工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接酶課件

1、工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 1 第二章 基因工程的 酶學(xué)基礎(chǔ) 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 2 第二節(jié)第二節(jié) DNA連接酶連接酶 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 3 2.1 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)(P21) 1967年，世界上有數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)年，世界上有數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā) 現(xiàn)了一種能夠催化在現(xiàn)了一種能夠催化在2條條DNA鏈之間形成磷鏈之間形成磷 酸二酯鍵的酶，即酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶連接酶(ligase)。 這種酶需要在一條這種酶需要在一條DNA鏈的鏈的3-末端具有一末端具有一 個游離的羥基個游離的羥基(-OH)，和在另一條，和在另一條DNA鏈的鏈

2、的 5-末端具有一個磷酸基團末端具有一個磷酸基團(-P)，只有在這種只有在這種 情況下，才能發(fā)揮其連接情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能分子的功能 作用。作用。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 4 在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反連接酶催化的連接反 應(yīng)，是利用應(yīng)，是利用NADNAD 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型氧化型)作作 能源的；能源的； 而在動物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用而在動物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用ATP腺苷三磷酸腺苷三磷酸 作能源。作能源。 DNA連接酶連接酶并不能夠連接兩條單鏈的并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或

3、環(huán)分子或環(huán) 化的單鏈化的單鏈DNA分子分子，被連接的鏈必須是雙螺，被連接的鏈必須是雙螺 旋的一部分。實際上，旋的一部分。實際上，DNA連接酶是連接酶是封閉雙螺旋封閉雙螺旋 DNA骨架上的切口骨架上的切口(nick)，即在雙鏈，即在雙鏈DNA的某一的某一 條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所 出現(xiàn)的單鏈斷裂。出現(xiàn)的單鏈斷裂。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 5 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 6 2.2 DNA連接酶的基本性質(zhì)連接酶的基本性質(zhì) 修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵上切口處的磷酸二酯鍵 5G-C-T-C-T-G-

4、C-A G-G-A-G 3 3C-G-AG A-C-G-T-C-C-T-C 5 OH P P OH 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 nick nick DNA連接酶連接酶 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 7 修復(fù)與修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上切口處的磷鏈上切口處的磷 酸二酯鍵酸二酯鍵 5G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 3 3C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 5G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 3 3C-G-A-G- A-C-G-T-C-C-T-C 5 P

5、OH DNA連接酶連接酶 nick 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 8 連接多個平頭雙鏈連接多個平頭雙鏈DNA分子分子 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 P-C-A-G-G-A-G 3 OH-G-T-C-C-T-C 5 DNA連接酶連接酶 5G-C-T-C-T-G-OH 3C-G-A-G-A-C-P 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 9 2.3 分類分類（P21） 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶連接酶 T4DNA連接酶連接酶 來源來源大腸桿菌大腸桿菌T4噬菌體噬菌體 能源輔助因子能源輔助因子 NAD+ATP 功能

6、功能主要催化主要催化DNA黏性末黏性末 端端的連接的連接 黏性末端、平黏性末端、平 末端均可連接末端均可連接 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 10 10連接緩沖液連接緩沖液 1.0L 目的序列回收產(chǎn)目的序列回收產(chǎn) 物物 5.0L T4 DNA連接酶連接酶 （3U/ L） 0.5L 雙酶切后的植物雙酶切后的植物 表達載體表達載體 3.5L 總體積總體積10.0L 1U DNA連接酶的酶活連接酶的酶活 性：在最佳反應(yīng)條件下性：在最佳反應(yīng)條件下 15 反應(yīng)反應(yīng)1 小時小時，完全，完全 連接連接1g-DNA （HindIII片段）所需的片段）所需的 酶量酶量 2.4 DNA連接酶的反應(yīng)體系連接酶

7、的反應(yīng)體系 某植物表達載體的連接體系某植物表達載體的連接體系 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 11 連接酶連接切口連接酶連接切口DNA的最佳反應(yīng)溫度是的最佳反應(yīng)溫度是 37。但是在這個溫度下，黏性末端之間。但是在這個溫度下，黏性末端之間 的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此，連接黏性的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此，連接黏性 末端的最佳溫度，應(yīng)是界于酶作用速率和末端的最佳溫度，應(yīng)是界于酶作用速率和 末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為415比較比較 合適。合適。 平末端的連接采用平末端的連接采用T4DNA聚合酶，可在較聚合酶，可在較 高的溫度進行，如高的溫度進行，如22 。 工學(xué)基因工程

8、酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 12 同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接 同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接 不同黏性末端的連接不同黏性末端的連接 2.5 體外連接體外連接DNA片段的方式片段的方式（P130-135） 黏黏 性性 末末 端端 平末端的直接連接平末端的直接連接 末端修飾后的連接末端修飾后的連接 加上連桿（加上連桿（ linker ），使之形成黏性末），使之形成黏性末 端后，再用端后，再用DNA連接酶連接連接酶連接 DNA接頭接頭(adapter)連接法連接法 具黏性末端的具黏性末端的DNA片段的連接比較容易片段的連接比較容易，也較常用。，也

