E-鈣粘素在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系(一).doc

1、E-鈣粘素在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系(一)作者 :張翼飛姜立新鄭海濤【摘要】目的檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中E-鈣粘素的表達(dá)及其淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移,探討兩者間的關(guān)系。方法以CK20mRNA為標(biāo)記物 ,應(yīng)用 RT-PCR對(duì) 60 例結(jié)直腸癌根治性手術(shù)切除的淋巴結(jié)標(biāo)本共782 例進(jìn)行檢測(cè) ;免疫組化法(SP 法)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及正常對(duì)照組中E-鈣粘素的表達(dá)。通過(guò)二者的綜合分析,試圖發(fā)現(xiàn)抑癌基因E-鈣粘素在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為中的作用。結(jié)果CK20 法檢出 45例(75.0%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ,陽(yáng)性淋巴結(jié)總數(shù)為 436 個(gè)(55.8%);常規(guī)病理學(xué)檢出 34

2、例(56.7%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ,檢出陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)為 356 個(gè)(45.5%);兩組比較 ,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 2=16.72,P0.05)。11 例檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者癌組織中6 例(54.5%)E-Cadherin表達(dá)陰性 ,而 15 例未檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移癌組織中僅有1 例(6.67%)表達(dá)陰性 ,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 2=4.160,P=0.041)。結(jié)論 E-Cadherin的表達(dá)減弱或消失參與了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生?！娟P(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌 ;E-鈣粘素 ;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)【Abstract】ObjectivePurposeTodetecttheexpr

3、essionofE-cadherinincolorectalcarcinomaandlymphnodemicrometastases,andinvestigatetheirrelationship.Methods82casesoflymphnodesimplewasdectectedwithRT-PCRmethodusingCK20mRNAacridiniumester.inscreeningcolorectalcarcinomalymphnodemicrometastases.E-Cadherinexpressionanalysedbyimmuno-histochemicalstaining

4、(theSPmethod)incolorectalcancertissue,tissuenearbycancer,thenormalcontroltissue.ResultsIn60casesofcolorectalcarcinoma,theexpressionofE-Cadherinwas71.67%.Numberofpositivenodeswas55.8%,theexpressionofE-cadherinwas56.7%(34cases)andnumberofpositivenodeswas45.5%(356cases)throughroutinepathologicalexamina

5、tion.ThelowlevelexpressionofE-CadherinwaspositivelycorrelatedwiththeDukesstaging,serosainfiltration,lymphnodeandlivermetastasisofcolorectalcarcinoma( 2=16.72,P0.05).TheexpressionofE-Cadherinwasnegativein6ofthe11patientswithlymphnodemicrometastases,andin6.67%1ofthe15patientswithoutlymph nodemicrometa

6、stases( 2=4.160,P=0.041).ConclusionThenegativeexpressionofE-Cadherinmaycontributetolymphnodemicrometastasesincolorectalcarcinoma.【Keywords】colorectalcarcinoma;E-Cadherin;Lymphaticmetastasis;Rt-pcr結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。每年有10%的惡性腫瘤患者死于結(jié)直腸癌 1,2。術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的最主要因素之一。在實(shí)施了根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌患者中,仍有 20%50%的患者死于術(shù)后腫瘤的

7、局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移3,4,有研究認(rèn)為該現(xiàn)象與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。 E-Cadherin粘附分子介導(dǎo)細(xì)胞粘附的紊亂涉及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。E-Cadherin表達(dá)或功能的喪失與癌細(xì)胞喪失分化和較高的侵襲能力有關(guān)。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)E-Cadherin 粘附分子在結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá) ,以 CK20為靶目標(biāo) ,應(yīng)用 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的微小轉(zhuǎn)移 ,以探討結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)與臨床分期、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。探討結(jié)直腸癌組織中E-Cadherin 的表達(dá)及其與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系,試圖對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移做出預(yù)測(cè)和早期診斷,為臨床治療提供依據(jù)和手段。1 實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1 實(shí)驗(yàn)

