生物制藥基本技術(shù)

1、內(nèi)容提要內(nèi)容提要 概述概述 各種提取與純化技術(shù)各種提取與純化技術(shù) 小結(jié)小結(jié) Chapter 6 Basic Technique For Biopharmaco 生物制藥是把生物體內(nèi)的具有生物活性的基生物制藥是把生物體內(nèi)的具有生物活性的基 本物質(zhì)，保持原來的結(jié)構(gòu)和功能，又能在含有多本物質(zhì)，保持原來的結(jié)構(gòu)和功能，又能在含有多 種物質(zhì)的液相或固相中較高純度的分離出來。它種物質(zhì)的液相或固相中較高純度的分離出來。它 是一項嚴(yán)格、細(xì)致、復(fù)雜的工藝過程，涉及物理、是一項嚴(yán)格、細(xì)致、復(fù)雜的工藝過程，涉及物理、 化學(xué)、生物學(xué)、工程等方面的知識和操作技術(shù)?；瘜W(xué)、生物學(xué)、工程等方面的知識和操作技術(shù)。 對于一個新研制

2、的生物藥物，從查閱文獻開對于一個新研制的生物藥物，從查閱文獻開 始，到探索實驗、條件考察（記錄客觀），還要始，到探索實驗、條件考察（記錄客觀），還要 總結(jié)制定工藝規(guī)程、制定分析鑒定方法，再進行總結(jié)制定工藝規(guī)程、制定分析鑒定方法，再進行 中試放大，全面考察工藝是否成熟，是否穩(wěn)定等中試放大，全面考察工藝是否成熟，是否穩(wěn)定等 過程。過程。 問題：問題：1、標(biāo)準(zhǔn)化方法？、標(biāo)準(zhǔn)化方法？ 2、如何發(fā)現(xiàn)或研制新藥？、如何發(fā)現(xiàn)或研制新藥？ 概概 述述 1. 基本制藥技術(shù)和方法基本制藥技術(shù)和方法 種類種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。 1）提取法）提取法(Extraction) 2）發(fā)酵

3、法（）發(fā)酵法（ Zymotechnics） 3）化學(xué)合成（）化學(xué)合成（Chemical synthesize） 4）組織培養(yǎng)法（）組織培養(yǎng)法（Tissue culture） 5）現(xiàn)代生物技術(shù)）現(xiàn)代生物技術(shù)(Modern Biotechnics): Gene engineering, Enzyme engineering, Cell engineering , protein Engineering, 1）原料的選擇和預(yù)處理）原料的選擇和預(yù)處理 2）原料的粉碎）原料的粉碎 3）提取：從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制）提?。簭脑现薪?jīng)溶劑分離有效成分，制 成粗品的工過程。成粗品的工過程。 4）純化：

4、粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸）純化：粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸 附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步 驟進行精制的工藝過程。驟進行精制的工藝過程。 5）濃縮、干燥及保存）濃縮、干燥及保存 6）制劑：原料藥（精制品）經(jīng)精細(xì)加工制成片）制劑：原料藥（精制品）經(jīng)精細(xì)加工制成片 劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應(yīng)用的各種劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應(yīng)用的各種 劑型。劑型。 Raw Material Selecting and Pretreatment 1、原料選擇的基本準(zhǔn)則、原料選擇的基本準(zhǔn)則 1）在大量的信息資料和在大量的信息資料和 實踐經(jīng)驗的基礎(chǔ)上

5、，選擇目標(biāo)原料。實踐經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，選擇目標(biāo)原料。2）選擇有效成選擇有效成 分含量高的新鮮材料；分含量高的新鮮材料；3）來源豐富易得；來源豐富易得；4）制造工制造工 藝簡單易行；藝簡單易行；5）成本比較低；成本比較低；6）原料的采集不破壞原料的采集不破壞 生態(tài)環(huán)境生態(tài)環(huán)境, 選擇對環(huán)境友好的原材料資，防止生物入選擇對環(huán)境友好的原材料資，防止生物入 侵。侵。 2、預(yù)處理方法、預(yù)處理方法 1）動物組織先要剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性動物組織先要剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性 部分；植物種子去殼除脂；微生物要進行菌體與發(fā)部分；植物種子去殼除脂；微生物要進行菌體與發(fā) 酵液分離等基本操作。便于貯存和運輸

6、。酵液分離等基本操作。便于貯存和運輸。 2）冷凍法預(yù)處理：有些材料要冷凍保存或低溫保存，冷凍法預(yù)處理：有些材料要冷凍保存或低溫保存， 以便抑制微生物和酶的作用。以便抑制微生物和酶的作用。 3）有機溶劑除去部分水分：用丙酮或乙醇進行脫水有機溶劑除去部分水分：用丙酮或乙醇進行脫水 和脫脂，有利于貯存。和脫脂，有利于貯存。 Comminution of Raw Material u原料的粉碎原料的粉碎：在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎 成適度的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)活性物質(zhì)充成適度的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)活性物質(zhì)充 分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。分釋放到溶

7、液中，有利于提取或吸附。 微生物：常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、微生物：常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、 超聲、加壓等處理方法。超聲、加壓等處理方法。 動物臟器組織：常用絞肉機機械法粉碎；動物臟器組織：常用絞肉機機械法粉碎； 植物肉質(zhì)組織：常用磨碎法；植物肉質(zhì)組織：常用磨碎法； 1. 1. 機械法：機械法：組織搗碎機、勻漿器、研缽、球磨機、組織搗碎機、勻漿器、研缽、球磨機、 萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機、刨片機。萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機、刨片機。 動物組織多在冰凍狀態(tài)絞碎、溶漿。動物組織多在冰凍狀態(tài)絞碎、溶漿。 u冷熱交替法：冷熱交替法：將材料投入沸水中，在將材料投入沸水中，在90左右維持左右維

8、持 數(shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分 細(xì)胞被破壞。此法多用于細(xì)菌或病毒中提取蛋白和細(xì)胞被破壞。此法多用于細(xì)菌或病毒中提取蛋白和 核酸。核酸。 u反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法：把待破碎的樣品冷至把待破碎的樣品冷至-20-15 ，使，使 之凝固，然后緩慢的溶解，如此反復(fù)操作，大部分之凝固，然后緩慢的溶解，如此反復(fù)操作，大部分 動物性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。動物性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可以破碎。 u超聲波處理法超聲波處理法：多用于微生物材料，處理的效果與多用于微生物材料，處理的效果與 樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶樣品濃度、使用頻率有關(guān)。

