雙熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)及海腎類對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體_1

1、雙熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)及海腎類對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體雙熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)及海腎類對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體document number：nocg-yunoo-buytt-uu986-1986ut 雙熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)及海腎類對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體 1.什么是雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)（dlr）dlr測(cè)試系統(tǒng)靈敏，方便，在一個(gè)系統(tǒng)中用于測(cè)量?jī)蓚€(gè)單獨(dú)的熒光素酶報(bào)告基因，螢火蟲(chóng)熒光素酶及海洋海腎熒光素酶(renilla reniformis)，dlr測(cè)試系統(tǒng)可用于細(xì)胞裂解物及無(wú)細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)。2.有哪些海腎熒光素酶載體海腎熒光素酶載體prl用于在轉(zhuǎn)染的哺乳細(xì)胞中組成性地表達(dá)海腎熒光素酶。這類載體還有t7啟動(dòng)子，可用t7rna聚

2、合物在體外合成海腎熒光素酶，有4個(gè)不同的載體：a prl-sv40載體prl-sv40載體含sv40增強(qiáng)子及早期啟動(dòng)子區(qū)域，可在多種細(xì)胞中組成性地高表達(dá)海腎熒光素酶。prl-sv40載體還含有sv40的復(fù)制起始區(qū)，可在表達(dá)sv40大t抗原的細(xì)胞中，如cos-1，cos-7細(xì)胞中，瞬時(shí)及附加體似地復(fù)制。b prl-cmv載體prl-cmv載體含有cmv極早增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，可在多種細(xì)胞中組成性地高表達(dá)海腎熒光素酶。 a prl-tk載體prl-tk載體含hsv胞嘧啶激酶啟動(dòng)子區(qū)域，在多種細(xì)胞中組成性地弱表達(dá)海腎熒光素酶。b prl-null載體prl-null載體缺真核啟動(dòng)子及增強(qiáng)子，在海腎熒光素

3、酶基因的上游含有多克隆位點(diǎn)。3.用雙報(bào)告基因有何優(yōu)點(diǎn)一般地說(shuō)，實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件下基因的表達(dá)，而另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，以提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因測(cè)試的歸一化。將實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的活力與內(nèi)對(duì)照?qǐng)?bào)告基因的活力作歸一化可消除實(shí)驗(yàn)中不同測(cè)試間所固有的變化，這些變化減弱實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，其中包括培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目及活力的差異，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及裂解的效率。海腎熒光素酶可用作對(duì)照?qǐng)?bào)告基因及實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因。在雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試中，將螢火蟲(chóng)熒光素酶作為實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因，海腎熒光素酶作為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因。4.相比用cat或-半乳糖苷酶對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)作歸一化，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)有何優(yōu)點(diǎn) 用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試（dlr）有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)

4、： ?快速?dlr測(cè)試不需保溫或?qū)悠纷黝A(yù)處理。用被動(dòng)裂解液將共轉(zhuǎn)染有螢火蟲(chóng)及海腎熒光素酶基因的細(xì)胞裂解，制備細(xì)胞抽提物。加入stop&glo試劑后，可同時(shí)湮滅螢火蟲(chóng)熒光素酶活力并激活海腎熒光素酶發(fā)光，需立即測(cè)試海腎熒光素酶活性。在幾秒鐘內(nèi)可完成熒光素酶測(cè)試實(shí)驗(yàn)并作定量測(cè)試。而其他一些如cat及-gal的報(bào)告基因系統(tǒng)在定量前需要長(zhǎng)時(shí)間的保溫。?靈敏度?螢火蟲(chóng)及海腎熒光素酶的測(cè)試線性范圍，是酶濃度的7個(gè)對(duì)數(shù)。其他報(bào)告基因的靈敏度及線性應(yīng)答受限。通常不存在內(nèi)源熒光素酶使背景活力低。?方便?在單管中完成測(cè)試，不需拆分樣品，可用被動(dòng)裂解液將培養(yǎng)在96孔板中的細(xì)胞快速裂解。5.海腎熒光素酶與螢火蟲(chóng)熒光素

5、酶相比的相對(duì)活性如何在atp，鎂，及氧存在時(shí)，螢火蟲(chóng)熒光素酶作用于甲蟲(chóng)熒光素，而來(lái)源于海洋腔腸（renilla reniformis）的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。6.將兩個(gè)報(bào)告基因載體作共轉(zhuǎn)染應(yīng)用什么條件當(dāng)用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)來(lái)測(cè)量等重量的螢火蟲(chóng)熒光素酶及海腎熒光素酶時(shí)，可觀察到它們釋放的光幾乎相等。螢火蟲(chóng)熒光素酶的分子量為61kd，而海腎熒光素酶的分子量為36kd，當(dāng)測(cè)試等重量的兩個(gè)酶時(shí)，所測(cè)的海腎熒光素酶分子實(shí)際多69%。如以每摩爾為基礎(chǔ)，據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑測(cè)試的螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光強(qiáng)度比海腎熒光素酶強(qiáng)大約53%。共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒所含啟動(dòng)子間的反式效應(yīng)有可能

