平臺項目 (2005d ka21100) ;國家“十一五”科技支

8、撐計劃項目 (2007bad40b06)作者簡介 :劉軍龍 (1980 - ) ,男 ,河北保定人 ,研究實習員 ,碩士 ,主要從事蜱及蜱傳病學研究 。 3 通訊作者3下游 引 物 : 52 t gg c ggcc g c t ta c ga c中分別加入 5 sd s 上樣緩沖液混勻后煮沸 5 mi n ,稍加離心取 10 l 進行 sd s2pa ge 檢測 。電泳結 束后 ,用考馬斯亮藍 g2250 染色約 2 h 。脫色后觀察 結果 ,并與蛋白質 ma r ke r 比較 ,計算目的蛋白分子 質量 。1 . 2 . 4 . 2 we st er n blo t 檢測 將表達產物經 sd

9、 s2pa ge 電泳分離并轉印到 n c 膜上 。取下 n c 膜 ,置 于含 50 g/ l 明膠的 tb s t 中封閉 2 h 后 , 用 tb s t 漂洗 3 次 ,每次 10 mi n 。將膜置于 1 100 稀釋的兔 抗微小牛蜱陽性血清中 , 37 振搖孵育 2 h 。同前漂洗后加入 1 10 000 稀釋的堿性磷酸酶標記的羊 抗兔 ig g 中 ,37 輕微振搖孵育 2 h 。同前漂洗后 置顯色液 ( 含 nb t 和 b cip 各 4 l / ml ) 中顯色 , 當絳紫色陽性帶出現時用蒸餾水漂洗終止 。同時用 未經微小牛蜱感染的家兔血清作陰性對照 。a a a t gg

10、c t gggc g ta gca t gc t ca g cca t t t gt c gta a g2 3a c gcc上下游引 物 中 下 劃 線 部 分 分 別 為eco r 和n ot 酶切位點寶生物工程 (大連) 有限公司合成 。1 . 2 . 2 目的基因的克隆和原核表達1 . 2 . 2 . 1 目的基因的克隆 應用 trizol 方法提取 微小牛蜱幼 蜱總 r rn a , 稱 取 100 mg 微 小牛 蜱幼 蜱 ,加入 1 ml trizol 試劑研磨后離心 ,取上清液用 氯仿抽提 ,異丙醇沉淀 , 再用 750 ml / l 乙醇洗滌 ,最 后 將 提 取 的 rn a

11、 重 溶 于 無 rn a se 水 中 , 置- 70 保存 。以微小牛蜱總 rn a 為模板 ,利用 u2niver sal ri bo clo ne cdn a 合 成 試 劑 盒 合 成 的 cd2n a 。并以此 cdn a 為模板 ,利用表達引物擴增目的 基因 。反應體系為 50 l : 滅菌去離子水 37 . 7 l , dn t p 混合 物 ( 2 . 5 mmol/ l ) 4 l , 上 、下游 引物 (10 p mol/l ) 各 1 l , 10 pcr 緩沖液 5 l ,模 板 1 l , taq dn a 聚合酶 0 . 3 l 。擴增程序為 :96 3 mi n

12、預變性 ; 92 1 mi n 、58 1 mi n 、72 1 mi n ,35 個循環(huán) ;72 延伸 10 mi n 。擴增結束后 ,取 5 l 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 。1 . 2 . 2 . 2 pcr 產物的連接與鑒定 用膠回收試劑 盒回收 pcr 產物 。把回收產物與 p gex4 t21 載體 用 eco r 和 n ot 酶 37 酶切 5 h ,利用 dn a 凝 膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化載 體片段 ,并將此帶有黏性末端的目的基因與線性化載體 連接 ,構建表達載體 。將連接產物轉化 bl 21 感受態(tài) 細胞 ,挑取單菌落增菌提取質粒 ,再次進行 pcr 和 酶