9、較常用。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 13 2.5.1同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接 GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 EcoRI G CTTAA 5 5 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA AATTC G5 AATTC G G CTTAA 5 T4DNA連接酶連接酶 退火退火 G CTTAA G CTTAA 5AATTC G5 AATTC G 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 14 2.5.2同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接 TGATC

10、A ACTAGT 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 5 BclI BamHI T ACTAG 5 5 GATCA T G CCTAG GATCC G T4DNA連接酶連接酶 退火退火 G CCTAG GATCC G5 GATCA T T ACTAG 5 G CCTAG GATCC G5 GATCA T G CTTAA 5 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 15 2.5.3不同黏性末端的連接不同黏性末端的連接 CTGCAG GACGTC 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 5 BamHIPstI CTGCA G 5 5 G A

11、CGTC G CCTAG GATCC G T4-DNA pol切平切平Klenow補平補平 C G 5 5 G C GGATC CCTAG GATCC CTAGG T4DNA ligase G CCTAG GATCC G 5 GATCG C C GCTAG 5 G CCTAG GATCC G5 GATCG C C GCTAG 5 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 16 2.5.4平末端的直接連接平末端的直接連接 從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造 的黏性末端的連接屬于的黏性末端的連接屬于分子內(nèi)部分子內(nèi)部的連接，而平頭末的連接，而平頭末

12、端的連接則屬于端的連接則屬于分子間分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度的連接，因此后者反應(yīng)速度 要慢得多要慢得多 提高平頭末端連接效率的方法包括：提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（加大連接酶用量（10倍于黏性末端的連接）倍于黏性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用，促進大分子之間的有效作用 加入單價陽離子（加入單價陽離子（NaCl），最終濃度），最終濃度150-200 mM 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 17 2.5.4平末端的連接平末端的連接 （1）直接用

13、）直接用T4DNA連接酶連接；連接酶連接； （2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端 DNA分子加上分子加上同聚物尾巴同聚物尾巴之后再用之后再用DNA連連 接酶進行連接；接酶進行連接； （3）用）用連桿連桿連接平末端連接平末端DNA分子；分子； （4）DNA接頭接頭連接法。連接法。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 18 直接用直接用T4DNA連接酶連接平末端連接酶連接平末端 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 P-C-A-G-G-A-G 3 OH-G-T-C-C-T-C 5 T4DNA連接

14、酶連接酶 5G-C-T-C-T-G-OH 3C-G-A-G-A-C-P 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 19 2.5.5末端修飾后的連接末端修飾后的連接 DNA片段末端片段末端同聚物加尾同聚物加尾后連接（用末端后連接（用末端 脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）給具平末端的）給具平末端的 DNA片段加上片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用尾巴之后，再用DNA 連接酶將它們連接起來）連接酶將它們連接起來） P133 黏性末端修飾成平末端黏性末端修飾成平末端后再連接后再連接 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 20 DN

15、A片段末端同聚物加尾后連接片段末端同聚物加尾后連接 3突出末端突出末端 GCATG3 C 5 5 C 3GTACG TdT dCTP TdT dGTP GCATGCCCCCC3 C 5 5 C 3CCCCCCGTACG 退火退火 Klenow T4DNA ligase PstI SphICTGCA 3 G G 3 ACGTC 5 5 CTGCAGGGGGG 3 G G 3 GGGGGGACGTC 5 5 CTGCAGGGGGG G G GGGGGGACGTC 5 5 GCATGCCCCCC C 5 5 C CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG G G GGGGGGACGTC 5 5

16、GCATGCCCCCC C 5 5 C CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG GACGT TGCAG GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC CGTAC 5 5 CATGC CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG GACGT TGCAG GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC CGTAC 5 5 CATGC CCCCCCGTACG PstI酶切位點酶切位點 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 21 黏性末端修飾成平末端后再連接黏性末端修飾成平末端后再連接 G CTTAA 5 5 AATTC G EcoRIBamHI GAATT CTTAA 5 5 AATTC

17、 TTAAG Klenow 補平補平Klenow 補平補平 GAATTGGGGGG CTTAA 5 5 AATTC GGGGGGTTAAG TdT dGTP G CCTAG GATCC G 5 5 GGATC CCTAG GATCC CTAGG 5 5 GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG 5 5 TdT dCTP T4DNA ligase GAATTGGGGGG CTTAA 5 5 AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG GAATTGGGGGG CTTAA 5 5 AATTC GGGGGGT