9、用大腸桿菌制備各種酶 時，常用時，常用50100mg/L菌體濃度，在菌體濃度，在110KC頻率下頻率下 處理處理1015min。操作時注意避免溶液中氣泡的存。操作時注意避免溶液中氣泡的存 在。在。 u加壓破碎法：加壓破碎法：加氣壓或水壓，達加氣壓或水壓，達0.5934.32 MPa (210350kgf/cm2)的壓力時，的壓力時， 可使可使90%以上細(xì)胞被以上細(xì)胞被 壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。 A.A.自溶法自溶法 將新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng) 溫度下,利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞,使細(xì) 胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度,動物材

10、料在 0-4,微生物在室溫下。自溶時,需加少量的防腐劑, 甲苯、氯仿,以防止外界細(xì)菌的污染。由于自溶時間 較長,不易控制,故制造具有活性的核酸和蛋白質(zhì)時比 較少用。 C.C.表面活性劑處理法表面活性劑處理法 表面活性劑的分子中,兼有親 脂性和親水性基團,能降低水的界面張力,具有乳化、 分散、增溶作用。 B.B.溶菌酶處理法溶菌酶處理法 溶菌酶是專一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的 酶。多用于微生物,對蝸牛酶、纖維酶及植物細(xì)胞也 適用。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造DNA時,采用 pH8.0的0.1mol/L Tris-0.01mol/LEDTA制成2億/ml的 細(xì)胞懸液,然后加入100g1mg的溶菌酶,在3

11、7C保 溫10min,細(xì)菌胞壁即被破壞。 u常用有:SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉。 1 1、提取條件的選擇提取條件的選擇 1）溶劑:常用水/稀鹽/稀酸/稀堿,有機溶劑如乙醇/ 丙酮/氯仿/四氯化碳/丁醇等。丁醇提取的pH、溫度 范圍較廣(pH3-6, 20-40)。適用于動植物和微生物 原料。 2）pH:與溶解度和穩(wěn)定性有很大關(guān)系,一般選擇在pI 的兩側(cè) 3）溫度:一般在5 以下,但對溫度耐受力較大的藥 物,可適當(dāng)?shù)奶岣邷囟?使雜蛋白變性分離,有利于提 取和純化。如胃蛋白酶/酵母醇脫氫酶及多肽激素類, 選擇37-50 提取,效果較好。 u提取：提?。阂卜Q抽提、萃取,就是利用一種溶劑對物

12、質(zhì)的 不同溶解度,從化合物中分離出一種或幾種組分的過 程。分為固體處理（液固萃?。┖鸵后w處理 （液液萃取）。 2 2、影響提取的因素影響提取的因素 1）被提取物質(zhì)溶解度的大小,一 般極性對極性；非極性對非極性；酸對堿；堿對酸； 高溫；遠(yuǎn)離等電點。 2）擴散作用的影響,擴散方程式G=DF*C/X*t 3）分配作用的影響,分配定律(C1/C2)恒溫、恒壓=K 利用不同的蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中,溶 解度不同程度的降低來進行分離純化。在低鹽濃度下, 溶解度隨著鹽濃度升高而增加,稱鹽溶作用；當(dāng)鹽濃 度不斷升高時,不同蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下 降并先后析出沉淀,稱鹽析作用。 u優(yōu)點：設(shè)備和條件要求低,

13、安全應(yīng)用范圍廣泛。在 高鹽情況下蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化,一般在室溫下操作。 缺點：分級分離能力不高。 硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等等 u 鹽析時應(yīng)注意的幾個問題： 1）鹽飽和度：由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同,鹽析要 求的飽和度也不同。要按工藝要求,正確計算飽和度。 2）pH 值的選擇:蛋白質(zhì)在pI時的溶解度最小。因此, 進行鹽析時的pH,要選擇在被分離蛋白質(zhì)的pI 附近。 3）蛋白質(zhì)濃度：在相同條件下,蛋白質(zhì)濃度越大越易 沉淀,使用鹽的飽和度極限也愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高, 其他蛋白質(zhì)共沉作用也愈強,這是不希望的。選擇適 當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度,可避免共沉的干擾。 4）溫度：一

14、般在室溫下進行,濃鹽對蛋白質(zhì)有保護作 用。但對溫度敏感的,要在低溫下進行。常在0-4 范圍內(nèi)迅速操作。如尿激酶。 5）鹽析沉淀物的脫鹽：鹽析的沉淀分離后,經(jīng)脫鹽才 能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析,時間一般較 長,應(yīng)常換透析液,注意防止污辱。 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有 機溶劑中的溶解度差異而分離目的蛋白質(zhì)的方法。 蛋白質(zhì)的沉淀與溶解,與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)。降低 溶液的介電常數(shù),使其溶解度變小.同時,還破壞蛋白 質(zhì)的水化膜而使蛋白質(zhì)沉淀析出。 幾種溶劑的介電常數(shù)幾種溶劑的介電常數(shù) 溶劑名稱溶劑名稱 20 時的介時的介 電常數(shù)電常數(shù) 溶劑名稱溶劑名稱20 時的時的 介電常數(shù)介電常數(shù) 乙醚乙醚

15、4.33甲醇甲醇33 丙酮丙酮21.4水水80 乙醇乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液甘氨酸水溶液 137 介電常數(shù)與靜電力的關(guān)系：介電常數(shù)與靜電力的關(guān)系： F=Q1Q2/Kr2。式中：。式中： K介電介電 常數(shù)。指帶相反電荷的微粒之間的靜電引力。常數(shù)。指帶相反電荷的微粒之間的靜電引力。F相距為相距為r的的2 個帶電量分別為個帶電量分別為Q1、Q2點電荷相互作用的靜電引力。點電荷相互作用的靜電引力。 經(jīng)驗：如30-40%乙醇沉淀的物質(zhì),改用丙酮時,其體 積分?jǐn)?shù)可減少10%左右。即可用2030%的丙酮;而 70-80%乙醇沉淀的物質(zhì),可用5060%的丙酮即可。 注:水有較高的介電常數(shù),具有很好

16、的溶劑性能,是一 種廣譜溶劑。有機溶劑法比鹽析法分辨力強,沉淀也 好過濾,易干燥,但對有些生物活性物質(zhì)能引起失活 和變性。應(yīng)用時還要注意揮發(fā)和火災(zāi)等。 有機沉淀法應(yīng)注意的問題有機沉淀法應(yīng)注意的問題 （1）控制工藝過程的溫度:整個操作過程應(yīng)在低溫下 進行,而且最好是同一溫度。 （2）防止溶劑局部濃度過高:加入有機溶劑時攪拌要 均勻,速度要適當(dāng),避免局部濃度過高,引起沉淀物的 破壞、變性或失活。 （3）及時處理沉淀物:沉淀物經(jīng)過濾或離心后,要立 即用水或緩沖液溶解,降低有機溶劑的濃度。 （4）pH的選擇：在待沉淀蛋白質(zhì)的pI附近。 （5）有機溶劑是酶和蛋白質(zhì)的變性因素,尤其是對敏 感酶類。 利用蛋