13、切鑒 定 。重 組 質 粒 命 名 為 p gex24 t2124d8 。鑒 定正確的陽性菌液進行測序分析 。1 . 2 . 3重組菌的誘導表達及表達產物的電泳分析 用 p gex24 t2124d8 質粒轉化 e. col ibl 21 感受態(tài) 細胞 ,挑單個菌落接種于含氨芐青霉素的 lb 液體 培養(yǎng)基中 ,37 培養(yǎng)過夜 。按 1 50 的比例將此菌 液接 種 于 30 ml 的 2 yt 誘 導 培 養(yǎng) 基 中 ( 含50 g/ ml 氨芐青霉素) 37 培養(yǎng) 3 h , 然后 加入 ip t g 至終濃度 1 mmol/ l 誘導 4 h , 12 000 r/ mi n 離心 3 m

14、i n 后收集菌體進行表達產物的檢測 ,并以 空載體在相同的條件下誘導作為對照 。1 . 2 . 4 表達產物的檢測結果22 . 14d8 基因的獲得pcr 方法從微小牛蜱幼蜱 cda n 中擴增得到480 bp 左右的條帶 ,與預期結果一致 (圖 1) 。m. dn a 標準 dl 2 000 ;14 . pcr 擴增產物m. dn a ma r ker dl 2 000 ;124 . pcr p ro duct s圖 1 pcr 產物電泳結果fig . 1 elect rop ho re si s resul t of pcr p ro duct s2 . 2微小牛蜱 4d8 基因的分析4

15、d8 基因測序結果由 486 個核苷酸堿基組成 , 編碼 162 個氨基酸 ,氨基酸分子質量為 27 k u 。測序 所得的 4d8 基因序列與國外已發(fā)表的微小牛蜱 4d8 基因序列同源性分別為 98 % , 98 . 2 % , 編碼氨基酸 的同源性為 99 . 3 % 。2 . 34d8 基因表達產物的 sds2pa ge 檢測和 west2ern blot 分析2 . 3 . 1sd s2pa ge 電泳檢測電泳檢測結果表明 ,4d8 基因表達的蛋白與 p gex24 t21 載體共同表達45 k u 的融合蛋白 ,通過對菌體超聲破碎的沉淀和上1 . 2 . 4 . 1sd s2pa g

16、e 檢測將上述所得菌體重懸于 pb s (p h 7 . 4) 中 , 反復凍融數次后經超聲裂解 ,在 4 以 12 000 r/ mi n 離心 10 mi n ,分離細菌裂解 液上清液備用 。將沉淀混懸在 9 倍體積含 pb s 的 緩沖液中 。向上述細菌裂解液上清和洗滌所得沉淀清電泳檢測 , 表明此融合蛋 白以 包 涵體 形式 存在 。根據 p gex24 t21 載體的谷胱甘肽 ( gs t) 標簽 ,用谷胱甘肽的親和層析 純化 融合 蛋白 p gex24 t2124d813劉軍龍等 :微小牛蜱 4d8 基因原核表達及免疫原性分析(圖 2) 。2 . 3 . 2 表達產物的 we st

17、 e r n blo t 檢測 表達產物 經 sd s2pa ge 電泳后轉移至 n c 膜上進行免疫印 跡分析 。結果顯示 ,表達產物可與兔抗微小牛蜱唾液腺 、腸道和卵巢的血清反應 ,表明該融合蛋白具有抗原性 ,同時表明 4d8 基因在微小牛蜱的唾液腺 、腸 道和卵巢都有分布 (圖 3) 。m . 蛋白分子質量標準 ;1 . 菌體超聲沉淀 ; 2 . 菌體超聲上清 ;3 . 純化的融合蛋白m . 蛋白分子質量標準 ;1 . 重組蛋白與兔抗蜱唾液腺血清作用 ;2 . 重組蛋白與兔抗蜱卵巢血清作用 ; 3 . 重組蛋白與兔抗蜱腸道 血清作用 ;4 . 重組蛋白與陰性兔血清作用m . prot e

