色譜基本知識(shí)入門

1、1.1色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展 1.1.1 色譜分析法的歷史 色譜法是1906年俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett創(chuàng)立 葉綠素分離動(dòng)畫 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：混合物被分成不同顏色的區(qū)域 色譜帶， 所以命名為色譜法（色層法、層析法）. 不同色素的運(yùn)動(dòng)距離s=vt 第一章 色譜分離法概述 M.Tswett 實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)： CaCO3固定相 石油醚流動(dòng)相 混合物隨流動(dòng)相在柱中流動(dòng)，吸附 脫附 再吸附 再脫附 分離 兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng) 現(xiàn)在的色譜法是指含義更為廣泛的分 離方法：它是利用混合物中各組分在互不 相溶的兩相中分配系數(shù)的差異，當(dāng)兩相作 相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，混合物各組分在兩相中反復(fù) 分配達(dá)到分離，然后分別測(cè)定，是一種分 離與檢測(cè)相結(jié)

2、合的方法。 固定相 固體 液體 流動(dòng)相 氣體 液體 超臨界流體 色譜分離基本原理色譜分離基本原理 利用利用外力外力使含有樣品的使含有樣品的流動(dòng)相流動(dòng)相通過(guò)一固定于通過(guò)一固定于柱柱或或平板平板 上、與流動(dòng)相互不相溶的上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相固定相表面。樣品中各組份在兩表面。樣品中各組份在兩 相中進(jìn)行不同程度的相中進(jìn)行不同程度的作用作用。 與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動(dòng)相流出的速度慢；與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動(dòng)相流出的速度慢； 與固定相作用弱的組份隨流動(dòng)相流出的速度快。與固定相作用弱的組份隨流動(dòng)相流出的速度快。 由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個(gè)由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形

3、成各個(gè)單組單組 份份的的“帶（帶（band）”或或“區(qū)（區(qū)（zone）”，對(duì)依次流出的各個(gè)對(duì)依次流出的各個(gè) 單組份物質(zhì)可分別進(jìn)行單組份物質(zhì)可分別進(jìn)行定性定性、定量定量分析。分析。 色譜法于色譜法于1906年創(chuàng)立后一直被遺忘，直到了年創(chuàng)立后一直被遺忘，直到了1931年，年， 德籍奧地利化學(xué)家?guī)於鳎ǖ录畩W地利化學(xué)家?guī)於鳎≧.Kuhn）利用茨維特的方法在）利用茨維特的方法在 纖維狀氧化鋁和碳酸鈣的吸附柱上纖維狀氧化鋁和碳酸鈣的吸附柱上,將過(guò)去一個(gè)世紀(jì)以來(lái)公將過(guò)去一個(gè)世紀(jì)以來(lái)公 認(rèn)為單一的結(jié)晶狀胡蘿卜素分離成認(rèn)為單一的結(jié)晶狀胡蘿卜素分離成a 和和b兩個(gè)同分異構(gòu)體，兩個(gè)同分異構(gòu)體， 并由所取得的純胡蘿卜

4、素確定出了其分子式。隨后他還發(fā)并由所取得的純胡蘿卜素確定出了其分子式。隨后他還發(fā) 現(xiàn)了八種新類胡蘿卜素，并把它們制成純品，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)現(xiàn)了八種新類胡蘿卜素，并把它們制成純品，進(jìn)行了結(jié)構(gòu) 分析。分析。 同年，庫(kù)恩又把注意力集中在維生素的研究上，確定同年，庫(kù)恩又把注意力集中在維生素的研究上，確定 了維生素了維生素A 的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。 1933年庫(kù)恩從年庫(kù)恩從35000升脫脂牛奶中分離出升脫脂牛奶中分離出1g核黃素核黃素 （即維生素（即維生素B2），制得結(jié)晶，并測(cè)定了它的結(jié)構(gòu)。），制得結(jié)晶，并測(cè)定了它的結(jié)構(gòu)。 此外，他還用色譜法從蛋黃中分離出了葉黃素；此外，他還用色譜法從蛋黃中分離出了葉黃素； 193

5、8年，庫(kù)恩因在維生素和胡蘿卜素的離析與結(jié)構(gòu)年，庫(kù)恩因在維生素和胡蘿卜素的離析與結(jié)構(gòu) 分析中取得了重大研究成果被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。分析中取得了重大研究成果被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 從此，色譜法迅速為各國(guó)科學(xué)工作者注意和應(yīng)用，從此，色譜法迅速為各國(guó)科學(xué)工作者注意和應(yīng)用， 并廣泛用于各種天然有機(jī)化合物的分離并廣泛用于各種天然有機(jī)化合物的分離 1941年，英國(guó)學(xué)者M(jìn)artin和Synge設(shè)計(jì) 了由40個(gè)容器組成的萃取儀器。將蛋白水 解產(chǎn)物乙酰化氨基酸從水相萃取到有機(jī)相 而使其離析出來(lái)。 分離乙?；被峄旌衔飼r(shí)采用 水分飽和的硅膠固定相 含乙醇的氯仿 流動(dòng)相 液-液分配色譜 同時(shí)提出了用氣體代替液體作流動(dòng)

