烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究碩士論文（可編輯）

1、烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究碩士論文 西北師范大學(xué)碩士學(xué)位論文烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究姓名:張正勇申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):自然地理學(xué)指導(dǎo)教師:張松林2008-05 摘 要 本文以成年斑馬魚(Brachydanio rerio)為實驗材料,以鄰甲酚(o-cresol)、間甲酚(m-cresol)、對甲酚(p-cresol)和 2,4-二叔丁基酚(2,4-di-ter-butylphenol)為研究對象,采用半靜態(tài)室內(nèi)試驗測定了其對斑馬魚的單一毒性實驗(包括 96h急性毒性、28d蓄積毒性和 40d亞急性毒性實驗),并利用斑馬魚對 4種化合物的生物毒理效應(yīng)進行了初步研究

2、。 急性毒性實驗表明,對甲酚、鄰甲酚和間甲酚為中等毒性,2,4-二叔丁基酚為高等毒性。其 96hLC 值及 95%置信限分別為:對甲酚26.30024.266,28.510 50mg/L,鄰甲酚26.60723.227,30.479 mg/L,間甲酚29.85427.669,32.211 mg/L,2,4-二叔丁基酚1.8001.542,2.104 mg/L。其急性毒性順序為:2,4-二叔丁基酚對甲酚鄰甲酚間甲酚。其安全濃度分別為:對甲酚0.263 mg/L,鄰甲酚0.266 mg/L,間甲酚0.299 mg/L,2,4-二叔丁基酚0.018 mg/L。 亞急性毒性試驗結(jié)果顯示,受試物對斑馬魚

3、的的生長(體長、體重)均有比較明顯的影響,一般在染毒的第 3040天之間表現(xiàn)最為明顯。 采用蓄積系數(shù)(K )法評價受試物的蓄積毒性,四種化合物的蓄積毒性均cum為輕度蓄積,其順序為:鄰甲酚2,4-二叔丁基酚對甲酚間甲酚。 觀察斑馬魚對這 4種化合物毒性的組織病理學(xué)響應(yīng)發(fā)現(xiàn):隨著實驗時間的推移,斑馬魚的鰓和肝結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷,鰓小片上皮細胞出現(xiàn)水腫,柱細胞發(fā)生變形;部分肝細胞變得腫大,細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,細胞溶解和核溶解部位出現(xiàn)壞死,細胞質(zhì)中可見脂質(zhì)沉積;同一種化合物中高濃度較低濃度組織病變更加明顯;同一染毒時間,2,4-二叔丁基酚實驗組較其他三種化合物引起的斑馬魚組織病變更加明顯。 可見,斑

4、馬魚的鰓和肝對四種受試化合物的反應(yīng)敏感,而四種受試化合物對斑馬魚鰓和肝的毒性效應(yīng)影響斑馬魚呼吸代謝和肝臟物質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運功能的發(fā)揮,嚴重時會導(dǎo)致斑馬魚死亡。 關(guān)鍵詞:烷基酚;斑馬魚;毒性;鰓;肝 II PDF created with pdfFactory trial version /0. Abstract The adult zebrafish Brachydanio rerio was exposed to o-cresol, m-cresol, p-cresol, and 2,4-di-ter-butylphenol and their toxic effects were assess

5、ed by the individual toxicity test including acute toxicity in 96h, accumulation toxicity in 28d, subacute toxicity in 40d. Furthermore, their biological toxicity effects were investigated with zebrafish gill and liverThe results of acute toxicity test showed that these four compounds had moderate t

6、oxicity. The 96h median lethal concentrations and 95% confidence intervals were 26.300 24.266, 28.510 mg/L for p-cresol, 26.607 23.227, 30.479 mg/L for o-cresol, 29.854 27.669, 32.211 mg/L for m-cresol, and 1.800 1.542, 2.104 mg/L for 2,4-di-butylphenol, respectively. Their toxicity order was 2,4-di

7、-ter-butylphenolp-cresolo-cresolm-cresol. Furthermore, the safe concentrations were 0.263mg/L for p-cresol, 0.266 mg/L for o-cresol, 0.299mg/L for m-cresol, 0.018mg/L for 2,4-di-ter-butylphenolThe results of subacute toxicity test showed that these compounds affected dramatically the growth of weigh