8、材料1.1.1 病例與標(biāo)本收集我院20052007 年散發(fā)性結(jié)直腸癌根治術(shù)后標(biāo)本60 例,其中男 32 例,女 28 例;年齡 2879,平均 58.4 歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療 ;剔除遺傳性非息肉病性散發(fā)性結(jié)直腸癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度 :高分化 23 例,中分化 21 例,低分化 16 例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 34 例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 26 例;TNM 分期 I 期 6 例,II 期 26 例,III 期 22 例,IV期 6 例。術(shù)中采集散發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤周圍腫大淋巴結(jié)共782 個(gè),剖開(kāi) ,一半行常規(guī)術(shù)后病理 ,另一半保存于 -80冰箱備用。選擇遠(yuǎn)癌“正?！贝竽c黏膜組織 (距癌灶

9、 4cm)和癌旁 (距癌灶 2cm)大腸黏膜組織各10例作為對(duì)照觀察。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林液固定 ,常規(guī)石蠟包埋。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者本人均簽署知情同意書(shū)。1.1.2 試劑鼠抗人 E-Cadherin單克隆抗體和 S-P試劑盒 (Zymed 公司 )。 TRIzolReagent(Invitrogen 公司 ),TAKARAAMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara 公司 ),TAKARALATaq(Takara公司 ),PCR 試劑 (Takara 公司 ),DNA 分子量Marker(晶美公司 )。1.2 方法1.2.1 總 RNA 的抽提采用標(biāo)準(zhǔn) TRIzol法(參照說(shuō)明書(shū)

10、 )提取術(shù)后淋巴結(jié)標(biāo)本的總 RNA,凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè) RNA濃度和純度。1.2.2cDNA制備總RNA樣品1 l, 依次加入mmol/LdNTP1 l,RNaseInhibitor0.25 l,AMVReverseTranscriptase0。總.5l反應(yīng)混合物于30反應(yīng)10min,42反應(yīng)30min,99反應(yīng)5min,5反應(yīng)5min。1.2.3 引物的合成在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找編碼人類基因 CK20的核酸序列 , 其 登 錄 號(hào) 為 NM_019010, 該 序 列 長(zhǎng) 1817bp, 編 碼 序 列CDS(CodingSequence)位于 43-1317bp 間。以此序列為基礎(chǔ)

11、 ,在 CDS區(qū)內(nèi)設(shè) 計(jì)引 物 。 上游 引物 5-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC3下游- 引物5-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT3擴(kuò)增-片段為 449bp 大小 ,引物由上海英俊公司合成。1.2.4PCR反應(yīng)和分析采用RT-PCR方法 ,以人結(jié)直腸癌淋巴結(jié)cDNA 為模版 . 反 應(yīng) 體 系 為 50l:cDNA 模 版 1l,10 LAPCR緩 沖 液5 l,25mmol/LMgCl25 l,20pmol/ 上l游 和 下 游引 物 各1 l,10mmol/LdNTPMixture2 l,LATag酶0.5 補(bǔ)l,去離子水至50l。PCR反應(yīng)條件 :94 預(yù)

12、變性 3min;94 變性 30s,58.5 退火30s,72 延伸1min,30 個(gè)循環(huán) ;72再延伸 5min。反應(yīng)完畢后進(jìn)行電泳分析。1.2.5 結(jié)直腸癌組織切片厚4 m,0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù),S-P免疫組化染色。染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 ,DAB 顯色 ,蘇木精復(fù)染胞核。 PBS代替第 1 抗體作陰性對(duì)照。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法資料的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS13.0軟件包中進(jìn)行 ,數(shù)值變量以均數(shù) (95%可信區(qū)間 )表示 ,計(jì)數(shù)資料用率來(lái)表示 ,兩組間率的比較采用2檢驗(yàn)法。并采用診斷性實(shí)驗(yàn)分析方法計(jì)算CK20與傳統(tǒng)病理切片技術(shù)診斷結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度。實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果 :圖 AE-Cadherin在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá) 40 圖 BE-Cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 402 結(jié)果2.160 例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的782 個(gè)受檢淋巴結(jié)經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查,34 例(56.7%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ,陽(yáng)性淋巴結(jié)總數(shù)為 356 個(gè)(45.5%)。而采用 RT-PCR法檢測(cè) CK20mRNA的表達(dá)情況來(lái)判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,結(jié)果顯示,45 例(75.0%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 ,較病理學(xué)檢查結(jié)果新增 11 例,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 2=4.483,P=0.034)。陽(yáng)性淋巴結(jié)總數(shù)為 436 個(gè)(55.8%),較病理學(xué)檢查結(jié)果新增 80 個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 2=16.371,P0.001)。2.2E-Cadherin 表達(dá)與結(jié)