6、相的 可能性。 1952年，James、Martin和Synge在惰 性載體表面涂布一層薄而均勻的有機(jī)化合物 液膜，并用氣體作沖洗劑，成功分離脂肪酸 和脂肪胺系列。 氣液色譜法產(chǎn)生。 同時(shí)對(duì)氣液色譜法的理論與實(shí)踐做了精 確的敘述，提出塔板理論，因而Martin和 Synge獲得1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1956年Van Deemter 等在前人研究的 基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過(guò)程的速率理論， 提出了速率理論方程。1965年Giddings總 結(jié)和擴(kuò)展了前人的色譜理論，為色譜的發(fā) 展奠定了理論的基礎(chǔ)。 1957年，Golya發(fā)明了開口管毛細(xì)管 柱，使氣相色譜的分離能力大大提高。同 年，霍姆斯等人首

7、次把氣相色譜與質(zhì)譜儀 連用成功，使色譜鑒定能力弱的缺點(diǎn)得到 克服。 20世紀(jì)60年代末，高壓泵和化學(xué)鍵合相 用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜 （HPLC)。 20世紀(jì)80年代初，超臨界流體色譜(SFC) 得到發(fā)展，在90年代得到廣泛的應(yīng)用。 20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的毛細(xì)管電泳 (CZE),在90年代得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。 1.1.2 色譜分析法的現(xiàn)代發(fā)展 20世紀(jì)初葉：色譜法產(chǎn)生，基本停滯30年后復(fù)蘇 40年代：有突破性發(fā)展 50年代：有廣度性的發(fā)展 60年代：有普遍性和廣泛性的發(fā)展 70年代：有深入的高階段發(fā)展 80年代：有突飛猛進(jìn)、全面的高層次發(fā)展 90年代后 ：基礎(chǔ)理論研究、色譜方法

8、應(yīng)用、色譜 儀器進(jìn)化都日新月異。 色譜科學(xué)現(xiàn)代發(fā)展基本狀況 色譜法的提出由經(jīng)典液相色譜開始，色譜理論 的發(fā)展是在氣相色譜中提出并不斷進(jìn)步和完善。 （1）色譜理論 色譜理論研究的三個(gè)問(wèn)題是： 熱力學(xué)：組分在兩相間的分配問(wèn)題 動(dòng)力學(xué)：組分在兩相中擴(kuò)散問(wèn)題 分離條件：如何達(dá)到高分離效能和快速的目的 理論研究方向的工作： 柱過(guò)程熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù); 多維色譜配套; 開管柱和高效液相色譜柱; 保留規(guī)律預(yù)測(cè); 最佳色譜分離條件選擇; 超臨界流體色譜等. （2）色譜技術(shù)問(wèn)題 色譜技術(shù)的進(jìn)展： 進(jìn)樣技術(shù)（特別是毛細(xì)管色譜）; 色譜柱制備技術(shù); 固定相和流動(dòng)相的選擇技術(shù); 多維色譜系統(tǒng)組分轉(zhuǎn)換技術(shù); 流出組分檢

9、測(cè)技術(shù); 程序升溫技術(shù)和梯度洗脫技術(shù); 復(fù)雜樣品衍生化技術(shù); 高純流出組分制備技術(shù); 多組分樣品分析方法聯(lián)用技術(shù); 色譜系統(tǒng)與化學(xué)反應(yīng)技術(shù); 色譜程序控制和數(shù)據(jù)處理技術(shù); 色譜專家系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)技術(shù). （3）色譜儀器進(jìn)展 按使用領(lǐng)域可分為：分析色譜儀、制備色 譜儀、工業(yè)流程色譜儀等。 按主要方法可分為：氣相色譜儀、液相 色譜儀、薄層色譜儀、離子色譜儀、氨基酸 分析儀、凝膠滲透色譜儀等。 1.2.1 按兩相物理狀態(tài)分類 氣-固色譜（GSC） 氣-液色譜（GLC） 液-固色譜（LSC） 液-液色譜（LLC） 氣相色譜 液相色譜 超臨界流體色譜（SFC） 1.2 色譜法的分類 1.2.2 按固定相的形

