HA-1樹突狀細(xì)胞核酸疫苗的構(gòu)建及其特異性CTL的誘導(dǎo)(一).doc

1、HA-1 樹突狀細(xì)胞核酸疫苗的構(gòu)建及其特異性CTL的誘導(dǎo) (一)作者：汪涯雅，張東華，劉文勵(lì)，周紅升，張路，戴敏，黃振倩，譚獲熊平【摘要】本研究以次要組織相容性抗原HA-1 為靶點(diǎn)，構(gòu)建HA-1 樹突狀細(xì)胞核酸疫苗用于造血干細(xì)胞移植后抗白血病治療。體外培養(yǎng)移植供者樹突狀細(xì)胞， 用流式細(xì)胞術(shù)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其免疫活性，通過電轉(zhuǎn)法將HA-1 基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，構(gòu)建樹突狀細(xì)胞核酸疫苗。48 小時(shí)后檢測(cè) HA-1 蛋白表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染后的樹突狀細(xì)胞與同基因淋巴細(xì)胞共孵育誘導(dǎo)特異性CTL，應(yīng)用 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其體外殺傷活性。結(jié)果表明：經(jīng)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞表達(dá)樹突狀細(xì)胞表型，能刺激

2、同種淋巴細(xì)胞增殖。 電轉(zhuǎn) 48 小時(shí)后，Westernblot 可檢測(cè)到 HA-1蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)的CTL 體外殺傷活性高于對(duì)照組。結(jié)論：次要組織相容性抗原 HA-1 可作為造血干細(xì)胞移植后抗白血病治療的靶點(diǎn)?！娟P(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞； HA-1 基因 ;樹突狀細(xì)胞核酸疫苗 ;造血干細(xì)胞移植;細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞ConstructionofHA-1-DCNucleic-acidVaccineandInductionofSpecificCytotoxicTLymphocytesAbstractThepurposeofthisstudywastoconstructaHA-1-DCnucleicacid

3、vaccineandtoinduceanti-leukemiaeffectafterhematopoieticstemcelltransplantation(HSCT).Thedendriticcells(DCs)weregeneratedfromHSCTdonorsinvitro,anditsimmunologicactivitywasstudiedbyusingflowcytometryandmixlymphocytereaction.HA-1genewaselectroporatedintotheculturedDCstoconstructaDC nucleicacidvaccine.A

4、ftertransfectingfor48hours,theexpressionofHA-1protei nwasdetectedbyWesternblot.TheDCswereculturedwithisogeniclymphocyte stoinducespecificcytotoxicTlymphocytes(CTLs).ThecytotoxicityoftheCTLswa sdetectedbyLDHassay.TheresultsshowedthattheDCsderivedfromperipheral bloodmonocytes(PBMCs)expressedtheDCpheno

5、type,andwereeffectiveinsti mulatingproliferationoftheallogeniclymphocytes.Afterelectroporatingfor48 hours,HA-1proteinwasdetectedbyWesternblot.ThecytotoxityofinducingCTL swashigherthanthatinthecontrolgroup.Itisconcludedthattheminorhistocom patibilityantigenHA-1canbeconsideredasatargetofimmunotherapya

6、gainstle ukemiaafterHSCT.Keywordsdendriticcell；HA-1gene；DCnucleicacidvaccine ；hematopoieticstemcelltransplantation ；cytotoxicTlymphocyte樹突狀細(xì)胞（ dendriticcell,DC）是目前體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞（ antigenpresentingcell,APC），它們能高效攝取、處理抗原，并將多肽呈遞給靜息型T 細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，因而成為腫瘤免疫治療中重要的運(yùn)載工具。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將編碼腫瘤表面的抗原基因?qū)隓C 構(gòu)建相應(yīng)的核酸疫苗，是

7、近來(lái)腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)1，2。異基因造血干細(xì)胞移植（ allogeneichemato-poieticstemcelltransplantation,allo-HSCT）是治療白血病最有效的方法，但移植后移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)和復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響了病人的存活率。如何增強(qiáng)移植物抗白血病（graftversusleukemia,GVL）效應(yīng)，減少?gòu)?fù)發(fā)同時(shí)又不誘發(fā) GVHD，是移植成功的關(guān)鍵。 限制性表達(dá)于造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞表面的次要組織相容性抗原（ minorhistocompatibilityantigens,mHags）在分離 GVL和 GVHD