17、白質(zhì)在等電點時的溶解度 最低,而各種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點的特性進 行分離的工藝過程。由于各種蛋白質(zhì)在等電點時, 仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多數(shù)蛋白質(zhì)的等 電點又都十分接近,所以單獨使用效果不理想,分辨 力差,多用于提取后除雜蛋白。實際生產(chǎn)中常與有 機溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。 膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電 滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾。 根據(jù)溶質(zhì)分子和懸浮粒子是否通過多孔 膜來進行篩分。在液壓的驅(qū)動下,能通過超濾膜的 分離粒子的范圍,一般在0.0010.01m。 n超濾即利用一種特制的膜對溶液中的各種溶質(zhì)分子 進行選擇性過濾。 優(yōu)點：成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保

18、 持藥物活性、回收率高。適用于酶和蛋白質(zhì)藥物的分 離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原。 以高分子透過性薄膜為分離介質(zhì),在超 過溶液滲透壓力的情況下,使溶液中的溶劑透過薄膜, 同時使溶質(zhì)和不溶物阻截在膜前。這一過程類似于滲 透,但方向相反,即溶劑從高濃度一側(cè)傳遞到濃度低的 一側(cè)，故稱反滲透。 特點：能耗少，體積小，適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。 由高分子材料制成的薄膜過濾介質(zhì)， 可以過濾一般介質(zhì)不能截留的細(xì)菌和微粒。膜的孔徑 在0.2-10 m。 n 以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級性能在超 濾膜與微孔濾膜之間。為0.010.2 m。用于水的 精制、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體粒子以及糖液、 酶液的精制

19、。 5 5、離子交換層析、離子交換層析 采用不溶性高分子化合物作為離子 交換劑,分離純化各種生化物質(zhì)。 離子交換樹脂在水中能溶脹,溶脹后,其 分子中的極性基團（活性基團）,具有可擴散的離 子,能與溶液中的離子起交換作用;非極性基團作為 樹脂的骨架,使樹脂不溶于水并具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),為離 子交換的進行及溶液和樹脂的分離創(chuàng)造了條件。離 子交換層析包括吸附、吸收、穿透、擴散、離子交 換、離子親和力等物理化學(xué)過程。 (1)強酸性陽離子交換樹脂：功能團為磺酸基，pH一 般沒有限制。 (2)弱酸性陽離子交換樹脂：功能團為羧基、酚基。 在酸性溶液中不發(fā)生交換，pH愈大交換能力愈強。 (3)強堿性陰離子交換樹脂：

20、功能團為三甲基季胺基 團。pH沒有限制。 (4)弱酸性陰離子交換樹脂：功能團為伯胺基、仲胺 基、叔胺基。pH愈低交換能力愈大。 （1）樹脂顆粒的大小：顆粒小，表面積大，能促進內(nèi) 部和外部擴散。 （2）攪拌和流速：加快攪拌速度或加大液體流速，都 能減少樹脂外液膜的厚度，從而使液相擴散速度增加。 （3）離子濃度：交換速度隨離子濃度的上升而增加， 達到一定濃度后交換速度不在升高。 （4）離子的水化半徑:水化半徑小的易被吸附。 （5）樹脂酸堿性的強弱和溶液的pH。 （6）交聯(lián)度大小:交聯(lián)度愈小,樹脂愈易膨脹,交換速 度愈快。但交聯(lián)度小的樹脂選擇性較差。 （7）有機溶劑的影響:當(dāng)有有機溶劑存在時,會降低

21、 樹脂對有機離子的選擇性,而容易吸附無機離子。 6 6、凝膠層析、凝膠層析 指化合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠的固定 相的層析柱時，因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分離 的技術(shù)。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、 阻滯擴散層析、排阻層析。 1)優(yōu)缺點 缺點:分離速度慢。優(yōu)點:設(shè)備簡單,操作方 便,分離效果好,回收率高,分離條件緩和,不使活性物 質(zhì)失活變性,凝膠可重復(fù)使用,無需再生處理。廣泛用 于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等藥物。 2)幾種常用的凝膠 ：基本骨架是16糖苷鍵。由葡聚糖 和甘油以醚橋形式交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最著名的商 品為Sephadex葡聚糖凝膠,珠狀顆粒物,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,

22、不溶于水/弱酸/堿和鹽溶液。低溫時,在0.1mol/L 鹽 酸中保持1-2h不改變性質(zhì);室溫時,在0.01mol/L 鹽酸 中放置半年也不改變;在0.25mol/L的氫氧化鈉中, 60兩個月沒有發(fā)改變?？稍?20加熱30min滅菌而 不破壞,但高于120即變黃。濕狀貯存易發(fā)霉,若長期 不用,需加防腐劑。 （由碳碳骨架構(gòu)成。完全為惰 性。穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好,洗脫時不會有凝膠物質(zhì)下 來。缺點：不耐酸。遇酸時酰胺鍵會水解為羧基,使凝 膠帶有一定的離子交換基團。 :天然凝膠,不是共價交聯(lián),是以氫鍵 交聯(lián)?？障抖纫云跫?zhí)堑臐舛葋砀淖?化學(xué)穩(wěn)定性不如 葡聚糖凝膠。 沒有干凝膠，必須在溶脹狀態(tài)保存,遇脫水

23、劑、冷凍 和一些有機溶劑即破壞,丙酮和乙醇對它無影響。在 pH4.5-9,溫度0-40穩(wěn)定。對硼酸有吸附,不能用硼 酸緩沖液。他能分離及萬到幾千萬相對分子質(zhì)量的 物質(zhì),彌補了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠的不足。瑞典 商品名Sepharose,美國稱生物凝膠A（Bio-Gel- A）,英國稱Sagavac。 常用的為聚甲基丙烯酸酯（ Polymethacrylate）凝膠、聚苯乙烯凝膠（如 Styrogel,Bio-Beads-S） 生物活性物質(zhì)都有親和作用,如酶與底 物、激素與受體、核酸的互補鏈間,多糖與蛋白質(zhì)復(fù) 合體。 n親和層析是利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計的 層析技術(shù)?？赡娼Y(jié)合的特異性物質(zhì)

24、稱為配基,與配基 結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體。 n親和層析能從粗提液中,通過一次簡便處理,便可得 到高純度的活性物質(zhì),既可分離一些生物材料中含量 極微的物質(zhì),又能分離一些性質(zhì)十分相似的物質(zhì)。 1)1)優(yōu)缺點優(yōu)缺點 優(yōu)點:設(shè)備要求不高,操作簡便,適用范圍廣, 特異性強,分離速度快,效果好,條件溫和。缺點：通 用性較差,洗脫條件要求苛刻。 自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料, 取材十分方便。但由于其結(jié)構(gòu)緊密、均一性差,不利 于大分子的滲入?；罨蟪в须姾?非特異性吸附 較強,加上空間位阻等原因,其應(yīng)用不如凝膠載體廣 泛。目前主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。如用寡 聚脫氧胸腺核苷酸纖維素作固定相分離細(xì)胞提