8、t and length. These effects were most distinct during the period from 30th to 40th dayIn the accumulation toxicity test, the numbers of K , used as cumevaluation index, showed that the degree of accumulation for o-cresol, m-cresol, p-cresol, and 2,4-di-ter-butylphenol were all slight. Their accumula

9、tion toxicity order was o-cresol 2,4-di-ter-butylphenolp-cresolm-cresolThe histopathological effects of these four compounds on gill and liver of zebrafish were observed. With the time passed, the structures of gill and liver were damaged in various degrees. The common gill alterations were desquama

10、tion and tumefaction of epithelial cells, and deformation of pillar cells. The hepatic lesions were characterized by hepatocyte hypertrophy, III PDF created with pdfFactory trial version /. nuclear atrophy and deformation, vacuolization, lipidosis. As for the same compound, the histopathological eff

11、ect in high concentration test was more obvious than that in the low one. Otherwise, the histopathological effect exposed to 2,4-di-tert-butyl phenol was more significant than those exposed to the other three compoundsThus, the gill and liver of zebrafish were sensitive to these four compounds. The

12、toxicity of these compounds damaged the functions of zebrafish respiratory metabolism, liver synthesis and transportation, and caused to death in the severe conditionKey words:alkylphenolic compounds; Zebrafish; toxicity; gill; liverIV PDF created with pdfFactory trial version /. 獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人

13、在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包括為獲得西北師范大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽名: 日期: 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解西北師范大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,即:學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件,允許論文被查閱和借閱;學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容,可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 (保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)簽名:導(dǎo)師簽名: 日期:I PDF created w

14、ith pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 第 1章 前 言 1.1 環(huán)境激素的研究進展概述 1.1.1 環(huán)境激素的內(nèi)涵 環(huán)境激素,又稱為環(huán)境荷爾蒙(Environmental Hormones)或環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental Endocrine Disrupting Chemicals,簡寫EDCs),參照美國國家環(huán)保局(EPA)和聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署等文獻的敘述,目前較一致性的描述可認為是:進入生物體內(nèi),可通過干擾生物體自身激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解或產(chǎn)生類似生物體自身激素的作

15、用,對生物有機體維護正常的動態(tài)平衡、繁殖、生長及行為有不利影響的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)(生物體外源物質(zhì))。這些化學(xué)物質(zhì)都有激素樣的作用,即使數(shù)量很少,也可能導(dǎo)致各種生物的性激素分泌量下降、活性減弱、精子數(shù)量減少、生殖器官異常、癌癥等發(fā)病率增加,并1-3影響到各種生物的性行為、生殖功能、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等等 。 4目前,全球已經(jīng)合成的化學(xué)物質(zhì)約1000萬種,每年新合成約10萬種 ,其中列入環(huán)境荷爾蒙的物質(zhì)有70種左右,除鎘、鉛、汞等幾種重金屬外,其它67種都是有機物質(zhì)。67種農(nóng)藥中有44種(殺蟲劑24種、殺蟲劑代謝產(chǎn)物1種、除草劑105種、殺菌劑9種),占65.17% 。其它的還包括染料、香料、涂料、洗

16、滌劑、去污劑、表面活性劑、塑料制品的原料或添加劑、藥品、食品添加劑、化妝品和動植6物性激素等 。 環(huán)境激素的分類如下:依據(jù)其作用功能分為干擾雌激素的環(huán)境化學(xué)物、干擾7睪酮的環(huán)境化學(xué)物、干擾甲狀腺素的環(huán)境化學(xué)物等 。依據(jù)其來源分為人工合成激素、植物性激素、真菌性激素、環(huán)境中的激素樣物質(zhì)。依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)分為多氯聯(lián)苯類、鄰苯二甲酸酯類、氯代烴類、芳香族碳化氫類、烷基酚類、雙酚類、8聯(lián)苯酚類、氯酚類、金屬類、硝基苯類、呋喃類、有機錫類等 。 1.1.2 環(huán)境激素的研究進展 9環(huán)境激素最早出現(xiàn)于20世紀30年代 ,至今已經(jīng)有70多年的歷史。最初的環(huán)境激素是采用人工合成的方法生產(chǎn)的作為醫(yī)藥品的雌性激素,伴