18、TAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG BamHI酶酶 切位點切位點 5突出末端突出末端 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 22 2.5.6 加上連桿后再連接加上連桿后再連接(P133) 如果重組體如果重組體DNA是用平末端連接或是用同聚物是用平末端連接或是用同聚物 加尾構(gòu)建的，那么很可能無法用原來的限制酶加尾構(gòu)建的，那么很可能無法用原來的限制酶 作特異的切割，因此也不能獲得插入作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。片段。 為了解決這個問題，可采用連桿法提供必要的為了解決這個問題，可采用連桿法提供必要的 序列，進行序列，進行DNA分子的連接。

19、分子的連接。 所謂所謂連桿連桿(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一，是指用化學(xué)方法合成的一 段由段由1012個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個 限制酶識別位點的寡核苷酸片段。限制酶識別位點的寡核苷酸片段。 DNA片段末端加上化學(xué)合成的連桿，能形成黏片段末端加上化學(xué)合成的連桿，能形成黏 性末端，連接后可用內(nèi)切酶進行切割。性末端，連接后可用內(nèi)切酶進行切割。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 23 連桿的連桿的5-末端和待克隆的末端和待克隆的DNA片段片段5- 末端，用末端，用多核苷酸激酶多核苷酸激酶處理使之磷酸處理使之磷酸 化，然后再通過化，然后再通過T4DNA連

20、接酶的作用連接酶的作用 使兩者連接起來。接著用適當(dāng)?shù)南拗剖箖烧哌B接起來。接著用適當(dāng)?shù)南拗?酶消化具有連桿的酶消化具有連桿的DNA分子和克隆載分子和克隆載 體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出 了彼此互補的黏性末端。于是便可以了彼此互補的黏性末端。于是便可以 按照常規(guī)的黏性末端連接法，將待克按照常規(guī)的黏性末端連接法，將待克 隆的隆的DNA片段同載體分子連接起來。片段同載體分子連接起來。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 24 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 25 DNA連桿連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，連桿連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性， 但也有一個明顯的缺點

21、，那就是如果待克隆但也有一個明顯的缺點，那就是如果待克隆 的的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的 連桿相同的限制位點，這樣在酶切消化連桿連桿相同的限制位點，這樣在酶切消化連桿 產(chǎn)生黏性末端的同時，也就會把克隆基因切產(chǎn)生黏性末端的同時，也就會把克隆基因切 成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它 操作造成麻煩。操作造成麻煩。 當(dāng)然，在遇到這種情況時，一個方法可改用當(dāng)然，在遇到這種情況時，一個方法可改用 其它類型的連桿，另一種公認(rèn)的較好的替代其它類型的連桿，另一種公認(rèn)的較好的替代 辦法是改用辦法是改用DNA接頭接頭(adapt

22、er)連接法。連接法。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 26 2.5.7 DNA接頭接頭(adapter)連接法連接法 (P134) 于于1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞年由康乃爾大學(xué)吳瑞 教授發(fā)明的。它是一類由人教授發(fā)明的。它是一類由人 工合成的工合成的一頭具有某種限制一頭具有某種限制 性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為 平末端平末端的特殊的雙鏈寡核苷的特殊的雙鏈寡核苷 酸片段。當(dāng)它的平末端與平酸片段。當(dāng)它的平末端與平 末端的外源末端的外源DNA片段連接之片段連接之 后，便會使后者成為具黏性后，便會使后者成為具黏性 末端的新的末端的新的DNA分子，而易分子，而易 于連接重組。于

23、連接重組。 吳瑞（吳瑞（1928-2008） 2008年年2月月10日，吳瑞教授在康奈爾大學(xué)去世。日，吳瑞教授在康奈爾大學(xué)去世。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 27 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 28 2008年年3月月14日出版的日出版的science以以“橋橋”為題，撰文紀(jì)念吳瑞教授。為題，撰文紀(jì)念吳瑞教授。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 29 吳瑞創(chuàng)建了中美生物化學(xué)聯(lián)合招生項目（吳瑞創(chuàng)建了中美生物化學(xué)聯(lián)合招生項目（CUSBEA），），1982年至年至1989年間，該項年間，該項 目共招收了目共招收了400余位頂尖的中國學(xué)生來美學(xué)習(xí)研究生課程。余位頂尖的中國學(xué)生來美學(xué)習(xí)研究生課程。 科學(xué)網(wǎng)專題：深切緬懷吳瑞教授科學(xué)網(wǎng)專題：深切緬懷吳瑞教授http:/=114 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 30 小結(jié)：平末端小結(jié)：平末端DNA片段的連接片段的連接 （1）直接直接用用T4DNA連接酶連接；連接酶連接； （2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端 DNA分子加上分子加上同聚物尾巴同聚物尾巴之后再用之后再用DNA連連 接酶進行連接；接酶進行連接； （3）用）用連桿連桿連接平末端連接平末端DNA分子；分子； （4）DNA接頭接頭連接法。連接法。 工學(xué)基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)2DNA連接 酶 31 PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連