25、取液 中的mRNA. 市售商品有:無定型微纖維/微晶纖維素/ 珠狀纖維素。 用于親和層析的主要為交聯(lián)珠狀凝 膠。瓊脂糖的質(zhì)量濃度為20g/L(2%)、40g/L(4%)、 60g/L(6%)幾種，相應(yīng)的商品稱為Sepharose 2B、 4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。這 類載體能使吸附物質(zhì)保持活性,能迅速活化并接上 各種功能基團,結(jié)構(gòu)疏松孔徑大,流速快。 與瓊脂糖凝膠相比孔徑太小,特別是 經(jīng)配基偶聯(lián)后,凝膠膨脹度會進一步邊小,所以應(yīng)用 受到限制。 ：碳碳骨架,有丙烯酰胺和甲叉 雙丙烯酰胺聚合而成,具有網(wǎng)狀三維空間結(jié)構(gòu)。商 品名為Biogel P。

26、避免接觸強氧化劑,配基偶聯(lián)后 會使它的網(wǎng)格縮小,在一定程度上限制了它的應(yīng)用。 化學(xué)和物理穩(wěn)定性好,機械強度高,不 但能抵御酶及微生物的作用,還能耐受高溫滅菌和 較劇烈的反應(yīng)條件。 缺點:親水性不強,對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非 特異性吸附,而且可供連接的化學(xué)活性基團也少。 改良方法:為了克服其缺點,市售Bio-Glass的商品 都已事先連接了氨烷基（烷基胺）。A)用葡聚糖包 被玻璃珠,則可改善其親水性,并增加化學(xué)活性基團。 B)用抗原涂布的玻璃珠已成功地分離了免疫淋巴細(xì) 胞，在DNA連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的DNA和 RNA聚合酶。 由聚丙烯酰胺和瓊脂糖混合組成的載 體,商品名為Ultro

27、gels ACA。它的特點是載體上既 有羥基又有酰胺基,并且都能與配基單獨作用。但不 能接觸強堿,以免酰胺水解,使用溫度不超過40C。 在丙烯酰胺和瓊脂糖的混合膠中加入7%的四氧化三 鐵,則可制得一種稱為磁性膠（Magnogels ACA44） 的載體。 當(dāng)懸浮液中含有不均勻粒子時,依靠磁性能將載體 與其他粒子分離。磁性膠載體常用于酶的免疫測定、 熒光免疫測定、放射免疫測定、免疫吸收劑和細(xì)胞 分離等的微量測定和制備。 （1）配基濃度； （2）空間障礙； （3）配基與載體的結(jié)合位點； （4）載體的孔徑； （5）微環(huán)境（化學(xué)因素）。 濃縮：濃縮：低濃度溶液通過除去溶劑變?yōu)楦邼舛热芤旱?過程。常在提

28、取后和結(jié)晶前進行,有時也貫穿與整個 制藥過程。 蒸發(fā)裝置的設(shè)計原理蒸發(fā)裝置的設(shè)計原理: :加熱/擴大液體表面積/低壓。 薄膜蒸發(fā)濃縮Film evaporation concentration,臥 式噴淋降膜蒸發(fā)器/Rose蒸發(fā)器/板式蒸發(fā)器;減壓蒸 發(fā)濃縮Decompression evaporation concentration 減壓抽真空(真空濃縮),適用不耐熱的藥物和制品。 吸收濃縮(Absorbing concentration) 通過吸收劑直 接吸收除去溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。吸 收劑與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對生化藥物不起吸附作用, 易與溶液分開。吸附劑除去溶劑后可重復(fù)使用

29、。 常用的吸收劑：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、 凝膠。 凝膠可直接投入待濃縮的溶液中,溶劑和小分子被吸 收到凝膠內(nèi),大分子留在溶液中,然后離心過濾。使用 聚乙二醇時,先將溶液裝入半透膜的袋內(nèi),扎緊袋口, 外加聚乙二醇覆蓋,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇吸去。 結(jié)晶：結(jié)晶：利用某些藥物具有形成晶體的性質(zhì)是目標(biāo)藥 物（溶質(zhì)）呈晶態(tài)從溶液中析出的過程。 結(jié)晶的條件：結(jié)晶的條件： （1）純度purity：各種物質(zhì)在溶液中均需達到一定的 純度才能析出結(jié)晶。 蛋白質(zhì)和酶，純度不低于50%?？傏厔菔窃郊冊揭捉Y(jié) 晶，但已結(jié)晶的制品不表示達到了絕對的純化，只 能說到了相當(dāng)純的程度。有時純度不高，但加入有 機溶劑和

30、制成鹽，也能達到結(jié)晶。 （2）濃度consideration 結(jié)晶液的濃度要較高,以利 于分子間的碰撞聚合。但濃度過高,相應(yīng)雜質(zhì)和溶液 黏度增大,反而不利于結(jié)晶,或生成純度較差的粉末 結(jié)晶。 （3）pH 選擇pH在pI附近,有利于晶體析出。 （4）溫度temperature 通常在低溫條件進行,活性 物質(zhì)不易變性,又可避免細(xì)菌繁殖。 （5）時間Time 結(jié)晶的生成和生長需要時間。但生 物藥物要求在幾小時內(nèi)完成,時間不宜過長。 （6）晶種Crystal seed 不易結(jié)晶的藥物常加晶種。 干燥：干燥：是從濕的固體生物藥物中,除去水分或溶劑 而獲得相對或絕對干燥制品的工藝過程。它也是一 種蒸發(fā),但

31、不同于濃縮。通常包括原料藥的干燥和 制成的臨床制劑的干燥。 （1 1）常壓干燥）常壓干燥Normal press desiccationNormal press desiccation：通風(fēng)與 加熱結(jié)合。成本低干燥量大。但時間長，易污染。 （2 2）減壓干燥）減壓干燥Decompression desiccationDecompression desiccation：利用專 用設(shè)備減壓加速，使溶劑迅速蒸發(fā)。 （4 4）冷凍干燥）冷凍干燥 Freezing desiccationFreezing desiccation：在低溫(-60 -10)及高真空6.67-40Pa(0.05-0.3mmHg

32、)下,將物 料與溶液中的水分直接升華的干燥方法。適用于高 度熱敏的生物藥物。制劑應(yīng)具有多孔性、疏松、易 溶的特點,一般含水量在1%-3%。設(shè)備投資及維護費 用高,生產(chǎn)能力不大。 優(yōu)點:快速高效,可在無菌條件下操作.應(yīng)用廣泛。 缺點:熱利用率不高,設(shè)備費用投資大。 減壓干燥時間短，溫度低。制藥常用方法。 （3 3）噴霧干燥）噴霧干燥Spray desiccationSpray desiccation: :將液體通過噴射 裝置噴成霧滴后，在一定流速的熱氣流中,迅速蒸 發(fā)干燥的方法。從理論推算:每升液體,如果噴成 10m直徑的霧滴,約有1.91*1012多個,表面積有 600m2。實驗表明:把含水量