17、隨工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)1PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 展,新的環(huán)境激素物質(zhì)不斷被合成。環(huán)境激素在給人類帶來便利的同時,也出現(xiàn)了意想不到的負面影響。環(huán)境激素被大量釋放到環(huán)境中,又被生物體吸收并在體內(nèi)濃縮,發(fā)揮和生物體內(nèi)正常分泌才產(chǎn)生的激素同樣的作用,使很多野生動物和人體出現(xiàn)了一系列生理異?，F(xiàn)象。環(huán)境激素問題受到了世界許多國家政府,相關(guān)研究學(xué)者和有關(guān)國際組織的高度重視,被視為世界范圍的10大環(huán)境問題之一。 1972年,WHO(世界衛(wèi)生組織)對“有激素作用的化學(xué)物質(zhì)”進行了研究總結(jié),指出了化

18、學(xué)物質(zhì)的激素作用。這次會議上發(fā)表的文斯普雷德宣言使激素問題引起了全球的關(guān)注,目前對環(huán)境激素的研究已經(jīng)成為國際環(huán)境科學(xué)的熱點問題之一。美國、英國和日本等發(fā)達國家正在調(diào)查某些環(huán)境激素的影響,尤其是在地表水、地下水、海水、底泥、土壤、大氣和食品中的污染現(xiàn)狀。同時,調(diào)查內(nèi)容還包括環(huán)境激素的測定方法、污染控制標準以及野生動物和人類被污染的情況等。 1995年,美國政府設(shè)立了由環(huán)保局領(lǐng)導(dǎo)的14個部門組成的環(huán)境激素工作組,并于1996年建立了食品中環(huán)境激素的篩選方法。美國環(huán)保署根據(jù)這個方法開發(fā)調(diào)查農(nóng)藥和其它化學(xué)物質(zhì)是否具有環(huán)境刺激作用。 1998年,美國環(huán)保署分4組對86000種物質(zhì)進行篩選,以進行影響分析

19、。 1996年7月,日本通產(chǎn)省成立“外因性物質(zhì)的激素作用的調(diào)查研究委員會”,接著厚生省著手研究環(huán)境激素問題,并對已有的化學(xué)物質(zhì)進行篩選毒性測試。主要實驗有: 使用哺乳動物進行28天反復(fù)服用的毒性實驗; 使用細菌進行突然變異測試; 使用哺乳動物進行染色體異常測試。在1998年后進行了環(huán)境激素篩10 選技術(shù)研究和環(huán)境激素通過食品進入人體后被吸收、代謝、排泄動態(tài)過程研究 。 1998年OECD(經(jīng)濟合作開發(fā)組織)提出今后工作的主要目的之一是開發(fā)檢測環(huán)境激素物質(zhì)的新的檢測技術(shù)并協(xié)調(diào)各國的行動。主要將進行子宮增重重復(fù)實驗、雄性性腺增重反應(yīng)實驗、28天投毒實驗和魚類、兩棲類、鳥類的生態(tài)毒理實驗?？偟膩碚f,

20、環(huán)境激素對生物影響的研究經(jīng)歷了一個由整體水平上判斷在一定劑量條件下某種化學(xué)物質(zhì)的毒性大小以及毒性的快慢等一個過程。此后,初期的毒理學(xué)研究從整體水平深入到系統(tǒng)和器官水平,對該化學(xué)物質(zhì)的多個器官或系統(tǒng)終點如呼吸、神經(jīng)、肝臟等進行毒性作用研究。 20世紀末,相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和科研技術(shù)工具的進步使環(huán)境激素研究進入了細2PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 胞分子水平,對化學(xué)物質(zhì)的作用機制也提高到在分子水平進行研究。然而,生物11 體是一個復(fù)雜的、多層次有機體, 僅從一個水平上不能進行透徹全面的闡

21、述 。 目前,在美國、英國、丹麥、法國、瑞典和日本等國的研究機構(gòu)也在進行這方面的研究。鑒定環(huán)境激素的方法主要有體檢查法、細胞培養(yǎng)法、激素受體的結(jié)合實驗和基因技術(shù)。 雖然目前國內(nèi)外已對環(huán)境激素有所研究,但由于環(huán)境激素作用機理的復(fù)雜性,用現(xiàn)有的檢測方法還不可能較好地反映環(huán)境激素對人體的潛在危害,尤其是在其如何進入到食物鏈這個重要環(huán)節(jié)方面缺少必要的信息。所以,在這個領(lǐng)域內(nèi)的大量工作需要加大研究力度,而且對于環(huán)境激素的研究屬于多學(xué)科交叉的領(lǐng)域,內(nèi)容涉及環(huán)境科學(xué)、毒理學(xué)、衛(wèi)生學(xué)、化學(xué)、生理學(xué)、生殖學(xué)、人口學(xué)及醫(yī)學(xué)等諸12多學(xué)科,所以需要多學(xué)科的共同努力 。 1.1.3 烷基酚類化合物的研究進展烷基酚類化