18、i n molecula r wei ght ma r ker ; 1 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick salivar y gland ser u m ;2 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick o va r y ser u m ;3 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick gut ser u m ;

19、4 . reco mbi nant p ro t ei n react ed wit h t he negative ser um圖 3 表達產物的免疫印跡分析fi g. 3 we st er n2blo t a nal ysi s of 4d8 reco mbi nant p rot ei nm . pro t ei n molecular weight ma r ker ;1 . precipit atio n of ult ra so nicbact eria ;2 . super nat a nt of ult ra so nic bact eria ;3 . purified p r

20、o t ei n圖 2 表達產物的 sds2pa ge 分析fig. 3 sds2pa ge a nal ysi s of t he exp re ssed p ro duct基因沉默導致變異革蜱的唾液腺 、腸道和生殖系統發(fā)育不良 。鑒于 4d8 基因在蜱吸血和產卵過程中發(fā) 揮的作用 ,會影響到下一代蜱的發(fā)育生長 , de la fu2e nt e j 等將 4d8 基因命名為 subole si n 。飽 血雌 蜱4d8 基因的沉默 , 也會導致微小牛蜱 、肩板硬蜱 、變討論自從微小牛蜱 b m86 重組蛋白成功用于微小牛 蜱防控以來 ,蜱疫苗的研制就集中到了蜱保護性抗 原的篩選工作上 。很

21、多具有良好保護性的抗原相繼 被發(fā)現 ,例 如 微 小 牛 蜱 b m91 、b m95 蛋 白 和 b m t1 抑肽酶 829 ,具尾扇頭蜱 64 p 膠結蛋白 10 ,長角血蜱 p 29 蛋白和 hl 34 蛋白等等 11212 。這些蛋白在蜱的 生長過程中發(fā)揮著不同作用 ,它們的發(fā)現為蜱疫苗 的研制奠定良好的基礎 。但這些蛋白存在的位置一 定 ,而且在蜱的生長過程中之發(fā)揮某種特定的作用 , 為加強免疫效果 ,很多情況下是采用多種蛋白聯合 免疫達到加強免疫效果的目的 。4d8 基因在 2005 年 首次 在肩 板硬 蜱 的 cdn a 文庫中篩選出來 ,通過 4d8 基因表達蛋白的免疫試

22、驗 ,該蛋白對肩板硬蜱的產卵量有明顯影響 。de lafue nt e j 證實 4d8 基 因在 多種 蜱 體 內 存 在 。通 過 rn a 干擾試驗使 4d8 基因沉默 ,試驗結果表明肩板 硬蜱 、變異革蜱 、邊緣革蜱 、美洲鈍緣蜱和血紅扇頭 蜱飽血雌蜱的重量 , 產卵量和活力 都 有影 響 。4d83 13214 異革蜱 和美 洲 鈍 眼 蜱 的 卵 發(fā) 育 不 良。趙 金 國 15 等 成功獲得小亞璃眼蜱 4d8 基因 ,并進行了原核表達 ,免疫印跡結果表明小亞璃眼蜱 4d8 基因表達 產物可與半飽血小亞璃眼蜱唾液腺抗原免疫兔血清 反應 。本試驗成功獲得微小牛蜱 4d8 基因 ,同源

23、性分析表明 ,獲得的 4d8 基因同國外已報道的微小牛蜱4d8 基因同源性在 97 . 7 %以上 ,表達蛋白的同源性 為 99 . 3 % ,說明 4d8 基因種內具有較高保守性 。通 過 we st er n blo t 對重組蛋白分析表明 , 重組蛋白具有很好的抗原性 ,能夠與兔抗微小牛蜱的唾液腺 、腸道和卵巢的血清反應 ,說明該蛋白同時存在于微小 牛蜱多個位置 ,并可能參加微小牛蜱的叮咬 、消化和生殖過程 。該結果與 de la fue nt e j 研究結果一致 ,為 4d8 在微小牛蜱疫苗的研制奠定了一定的基礎 。參考文獻 :si st a nt to i mmunizatio n

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