33、為80%的1L溶液,噴成直 徑約10-60 m霧滴,當(dāng)與熱空氣接觸時,僅3-5s可 使霧滴水分氣化而得到干燥產(chǎn)品。 改進的干燥設(shè)備;環(huán)型噴射干燥器;振動流動干燥器 ;渦流干燥器。 n 滅菌：指殺滅或除去一切微生物的操作技術(shù)。 1）干熱空氣滅菌：通常在烘箱里利用熱空氣殺滅微 生物,在100,1h可殺死繁殖的細(xì)菌。某些細(xì)菌在 一定情況下可以變成芽孢,有較強的耐熱力,一般需 160-170滅菌1h以上或140滅菌3h以上。 滅菌的時間應(yīng)自全部進行滅菌的物品達到滅菌溫度 時算起。待滅菌物品的溫度常落后于烘箱室的溫度， 特別是導(dǎo)熱性能差或裝量大的待滅菌物品。要確保 滅菌完全,應(yīng)測定溫度延后時間,將延后的

34、時間考慮 到規(guī)定的滅菌時間內(nèi)。 濕熱滅菌濕熱滅菌：常壓滅菌,即在常壓下用100 流通蒸 汽或在水內(nèi)煮沸來殺滅細(xì)菌。 減壓滅菌：在熱壓滅菌器中，用超過101.325kPa的 飽和蒸汽殺滅細(xì)菌。 n 熱壓滅菌所需溫度、相對壓力和時間： 115.5 1.7 kgf/cm2 (表壓0.7 kgf/cm2 ）30min 121.5 2.0 kgf/cm2 (表壓1.0 kgf/cm2 ）20min 126.5 2.4 kgf/cm2 (表壓1.4 kgf/cm2 ）15min 紫外線滅紫外線滅菌 主要用于空氣和物體的表面滅菌。 一般紫外燈高度距操作臺面不超過1.5m，被滅菌物 距燈與臺面的垂直點中心不超

35、過1.5 m。用于室內(nèi) 空氣滅菌時，約6-15m3的空間裝一盞紫外燈。人體 若照射紫外線過久會產(chǎn)生眼結(jié)膜炎、紅斑和皮膚變 紅等。故一般均在操作前照射1-2h。若操作時必須 照射時，對操作人員的眼睛和皮膚要加以防護。 過濾滅菌過濾滅菌 通過適宜的濾器除去藥液中所含的細(xì)菌. 常用有硅藻土濾柱、素瓷濾柱、垂熔玻璃濾器、石 棉板呂器和微孔濾膜（纖維素酯膜、聚碳酸酯膜）。 濾器孔徑約為0.2m時,滅菌結(jié)果才可靠。適用于 不耐熱的藥物溶液的滅菌、除去活菌和死菌。滅菌 后的藥液進行分裝時,要特別注意防止染菌,應(yīng)進行 無菌操作。 化學(xué)滅菌化學(xué)滅菌 用化學(xué)藥品抑制或殺滅細(xì)菌的方法。常 用其氣體或蒸汽殺滅細(xì)菌的藥

36、品有甲醛、丙二醇、 乳酸等,適用于無菌室的空氣滅菌。 生物制藥是利用一定的生物制備技術(shù)從生物材料中 獲取特殊的生物活性物質(zhì)的過程。需注意幾個問題： 1.生物材料的組成成分復(fù)雜,各種化合物的形狀/大小 /相對分子質(zhì)量和理化性質(zhì)都各不相同,有些還屬于 未知.且這些化合物在分離時仍在不斷的代謝之中。 2.有些化合物含量很低或極微。制備時,原材料用量 很大，得到產(chǎn)品很少。 3.生物活性物質(zhì),一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境,很易變 性。 4.分離制備的過程幾乎在溶液中進行,各種溫度、PH、 離子強度等參數(shù),對溶液中各種組成的綜合影響,常 常無法固定,有些實驗或工藝設(shè)計的合理性不強,常 帶有很大的經(jīng)驗成分。因此,

37、要建立重復(fù)性好的成 熟工藝,對生物材料、各種試劑及其輔料都要加以 嚴(yán)格規(guī)定。 5.生物藥物“均一性”證明與化學(xué)藥物的“純度” 是不同的。結(jié)構(gòu)與功能（活性）的關(guān)系？ 無標(biāo)記的蛋白質(zhì)無標(biāo)記的蛋白質(zhì)- -純化程序純化程序 組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)純化程序純化程序 第七章第七章 生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨 勢與希望勢與希望 生物制藥產(chǎn)業(yè)作為21世紀(jì)最具希望和發(fā)展?jié)?力的新興高技術(shù)產(chǎn)業(yè)，不僅對國民經(jīng)濟的發(fā) 展產(chǎn)生巨大的拉動作用，并且為人類的疾病 防治帶來更多、更安全、更有效、甚至難以 替代的手段。 “珍惜生命和關(guān)注健康”是人類永恒的主題， 因此生物制藥產(chǎn)業(yè)將永遠(yuǎn)是“朝陽產(chǎn)業(yè)”。 一

38、一. .哺乳動物細(xì)胞表達的生物技術(shù)藥物所占比重越哺乳動物細(xì)胞表達的生物技術(shù)藥物所占比重越 來越大來越大 生物制藥的發(fā)展初期都是表達一些分子量較小、結(jié) 構(gòu)簡單的蛋白質(zhì),如胰島素、干擾素或集落刺激因子, 氨基酸殘基都在200aa以下,一般只有12對二硫鍵 甚至沒有二硫鍵,因此用大腸桿菌表達既經(jīng)濟有簡便。 生物制藥的發(fā)展趨勢是從細(xì)胞因子等激動劑為主的 產(chǎn)品,轉(zhuǎn)變?yōu)橐赞卓棺饔脼橹鞯男律锛夹g(shù)藥物,如 天然IL-1拮抗劑、中和作用的單抗如Remicade、 TNF-拮抗劑受體-Fc融合蛋白Enbrel,-1-蛋白水 解酶抑制劑、抑制HIV-1與CD4+細(xì)胞融合的Pro-542 等。 越來越多的分子量大、