22、合物(alkylphenols,APs)是非離子表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚(alkylphenol ethoxylates,APEs)的主要降解產(chǎn)物之一。大部分表面活性劑本身沒有雌激素活性,但非離子表面活性劑在處理污物時或在環(huán)境中降解后能釋放具有雌激素活性的烷基酚,這類物質(zhì)的雌激素活性較高,而且污染廣泛,如壬基酚、辛基酚、雙酚 A等。因 APEs高效而價廉,廣泛應(yīng)用于工業(yè)、商業(yè)、日常生13活及科學(xué)研究中 。如英國幾條河流的污物出口處附近出現(xiàn)雄魚雌性化現(xiàn)象就是14由于污物處理過程中表面活性劑降解產(chǎn)生烷基酚造成的 。 1.1.3.1 烷基酚類化合物的國外研究進展 烷基酚類的雌激素活性在 20世紀就

23、被發(fā)現(xiàn)。國外研究人員早在 1938年就曾15發(fā)現(xiàn)烷基酚類具有雌激素活性 ,1978年 Muller等人報道烷基酚類化合物可以阻止雌二醇與雌激素受體結(jié)合,并能夠?qū)⒋萍に厥荏w上已結(jié)合的激素取代下來,1991年 Soto等人又發(fā)現(xiàn)從聚苯乙烯塑料試管中游離出來的壬基苯酚可以誘導(dǎo)人的雌激素敏感型乳腺癌 MCF-7增生,這些發(fā)現(xiàn)都進一步證明烷基酚類具有雌激素16,17活性 。此后,Jobling與 Sumpter又利用虹鱒魚活體外生物評估法證實 4-辛基苯酚(OP)、4-壬基苯酚(NP)及 4-壬基-苯氧基乙酸(NP1EC)、4-壬基-苯氧3PDF created with pdfFactory tria

24、l version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 18,19基-雙氧乙烯醚(NP2EO)均具有雌激素活性 。 1.1.3.2烷基酚類化合物的國內(nèi)研究進展在國內(nèi),劉征濤等進行了一系列烷基酚的毒性實驗,如用發(fā)光菌對 16 種烷基酚進行了毒性測試(EC )并利用分子連接性指數(shù)、辛醇/水分配系數(shù)及電子參5020 21數(shù)進行毒性預(yù)測 。而大型蚤 24h急性毒性實驗和 21d生殖毒性實驗結(jié)果表明 ,所測 4種烷基酚化合物均可對大型蚤的生殖特性產(chǎn)生活性影響。其中,4 -辛基酚和對壬基酚不但能抑制大型蚤的生殖量,還可改變大型蚤孤雌生殖的幼蚤性別比率。他們還采用金魚(Caras

25、sius auratus)幼魚的卵黃蛋白原(VTG)作為雌激素22污染的生物標志物,評價了幾種酚類化合物的雌激素效應(yīng)?？字久?等用單細胞凝膠電泳技術(shù),研究了烷基酚類化合物對離體小鼠睪丸細胞 DNA的損傷作用。實驗結(jié)果表明: 9種烷基酚類化合物對小鼠睪丸細胞均能引起不同程度的 DNA損23傷,并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。唐偉等 測定了 8種取代苯酚在不同 pH下對發(fā)光菌24的毒性 15min-EC ,得出酚類對發(fā)光菌的毒性隨 pH值的升高而減小。張穎 采50用發(fā)光菌、斜生柵藻、大型蚤、金魚對苯酚及 7種烷基酚和 6種氯代酚共 14種酚類化合物進行了急性毒性實驗,并初步探討了烷基酚化合物的環(huán)境激素效應(yīng)。劉