8、中起重要的作用 3。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 HA-1 基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染DC，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（ cytotoxicTlymphocytes,CTLs），發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。材料和方法材料人重組 IL-4和 GM-CSF均購(gòu)自 Peprotech 公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠， RPMI1640、絲裂霉素C、MTT 均為 Sigma 公司產(chǎn)品，胎牛血清（FCS）購(gòu)自杭州四季清公司。 PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD80和 CD14、FITC標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體 CD83和 CD86及同型對(duì)照均購(gòu)自 eBioscience 公司。 Xba和 BamH限制性內(nèi)切酶、 1kbD

9、NAMarker購(gòu)自 MBI 公司。膠回收、質(zhì)粒小提、大提試劑盒均購(gòu)自上海華舜公司。T4DNA 連接酶為 Promega 公司產(chǎn)品?？?his 單克隆抗體購(gòu)自 Novagen 公司。人 IL-2 購(gòu)自北京四環(huán)生物制品廠。 pcDNA3.1/hisA 和 pEGFP-C1由我院婦科腫瘤中心陳剛博士惠贈(zèng)， pcDNA3.1-HA-1由荷蘭勒登 (Leiden)大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 中 心Dr.Prof.E.A.J.M.Goulmy 惠 贈(zèng) 。 流 式 細(xì) 胞 儀（BectonDickinson公司產(chǎn)品），電轉(zhuǎn)儀（ ECM2001BTX公司產(chǎn)品），電轉(zhuǎn)杯（ 8mmgap,GTS公司產(chǎn)品），酶標(biāo)儀（ Bio

10、tech 公司產(chǎn)品）。方法DC 體外培養(yǎng)取HA-1 陰性表達(dá)的移植供者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞， PBS液洗滌 3 次，用 RPMI1640 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按 5106/ml接種于 6 孔板中，每孔 2ml ，置 37、 5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 小時(shí)，輕輕吹打去除懸浮細(xì)胞，即獲得貼壁的外周血單核細(xì)胞（PBMC），每孔加入 2ml 含 10FCS的 RPMI1640培養(yǎng)液，加入細(xì)胞因子 rhGM-CSF100ng/ml及 rhIL-440ng/ml。隔天半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子。于培養(yǎng)第 7 天收集懸浮細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析表型 DC 懸液用 PBS 液洗滌 2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度

11、為1 106/ml，加入 Eppendorf 管，每管 100l，再分別加入 PE標(biāo)記的 CD80、CD14及 FITC標(biāo)記的 CD83、CD86，4避光孵育 30 分鐘，PBS液洗滌，1多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)分離健康人外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞即同種異體淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞（ DC及同基因的 PBMC）用完全培養(yǎng)液調(diào)整濃度為 1106/ml，加入終濃度 25g/ml 的絲裂霉素 C，37孵育 30 分鐘， PBS液洗滌 3 次，用含 8FCS的 RPMI1640培養(yǎng)液懸浮調(diào)整濃度， 分別以 1103/孔、 5 103/

12、孔和 1 104/孔加入 96 孔板中，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，每孔再加入1 105反應(yīng)細(xì)胞，終體積為200l，以未加刺激細(xì)胞的淋巴細(xì)胞為陰性對(duì)照。 37、5CO2培養(yǎng) 72 小時(shí)，每孔加入 20lMTT(5mg/ml)，避光37溫箱中孵育4 小時(shí)，離心去上清，每孔加入200 lDMSO,取波長(zhǎng)570nm 檢測(cè) A570 值。結(jié)果用 3 孔均值表示。刺激指數(shù)（ SI）=加刺激細(xì)胞孔的 A570 值/ 陰性對(duì)照孔的 A570 值。重組人 HA-1 質(zhì)粒的構(gòu)建用 XbaI 和 BamHI限制性內(nèi)切酶從 pcDNA3.1-HA-1 中切下 358bpHA-1 的 cDNA，其中包括 T 細(xì)胞決定簇VLHDDLLEA，經(jīng) T4DNA連接酶插入 pcDNA3.1/hisA 的多克隆位點(diǎn)中， 經(jīng)過酶切和測(cè)序確定重組是否準(zhǔn)確，命名為 pcDNA3.1/hisA-HA-1。轉(zhuǎn)染 DC收集培養(yǎng) 7 天的 DC，用 RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，電轉(zhuǎn)緩沖液（按Eppendorf 公司提供的緩沖液配方配置， 保證細(xì)胞在其中孵育30 分鐘，存活率在 90以上）重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為 1106/ml，加入重組質(zhì)粒，終濃度為 20g/ml。電轉(zhuǎn)條件為：常溫，電壓 450V，80 微秒，脈沖 1次。在 30 分鐘內(nèi)完成，加入完全培養(yǎng)液，置于溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 24-72 小時(shí)。同時(shí)用 pEGFP-