39、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的功能性蛋白得到 開發(fā),如抗體和酶,都是分子量在50200kDa的糖蛋 白。 由于這些蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,二硫鍵多,并且翻譯后的修 飾如糖基化對蛋白活性的影響很大,采用原核表達系 統(tǒng)往往不能滿足蛋白表達的需要。采用哺乳動物細(xì) 胞表達既能保證重組蛋白質(zhì)二硫鍵的正確配對和蛋 白質(zhì)折疊、又能保證蛋白質(zhì)的糖基化,即用哺乳動物 細(xì)胞表達的重組蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上都 高度一致。 從2000年以后FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥物來看,哺乳動 物細(xì)胞表達系統(tǒng)更受到FDA和各大制藥公司的重視。 我國生物制藥與歐美國家的主要差距就是哺乳動物 細(xì)胞表達的產(chǎn)品極少。 從銷售情況看，哺乳動物細(xì)胞表達的產(chǎn)品也已占據(jù) 主

40、要地位，年銷售額超過20億美元的6個生物技術(shù)藥 物均是哺乳動物細(xì)胞表達的產(chǎn)品，而銷售額位于前 10位的生物技術(shù)藥物，有8個產(chǎn)品為哺乳動物細(xì)胞表 達的產(chǎn)品。 隨著近年來越來越多的哺乳動物細(xì)胞表達的生物技 術(shù)藥物獲準(zhǔn)上市，到2007年預(yù)計動物細(xì)胞表達的產(chǎn) 品市場份額將占70%75%。在中國的生物制藥產(chǎn)業(yè) 中，已批準(zhǔn)上市的動物細(xì)胞表達產(chǎn)品只有促紅細(xì)胞 生成素 (EPO)和乙肝疫苗，盡管這兩種產(chǎn)品的使用 劑量都在g級水平，但是這兩種產(chǎn)品的生產(chǎn)能力都 很小，動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為生物技術(shù)藥 物生產(chǎn)最關(guān)鍵和最具挑戰(zhàn)性的技術(shù)。 由于抗體分子與靶標(biāo)抗原具有高度特異的親和力，抗 體類藥物在治療過程中表現(xiàn)出

41、專一性強、毒副作用小 等特點，成為各大制藥公司研究開發(fā)的熱點領(lǐng)域。鼠 源單抗在臨床試驗中療效很不理想，存在以下缺點：缺點： （1）半壽期很短，只有3040小時，遠(yuǎn)小于完整人源 抗體的半壽期(1021天)，在人體中易被清除。 （2）人體免疫細(xì)胞Fc()受體結(jié)合鼠 IgG的Fc段的能力很差,不能有效引發(fā)抗體依賴性介導(dǎo) 的細(xì)胞毒(ADCC)效應(yīng)和補體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC), 即不能發(fā)揮抗體的生物學(xué)功能。 （3）反復(fù)使用鼠源單抗會產(chǎn)生人抗鼠抗體 (HAMA),HAMA反應(yīng)可以有效快速地破壞這種鼠源單抗, 并且HAMA反應(yīng)可能會引發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。 鼠源抗體人源化技術(shù)的出現(xiàn),大大促進了治療性抗體 藥

42、物的開發(fā),人源化技術(shù)包括嵌合抗體(chimeric antibody,60%70%人源化)制備技術(shù)和人源化抗體 (90%95%人源化)制備技術(shù),用這些技術(shù)制備的抗體 克服了鼠源抗體的缺點,使得治療性抗體成為目前最 大的一類生物技術(shù)藥物。 世紀(jì)90年代中期,FDA批準(zhǔn)了多種抗體類藥物,如嵌合 抗體Remicade、Rituxan、ReoPro,人源化抗體如 Herceptin、Synagis等。 應(yīng)用噬菌體顯示人抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠Xeno- Mouse技術(shù)可以制備人源抗體,這些技術(shù)又為治療性抗 體藥物的研發(fā)提供了新技術(shù)方法。 2002年FDA批準(zhǔn)的用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的單抗 HU

43、MIRA,就是使用噬菌體顯示技術(shù)構(gòu)建的人源抗體,標(biāo) 志著治療性抗體的研究與開發(fā)又上了一個新臺階。 2004年,FDA已批準(zhǔn)了17種治療性抗體,2種受體-Fc融 合蛋白(抗體樣分子),這些藥物在治療腫瘤、類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎和Crohns病(克羅恩氏病,節(jié)段性回腸炎)、抗 器官移植排斥,防治病毒感染,抗血小板凝聚等方面表 現(xiàn)出非常理想的療效。目前抗體類藥物的銷售額已占 整個生物技術(shù)藥物市場的1/5,而到2008年,抗體類藥 物的年銷售額將達到200億美元,占生物技術(shù)藥物市場 的1/3。盡管抗體類藥物的發(fā)展如火如荼,但我國抗體 藥物的研發(fā)卻舉步為艱,其根本原因是我國上游構(gòu)建 和下游生產(chǎn),尤其是動物細(xì)胞大

44、規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的落后。 三、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)三、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)的生產(chǎn) 許多遺傳性疾病如血友病、溶酶體貯積病、肺囊性 纖維化等都是難于治愈危及生命的疾病,其病因都是 基因突變等導(dǎo)致體內(nèi)缺乏某種生理活動（代謝過程） 所需要的酶。 酶都是分子量大、結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的蛋白質(zhì),在基因工 程時代到來之前,有的只能通過從人體血液或組織中 提取才能獲得,不僅來源有限,而且易傳播傳染性疾 病,如治療血友病的凝血因子。還有一些非遺傳性疾 病,由于某些蛋白的分泌不足導(dǎo)致疾病,如不孕癥。 或者提高某些蛋白（酶）的濃度可以緩解或治愈某 些疾病,如治療心梗的TNK-tPA、治療膿毒癥的蛋白C 或治療

45、高尿酸癥的Rasburicase尿酸酶。隨著真核表 達系統(tǒng)的日臻成熟,以及大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的 進步,FDA近年來批準(zhǔn)了多種高分子量的復(fù)雜蛋白藥 物。 能挽救生命并且沒有其它替代藥物的生物技術(shù)藥物 有著極好的市場表現(xiàn)。例如,全球戈謝病病人只有 50006000,而用Cerezyme治療的病例達到3800,每1 例病人1年的藥費需要170000美元,1998年銷售額達 到4.7億美元,2001年為5.7億美元,位列當(dāng)年生物技 術(shù)銷售額的第10位,2007年可達9.48億美元。又如 2003年4月批準(zhǔn)上市的治療法布萊氏病的Fabrazyme, 當(dāng)年的銷售額便達到0.57億美元,到2007年的銷