26、25紅玲等 研究了氯代酚和烷基酚類化合物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。 1.2 魚類組織形態(tài)學(xué)的研究概述 魚類組織形態(tài)的研究歷史較長,可追溯到 19世紀 60年代。最早開始的是結(jié)構(gòu)和生理方面的研究,經(jīng)過近 150年各國學(xué)者的探索,從大體解剖到組織學(xué)、組織化學(xué)、電鏡和免疫組織學(xué),再進一步到生物化學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等,23研究已較為詳細和深入 。 一般生物體暴露于污染環(huán)境中,毒物通過各種途徑進入生物體體內(nèi)后,首先經(jīng)一系列氧化、還原、水解或結(jié)合等生化反應(yīng)后或被代謝成無毒或低毒代謝物而陸續(xù)排出體外,或轉(zhuǎn)化為更毒的代謝物作用不同的靶器官。其次,毒物或活性代謝物與其受體進行原發(fā)反應(yīng),使受體改性,隨后引起

27、生物化學(xué)反應(yīng),如酶活性誘導(dǎo)或抑制、細胞膜破壞、蛋白質(zhì)合成受阻等;最后,引起一系列病理生理的繼發(fā)24反應(yīng),表現(xiàn)整個機體可觀察毒性反應(yīng) 。魚鰓是魚類重要的呼吸器官,鰓結(jié)構(gòu)損傷可能造成斑馬魚呼吸障礙;肝臟是魚類新陳代謝的中心,也是各種外源性異生4PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 物質(zhì)的解毒器官,當魚類被暴露在有毒環(huán)境中進行呼吸和消化活動時,鰓和肝臟25的損傷程度更加明顯 。 1.2.1魚鰓的組織形態(tài)學(xué)研究進展 魚鰓是魚類重要的呼吸器官,大多數(shù)魚類鰓的結(jié)構(gòu)基本相似,都是由鰓弓、鰓耙、鰓絲、

28、鰓小片等組成。鰓主要承擔氣體交換任務(wù), 同時還具有排泄氯化物、26參與調(diào)節(jié)滲透壓等功能。鰓結(jié)構(gòu)損傷可能造成斑馬魚呼吸障礙 。 27鰓的組織學(xué)研究比較詳細,據(jù)邢維賢等報道 ,Reiss最早研究了硬骨魚鰓絲的結(jié)構(gòu)。之后有許多學(xué)者借助光鏡、透射電鏡和掃描電鏡等技術(shù)對多種魚鰓的組28,29織形態(tài)進行了研究 。 1.2.2 魚肝臟的組織形態(tài)學(xué)研究進展 肝臟是消化系統(tǒng)的一部分,作為主要的消化腺,在魚類的消化和吸收、物質(zhì)代謝、解毒和防御等生命活動過程中具有特別重要的作用。肝臟是魚代謝的中心,也是各種外源性異生物質(zhì)的解毒器官。 許多研究表明,毒物會對生物肝臟產(chǎn)生損傷,誘導(dǎo)肝臟解毒系統(tǒng)的活化(如MFO多功能混合

29、氧化酶系統(tǒng))。毒物濃度過高會對肝臟細胞造成損害,肝臟細胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出異常和病變特征。肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂質(zhì)體及細胞器損失,表明了毒物對肝臟代謝的影響。 國內(nèi)外學(xué)者在魚類消化系統(tǒng)的研究過程中,一般都要對肝臟的形態(tài)學(xué)進行簡單或詳細的描述,因此魚類肝臟的研究始于魚類消化系統(tǒng)的研究。20世紀 60年代以前,學(xué)者們主要在大體解剖、組織學(xué)和組織化學(xué)等方面做工作;在肝臟方面,30他們分別對底?(Fundulus heteroclitus)肝臟的形態(tài)和功能 ,幼鯉(Cyprinus 31,32carpio)肝臟的原基來源及演化 ,魚類及幼鯉肝臟的組織結(jié)構(gòu)及其與食欲的關(guān)33 34,35系 ,鯉魚和白鰱(Hypoph

30、thalmichthys molitrix)肝臟的大體解剖 等。 20世紀 60年代以后,由于電鏡的廣泛使用和生物工程技術(shù)的發(fā)展,學(xué)者們圍繞魚類的肝臟等進行了大量卓有成效的研究,取得了不少有價值的研究成果;在很多魚類肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)方面進行了大量的觀察和描述,并與其功5PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 能(尤其是食性、繁殖和生存條件)聯(lián)系起來進行探討。加上對肝臟的發(fā)生和發(fā)育規(guī)律研究,都極大地豐富了魚類肝臟的形態(tài)學(xué)知識。 1.3 斑馬魚概述及其在毒理學(xué)上的應(yīng)用 1.3.1 斑