10、式分類 （1） 柱色譜 填充柱：固定相填滿色譜柱管. 開管柱：固定相涂于柱管內(nèi)壁，在柱管中 心留有流動(dòng)相通過(guò)的通道。 色譜柱管：色譜柱管：通常是由玻璃、石英或不銹鋼制成的圓管。通常是由玻璃、石英或不銹鋼制成的圓管。 Packed GC column Capillary GC column WCOT PLOT （2）平面色譜 紙色譜： 濾紙上結(jié)合的水分或弱或弱/ 非極性溶劑非極性溶劑作固定相. 薄層色譜： 將粉末狀的固定相 鋪成薄層作固定相 1.2.3 按分離過(guò)程的原理分類 吸附色譜：固定相表面對(duì)不同組分的吸附性 能差異而分離. 分配色譜：不同組分在固定液中的溶解度不 同而分離 。 正相色譜：流

11、動(dòng)相的極性小于固定相 反相色譜：流動(dòng)相的極性大于固定相 離子交換色譜：不同組分在離子交換劑上的親 和力不同而分離. 分子排阻色譜：利用分子的大小不同而在多孔 物質(zhì)中的選擇性滲透而分離。 電色譜（電泳）：利用帶電粒子在電場(chǎng)中的電 效應(yīng)而分離. 1.2.4 按色譜動(dòng)力學(xué)過(guò)程分類 前沿法（迎頭法） 樣品本身是流動(dòng)相，開始時(shí) 各組分留在柱上，柱飽和后流出 色譜柱，與固定相作用力小的先 流出。 吸附或溶解能力:123 流出順序:1,1+2,1+2+3 臺(tái)階的位置:組分定性 臺(tái)階的高度：各組分定量 應(yīng)用:簡(jiǎn)單混合物的分離、純化. 頂替法(置換法) 樣品從色譜柱一端加 入，再將一種吸附力或溶 解力比各組分均

12、大的置換 劑加入柱中，將各組分置 換出來(lái)。 吸附或溶解能力:123 流出順序： 1，12，2，23，3, 3置換劑 應(yīng)用:適于族的分離 淋洗法 先把試樣加入色譜柱 中，再用一種對(duì)固定相的 作用力比樣品弱的流動(dòng)相 洗脫，各組分沿柱下行的 速度受三個(gè)互相作用因素 （組分溶劑固定相） 的制約，每種組分都可以 單獨(dú)洗脫。 應(yīng)用:適于分析目的 1.2.5 按色譜技術(shù)分類 根據(jù)色譜輔助技術(shù)不同，可分為：反應(yīng) 色譜法、裂解色譜法、多維色譜法、頂空色 譜法、程序升溫色譜法等。 按組分的分離目的和分離能力,又可分為制 備色譜、分析色譜、微量色譜等。 （1）分離效能高 可分離性質(zhì)極為相似的物質(zhì)及復(fù)雜的混 合物.

13、高效液相色譜柱效為 3萬(wàn)塔板/米 氣相色譜柱效約為 2千塔板/米 毛細(xì)管色譜柱效約為712萬(wàn)/2050米 1.3 色譜分析法的特點(diǎn) 1.3.1 色譜分析法的一般特點(diǎn) （2）應(yīng)用范圍廣 幾乎可以用于所有化合物的分離和測(cè)定。 不論是無(wú)機(jī)物、有機(jī)物、低分子化合物或高 分子化合物、甚至有生物活性的生物大分子 也可以進(jìn)行分離測(cè)定。分析試樣可以是液體、 也可以是氣體或固體。 （3）分析速度快 一個(gè)復(fù)雜樣品可以在幾分鐘到幾十 分鐘內(nèi)完成分析。若與質(zhì)譜聯(lián)用，則可 以完成一個(gè)復(fù)雜樣品中100多個(gè)組分的 分離和定性。 （4）靈敏度高，樣品用量少 可檢出10111013g的物質(zhì)量;樣品 用量少，氣體樣品為ml級(jí)，液體樣品 為 級(jí)，固體樣品為 級(jí).L g 1.3.2各種色譜方法的性能比較 (1)與經(jīng)典的化學(xué)法比較 化學(xué)法：根據(jù)某種物質(zhì)具有某種獨(dú)特的 化學(xué)性質(zhì)來(lái)進(jìn)行分析. 色譜法：不受限制，可使化學(xué)性質(zhì)相同 的復(fù)雜組分互相分離. 1.3.3色譜法與其他方法的比較 (2)與光譜、質(zhì)譜法比較 發(fā)射光譜、紅外光譜、質(zhì)譜法：主要是定性 分析的工具（要先分離出純物質(zhì)）. 可見(jiàn)光譜、紫外光譜、原子吸收、熒光法： 主要用于定量分析. 色譜法：主要是分離與分析的工具. 優(yōu)點(diǎn)：擅長(zhǎng)分離分析多組分的復(fù)雜混合物 缺點(diǎn)：定性能力差. （3）與分餾法比較 色譜分離過(guò)程比分餾法快，得到的 純物質(zhì)的純度比分餾法高，但每