46、售額 可達3.97億美元。而凝血因子 NovoSeven和促濾 泡素Gonal-F的年銷售額都超過4億美元。表3所列產(chǎn) 品絕大多數(shù)是哺乳動物細(xì)胞表達的產(chǎn)品,除了TNK- tPA正在申請臨床外,表中所列產(chǎn)品我國目前還不具 備開發(fā)能力,更遑論生產(chǎn)能力。 四、四、 PEG化以改善產(chǎn)品性能化以改善產(chǎn)品性能 對原產(chǎn)品的化學(xué)修飾，尤其是對原產(chǎn)品的化學(xué)修飾，尤其是PEG化以改善產(chǎn)品的化以改善產(chǎn)品的 性能，是近年來生物技術(shù)藥物發(fā)展的新趨勢。性能，是近年來生物技術(shù)藥物發(fā)展的新趨勢。 最近幾年FDA幾乎沒有批準(zhǔn)一個新的細(xì)胞因子類藥物, 但是卻批準(zhǔn)了幾個PEG化的細(xì)胞因子產(chǎn)品(見表4) uPEG化指將聚乙二醇(PE

47、G)分子通過化學(xué)交聯(lián)共價結(jié) 合到多肽或蛋白質(zhì)藥物上,有以下優(yōu)點:1）極大延長 了藥物半壽期;2）降低了某些藥物的免疫原性;3） 增強藥物活性;4）降低藥物毒性;5）血漿的藥物濃 度波動小,可提高療效;6）可減少給藥次數(shù);7）可改 變藥物作用機制。 l90年代批準(zhǔn)的PEG-L-天冬酰胺酶和PEG化酰苷脫氨酶 都不是基因重組蛋白,而基因重組的干擾素和G-CSF, 其PEG化的產(chǎn)品由于其更好的療效,在市場中都比原 產(chǎn)品表現(xiàn)更好。 由于PEG化干擾素的血漿濃度波動小,其抗病毒能力 遠(yuǎn)好于未PEG化干擾素,如治療丙肝的療效從24% 28%提高至50%68%,因此兩種PEG化的干擾素- PEGASYS和V

48、IRAFERON PEG的銷售情況遠(yuǎn)好于原代 產(chǎn)品,并有逐漸替代原產(chǎn)品的趨勢。 利用基因工程技術(shù),對已有蛋白質(zhì)藥物進行改造,以 獲得性能更好的產(chǎn)品,也是今些年生物技術(shù)藥物發(fā) 展的趨勢,這明顯表現(xiàn)在胰島素、EPO和t-PA突變體 藥物研究與開發(fā)方面。 Amgen公司利用定點突變技術(shù)開發(fā)的第二代EPO產(chǎn)品 Aranesp,與第一代EPO相比,N-糖鏈從3條增加至5條, 分子量從30kDa增加到37kDa，其半壽期延長了3倍, 因而給藥方式從23次/周改為1次/周,雖然2001年 9月才獲準(zhǔn)上市,但該藥品的年銷售額已達到20億美 元,排位第五。 一般速效、中效、長效和雙重胰島素都是通過劑型 的改變以

49、改變胰島素的吸收,其生物活性成分都是 重組人胰島素。 如2002年10月歐洲共同體授權(quán)Novo Nordisk公司7個 抗糖尿病藥物重組胰島素（rDNA）的更新?lián)Q代產(chǎn)品: 長效Insulatard、雙重作用Mintard、長效作用 Montard、長效作用Protaphane、非常長效 Ultratard、快速作用Velosulin、速效作用 Actrapid等。 通過定點突變技術(shù)構(gòu)建胰島素突變體如速效胰島素 Humalog,Novolog和長效胰島素Lantus則是改變胰島 素分子結(jié)構(gòu)以改變藥物吸收速度或藥代動力學(xué)，從 而起到速效或長效的作用。 Humalog就是將胰島素B鏈的Pro28Ly

50、s29突變?yōu)?Lys28Pro29,而Novolog則是將B鏈的Pro28突變?yōu)?Asp28。 胰島素突變體Humalog、Novolog在皮下注射后具有 吸收快、起效快、作用時間短和餐后尖峰狀的生理 學(xué)分泌相似的特點,用藥更靈活方便。 Lantus是將胰島素A鏈的Asn21突變?yōu)镚ly21,在B鏈 末端增加了Arg31 Arg32兩個氨基酸,使其成為第一 個真正長效藥物,恒定的藥代動力學(xué)（PK）和藥效 動力學(xué)（PD）時間至少持續(xù)24h,和相對恒定基線胰 島素生理水平相似。 近25年來,一系列新技術(shù)的出現(xiàn)改變了藥品開發(fā)的 狀況,帶來了前景和希望。這些技術(shù)包括基因工程、 合理藥物設(shè)計、組合化學(xué)、

51、有效篩分以及現(xiàn)在出現(xiàn) 的基因組技術(shù)。 專家們認(rèn)為,藥品研制的失敗率仍然居高不下,由此 造成的損失占了研制成本的很大部分。研制過程早 期的候選藥物約每5000種才有1種進入市場,進入臨 床試驗的藥物每5種才有1種能進入市場。其余的藥 物則被淘汰掉,因為有的不產(chǎn)生療效,有的則有毒性。 n制藥公司通常在開始時要確定出研制目標(biāo),目標(biāo)常常 是人體中的一種被認(rèn)為對某種疾病起作用的蛋白質(zhì)。 然后設(shè)計出或找到一種能夠依附于目標(biāo)蛋白質(zhì)的化合 物,由此來改變疾病發(fā)展過程。弄清這種化合物在其 它方面是否合適,比如說是否可以做成藥丸。然后在 動物身上做毒性試驗,在此之后方可在人身上做試驗。 1)利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)開發(fā)

52、新產(chǎn)品; 2)采 用新的高效表達系統(tǒng)，利用動物細(xì)胞，特別是整體動 物大量表達基因工程醫(yī)藥產(chǎn)品; 3)將基因組研究成果 轉(zhuǎn)化為生物技術(shù)新藥; 4)開發(fā)新劑型的生物技術(shù)藥物。 人類基因組測序工作完成，對人的健康與疾病 起因有更深入的認(rèn)識。盡管第一張人類基因組測序工 作草圖尚未弄清所有人類基因的功能。但是這些基因 產(chǎn)物（即活性蛋白質(zhì)）被表達出來，將會有幾千種甚 至更多具有特殊療效的蛋白藥物的誕生。因此，基因 工程藥物具有很大的增長空間和發(fā)展前景。 130 300 450 0 200 400 600 億美元 199820012006 年 全球生物技術(shù)藥品銷售額全球生物技術(shù)藥品銷售額 增長情況增長情況

53、18 30 300 0 100 200 300 億元 199019972005 年 中國生物技術(shù)藥品市場情況中國生物技術(shù)藥品市場情況當(dāng)前全球生物技術(shù)藥品分布當(dāng)前全球生物技術(shù)藥品分布 北美6 3 % 其他5% 歐洲2 5 % 日本7 % 現(xiàn)狀和前景現(xiàn)狀和前景 據(jù)據(jù)2002年資料顯示，年資料顯示， 至今世界上已取得的生至今世界上已取得的生 物技術(shù)研究成果中，物技術(shù)研究成果中， 70%以上為醫(yī)藥工業(yè)生以上為醫(yī)藥工業(yè)生 物技術(shù)產(chǎn)品。物技術(shù)產(chǎn)品。 生物藥品名稱生物藥品名稱適應(yīng)性適應(yīng)性年銷售額年銷售額(億美元億美元) 抗CD3MAb移植排斥0.80 DNase囊性纖維變性1.11 EPO貧血16.50 因