31、馬魚概述 斑馬魚(Brachdanio rerio)是屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔尼魚屬(Danio)的一種硬骨魚。斑馬魚原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、緬甸以及孟加拉國的小溪、稻田及恒河中游地區(qū),是一種常見的熱帶觀賞魚,因其體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍與銀色相間的條紋而得名。斑馬魚對水質(zhì)要求不高,水質(zhì)為中性,水溫以 22-26為宜。其耐熱性和耐寒性都很強,可在 10以上的水中很好的生長,屬低溫低氧魚。可與其他小型魚混養(yǎng),對食物不挑剔,各種動36物性飼料、干飼料均可。此魚很少患病,極易飼養(yǎng) 。 1.3.2 斑馬魚的毒理學(xué)研究概述 斑馬魚最早作為胚胎發(fā)育

32、生物學(xué)和遺傳學(xué)的實驗動物模型,被廣泛地運用于早期胚胎發(fā)育、基因表達調(diào)控的研究。由于其胚胎在宮外迅速發(fā)育、胚體透明、易于進行顯微注射等操作、遺傳背景清楚且繁殖能力強,目前仍然是國內(nèi)外胚胎發(fā)育學(xué)者和遺傳學(xué)家們的寵兒。20世紀 70年代末期,國內(nèi)開始運用斑馬魚進行化學(xué)物質(zhì)的急性毒性研究,研究的化學(xué)物包括鋅、鎘、汞等重金屬以及苯酚、苯胺、環(huán)己胺等有機物。90年代開始被用于混合化合物的急、慢性毒性檢測,以及重金屬的生物累積效應(yīng)研究等。最近 10年,國內(nèi)外運用斑馬魚(以及轉(zhuǎn)基因斑馬魚)作為動物模型進行環(huán)境毒理學(xué)研究和檢測的設(shè)想已逐步成熟,尤其是運用斑3739馬魚及類似實驗用魚對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究活動迅

33、速發(fā)展 。 斑馬魚作為醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和毒性檢測實驗動物,在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。由于斑馬魚的神經(jīng)中樞系統(tǒng)、內(nèi)臟器官、血液以及視覺系統(tǒng)在分子水平上 85%與人相同,尤其是心血管系統(tǒng),早期發(fā)育與人類極為相似,已成為研究心血管疾病基因的最佳模式生物,同時也是人類基因組計劃中功能染色體組研究的理想模型。斑馬魚不僅用作一些生物基本問題解答和人類疾病的模4042型動物,而且不久將作為水環(huán)境監(jiān)測和污染檢測的常規(guī)實驗魚類 。 6PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 總之,在國內(nèi)斑

34、馬魚多局限于胚胎發(fā)育學(xué)研究,有關(guān)其在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用報道比較少。 1.4 研究內(nèi)容和技術(shù)路線 1.4.1 研究內(nèi)容 本研究選擇四種典型的烷基酚類化合物為研究對象,以國際標準化組織(ISO)推薦使用的標準化魚類毒性實驗動物斑馬魚為實驗材料,進行以下幾個方面的研究工作: (1)通過四種化合物對斑馬魚的急性毒性實驗,分別得出四種化合物的96h半致死濃度(LC )和安全濃度,進而對斑馬魚的肝臟和鰓器官進行組織切片觀50察,探討四種化合物在不同濃度和不同時間下對斑馬魚形態(tài)組織結(jié)構(gòu)的影響。 (2)在急性毒性實驗基礎(chǔ)上,分別進行四種化合物對斑馬魚的亞急性毒性實驗,得出亞急性毒性實驗中斑馬魚的體長、體

35、重變化數(shù)據(jù),并且對斑馬魚的肝臟和鰓器官進行組織切片觀察,探討四種化合物在不同濃度和不同時間下對斑馬魚形態(tài)組織結(jié)構(gòu)的影響和變化情況。 (3)以劑量定期遞增染毒法進行四種化合物的蓄積毒性實驗。依據(jù)實驗求得蓄積系數(shù)值與蓄積系數(shù)強度分級,并且對斑馬魚的肝臟和鰓器官進行組織切片觀察,探討四種化合物在不同濃度和不同時間下對斑馬魚形態(tài)組織結(jié)構(gòu)的影響和變化情況。進而對受試物的蓄積作用做出評估。 1.4.2 技術(shù)路線 見技術(shù)路線圖(圖1.1) 1.5 研究目的及意義斑馬魚的單一毒性實驗,在一定程度上可以彌補這類化合物水生生物毒性數(shù)據(jù)的不足,為其對水生生物的損傷程度以及生態(tài)風險評價和管理提供可靠的依據(jù);同時這種生