54、子血友病2.50 G-CSF嗜中性白細(xì)胞減少癥9.36 葡萄糖腦苷酯酶Gaucher氏病2.15 GM-CSF骨髓移植0.41 GPb/aMAb血管造形術(shù)中血凝塊1.30 B型肝炎疫苗B型肝炎10.00 人生長激素生長不良，腎功能不全4.50 人胰島素糖尿糖7.00 人白細(xì)胞介素-2腎癌0.40 -干擾素癌癥，肝炎7.00 -干擾素多發(fā)性硬化2.55 -干擾素肉芽腫病0.04 tPA心力衰竭/栓塞/中風(fēng)3.00 總計68.62 16種生物技術(shù)藥物銷售情況 種生物技術(shù)藥物銷售情況 我國已批準(zhǔn)生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物和疫苗我國已批準(zhǔn)生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物和疫苗 名稱名稱 作作 用用 rhu IFN1b (外

55、用) 病毒性角膜炎 rhu IFN1b 乙肝、丙肝 rhu IFN2a 乙肝、丙肝、皰疹等 rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝 rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等 rhu IFN2a (栓劑) 婦科病 rhu IFN2b (凝膠劑) 皰疹等 rhu IFN 類風(fēng)濕 rhu EGF(外用) 燒傷、創(chuàng)傷 EGF 衍生物 燒傷、創(chuàng)傷 rhu IL2 癌癥輔助治療 rhu IL2 125Ser 癌癥輔助治療上海華晨 rhu GCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞 rhu GMCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞、骨髓移植 rhu EPO 產(chǎn)生紅細(xì)胞 rhu GH 矮小病 bFGF(外用) 創(chuàng)傷、燒傷 RSK 溶血栓(心

56、梗) 抗IL28 單 抗乳膏劑 銀屑病 人胰島素 糖尿病 乙肝疫苗乙肝疫苗 預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝 痢疾疫苗 預(yù)防痢疾 第二節(jié)第二節(jié) 新型生物藥物研制的理論和新型生物藥物研制的理論和 方法方法 新型生物藥物新型生物藥物是指利用是指利用生物體或生物過程生物體或生物過程產(chǎn)產(chǎn) 生的生的結(jié)構(gòu)新穎結(jié)構(gòu)新穎的藥物。的藥物。結(jié)構(gòu)新穎結(jié)構(gòu)新穎是指與以前是指與以前 藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是種新的化學(xué)種新的化學(xué) 實體實體(New chemical entity(New chemical entity，簡稱，簡稱NCE)NCE)。這。這 類新型生物藥物國家認(rèn)定為一類新藥。國際類新型生物藥物國家

57、認(rèn)定為一類新藥。國際 上所說的新藥開發(fā)就是指開發(fā)上所說的新藥開發(fā)就是指開發(fā)NCENCE藥物。根藥物。根 據(jù)據(jù)NCENCE來源進行生物藥物分類。來源進行生物藥物分類。 一類是一類是利用重組利用重組DNADNA技術(shù)技術(shù)，向大腸桿菌、酵，向大腸桿菌、酵 母、動物、植物細(xì)胞中導(dǎo)入目的基因，母、動物、植物細(xì)胞中導(dǎo)入目的基因，構(gòu)建構(gòu)建 重組細(xì)胞重組細(xì)胞，生產(chǎn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)類、，生產(chǎn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)類、 多肽類藥物或疫苗，或?qū)⒁恍┨厥饣蚣盎嚯念愃幬锘蛞呙纾驅(qū)⒁恍┨厥饣蚣盎?因片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞后使宿主細(xì)胞產(chǎn)生原來因片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞后使宿主細(xì)胞產(chǎn)生原來 不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，獲得新功能，或阻遏宿不

58、能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，獲得新功能，或阻遏宿 主細(xì)胞基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，抑制其主細(xì)胞基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，抑制其 功能，甚至殺死宿主細(xì)胞，即功能，甚至殺死宿主細(xì)胞，即。 另一類是另一類是利用微生物、動植物細(xì)胞或酶生產(chǎn)利用微生物、動植物細(xì)胞或酶生產(chǎn) 的非上述藥品，通過的非上述藥品，通過篩選篩選可獲得這類新藥的可獲得這類新藥的 NCENCE的的先異物先異物(Lead compound)(Lead compound)。這類藥物種。這類藥物種 類繁多，包括傳統(tǒng)的利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥類繁多，包括傳統(tǒng)的利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥 物和直接從動植物中提取的天然藥品等。物和直接從動植物中提取的天然藥品等。 (1)

59、 (1) 確定研究計劃確定研究計劃 要綜合考慮醫(yī)療、市場、要綜合考慮醫(yī)療、市場、 化學(xué)的評估化學(xué)的評估, ,文獻狀況文獻狀況, ,專利的檢索專利的檢索, ,結(jié)構(gòu)的選結(jié)構(gòu)的選 擇，合成的前景等因素。擇，合成的前景等因素。 (2) (2) 準(zhǔn)備化合物準(zhǔn)備化合物 文獻研究文獻研究, ,合成或分離合成或分離, ,結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 鑒定鑒定, ,標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化, ,專利申請專利申請, ,對研究目標(biāo)的復(fù)核等。對研究目標(biāo)的復(fù)核等。 以上兩個環(huán)節(jié)需占用以上兩個環(huán)節(jié)需占用l l2 2年的時間，需準(zhǔn)備年的時間，需準(zhǔn)備 6000600080008000個化合物供篩選。個化合物供篩選。 (3) (3) 藥理篩選藥理篩選。 (4

60、) (4) 化學(xué)試驗化學(xué)試驗 活性成分的分析。活性成分的分析。 (5) (5) 臨床前臨床前期期(Preclinical I) (Preclinical I) 進一步藥進一步藥 理研究包括毒性理研究包括毒性(2(2種動物種動物) )及活性成分的穩(wěn)及活性成分的穩(wěn) 定性。定性。 (6) (6) 臨床前臨床前期期(Preclinical ) (Preclinical ) 進一步藥進一步藥 理研究包括亞急性毒性理研究包括亞急性毒性(2(2種動物種動物) )、畸胎學(xué)、畸胎學(xué) 研究、藥物動力學(xué)、動物體內(nèi)的吸收和排泄、研究、藥物動力學(xué)、動物體內(nèi)的吸收和排泄、 劑型的研究與開發(fā)、包裝與保存期的研究。劑型的研究