36、物監(jiān)測方法可以彌補水質(zhì)理化方法監(jiān)測的不足,且為制定漁業(yè)水質(zhì)標7PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 準、評價水環(huán)境質(zhì)量和管理廢水排放提供科學(xué)依據(jù); 基于斑馬魚鰓和肝臟的功能和特性,將鰓和肝臟作為靶器官,對染毒后斑馬魚的鰓和肝臟進行組織切片觀察,探討斑馬魚肝臟和鰓等器官的損傷程度作為雌激素性化合物毒性效應(yīng)指標的可能性。研究魚鰓和鰓上器結(jié)構(gòu)具有一定的生物學(xué)意義,可對魚的呼吸機理探討提供參考資料,對魚類的養(yǎng)殖、長途運輸和防病治病等方面也有一定的參考價值。聯(lián)系動物肝臟的結(jié)構(gòu)和功能,可望進一步豐

37、富動物學(xué)及魚類形態(tài)學(xué)知識,為動物及魚類比較解剖學(xué)、組織學(xué)、消化和循環(huán)生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等提供新資料,并為魚類資源和魚類養(yǎng)殖學(xué)提供理論依據(jù)。毒 理 實 驗96h急性毒性實驗 亞急性毒性實驗 蓄積毒性實驗LC 、安全濃 受試組與對照組50瞬時生長率 蓄積系數(shù) 度、置信限 對比觀察眼觀 切片 病變 觀察 肝內(nèi)化合物 斑馬魚 化合物 體鰓 臟 毒性分析 生長情況 蓄積情況 臟 表形態(tài)結(jié)構(gòu)變化1. 化合物毒性大小對斑馬魚形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響2. 染毒時間對斑馬魚形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷程度圖 1.1 技術(shù)路線圖 8PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物

38、斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 1.6 參考文獻 1 李杰, 司紀亮. 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)簡介J. 環(huán)境與健康雜志, 2002, 191: 83-842 杜克久, 徐曉白. 環(huán)境雌激素研究進展J. 科學(xué)通報, 2000, 4521: 2241-22513 Kavlock R J, Daston G P, Derosa C, et al. Research needs for risk assessment of health and environmental effects of endocrine disrupters: A report of the U. S. EPA -spo

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50、馬魚:在生命科學(xué)中暢游J. 生命科學(xué), 2006, 185: 431-434 11 PDF created with pdfFactory trial version /.張正勇烷基酚類化合物斑馬魚毒性的組織形態(tài)學(xué)研究西北師范大學(xué) 第 2章 材料與方法 2.1 實驗材料 2.1.1 受試化合物及其配制 鄰甲酚 o-cresol(99%,蘭州市長興石油化工廠)、對甲酚 p-cresol(99%,蘭州市長興石油化工廠)、間甲酚 m-cresol(AR,國藥集團化學(xué))、2,4-二叔丁基酚2,4-di-ter-butylphenol(AR,天津市光復(fù)精細化工研究所)。 分別將鄰甲酚、對甲酚、間甲酚、2,4-二叔丁基酚以丙酮助溶,再用蒸餾水定容,配制成相應(yīng)濃度的貯備液。丙酮助溶劑含量不超過 0.1ml/L。需要其他濃度時,分別以貯備液配得。母液至少每 2天配制一次。配好后低溫、避光存放。 2.1.2 實驗動物及其馴養(yǎng) 以斑馬魚成魚為實驗動物。于蘭州市花鳥魚市場購買實驗用魚(成魚)。實驗前將斑馬魚馴養(yǎng) 2周,使之適應(yīng)實驗室條件下的生活環(huán)境并進行健康選擇。馴養(yǎng)期間,每天換水,每天早晚各喂食 1次,進食 30min后吸除殘餌和糞便。馴養(yǎng)期間實驗魚死亡率不得超過 5%,否則認為這批魚