6、會(huì)影響到報(bào)告基因的表達(dá)。當(dāng)對(duì)照或?qū)嶒?yàn)報(bào)告基因載體含有很強(qiáng)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，需要特別加以注意。載體prl上的tk，sv40，cmv調(diào)節(jié)因子據(jù)報(bào)道可在大多數(shù)哺乳類細(xì)胞中表達(dá)，但它們?cè)诓煌?xì)胞中的表達(dá)水平不同。載體prl-tk中hsv胞嘧啶激酶啟動(dòng)子相對(duì)較弱，使海腎熒光素酶的組成性表達(dá)成低到中度水平。早sv40極早cmv的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平高，當(dāng)實(shí)驗(yàn)載體所具有的調(diào)節(jié)因子較強(qiáng)時(shí)，這類啟動(dòng)子不太適用于雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。 為使實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因及對(duì)照?qǐng)?bào)告基因的基因表達(dá)相對(duì)獨(dú)立，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)轉(zhuǎn)染混和液中載體dna的量及共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因載體的比例需作優(yōu)化?？刹捎脤?shí)驗(yàn)載體與共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因載體的組成比在10：1到50：

7、1或更大的范圍，這有利于抑制啟動(dòng)子間的交互作用。有時(shí)為有利于實(shí)驗(yàn)，共轉(zhuǎn)染混和液中的實(shí)驗(yàn)載體應(yīng)選擇為少量部分。 7.需用熒光測(cè)試儀對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)的熒光素酶作測(cè)定嗎作dlr測(cè)試時(shí)應(yīng)使用熒光測(cè)試儀。液閃儀的靈敏度相比太低，不易獲得可重復(fù)的結(jié)果。8.作熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試時(shí)，如何使用單或雙加樣的熒光測(cè)試儀對(duì)于單加樣的熒光測(cè)試儀，在管子中預(yù)先加入熒光素酶測(cè)試試劑ii，再加入細(xì)胞裂解物并測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活力，接下來(lái)，用熒光測(cè)試儀上的加樣管加入stop&glo試劑，并測(cè)海腎熒光素酶的活力。對(duì)于雙加樣的熒光測(cè)試儀，在管子中加入細(xì)胞裂解物后，放入熒光測(cè)試儀中，從加樣管i中加入熒光素酶測(cè)試試劑ii

8、并測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活力，從加樣管ii中加入stop&glo試劑，并測(cè)海腎熒光素酶的活力。需對(duì)背景作預(yù)測(cè)試的熒光測(cè)試儀需關(guān)閉這一功能。9.如何從熒光測(cè)試儀中清理stop&glo試劑stop&glo試劑中的一個(gè)熒光素酶湮滅成份對(duì)塑料物質(zhì)有一定的親和力。這一組份對(duì)于自動(dòng)加樣管的塑料管及吸管的內(nèi)壁有可逆結(jié)合。接觸過(guò)stop&glo試劑的加樣管如沒(méi)充分清洗，會(huì)將殘留的湮滅試劑遺漏到隨后通過(guò)加樣管的溶液中。如這樣的情況發(fā)生，則非常少量的污染湮滅試劑就會(huì)極大地抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的活力。因此在使用螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)試中，如要用自動(dòng)法加樣larii，則需對(duì)已接觸stop&glo試劑的加樣管作充分的清洗。如熒光測(cè)

9、試儀有兩個(gè)加樣管，則要將每個(gè)管子固定加樣一種溶液。在完成一次實(shí)驗(yàn)后必須徹底清洗，請(qǐng)按下面的步驟清洗管子并維修儀器。普通加樣管清洗步驟：1，用3倍于吸管箱體積的去離子水反復(fù)清洗加樣管子以除去stop&glo試劑。2，準(zhǔn)備70%的乙醇作為清洗試劑，用5ml70%的乙醇將箱及加樣管完全清洗，可將加樣管浸泡在這一溶液30分鐘后，再用去離子水清洗。 3，注意：構(gòu)造加樣管子的材料有很大差異，有的吸管浸泡清洗試劑的時(shí)間需超過(guò)30分鐘。配有teflon管子的熒光測(cè)試儀不會(huì)有太大問(wèn)題，而其他如tygon浸泡清洗試劑的時(shí)間需超過(guò)12-16小時(shí)（過(guò)夜）以完全除去stop&glo試劑。 4，用3倍于吸管箱體積的去離子

10、水反復(fù)清洗加樣管子以除去乙醇。turner designs td 20/20熒光測(cè)試儀中加樣管的清洗: td 20/20熒光測(cè)試儀需5次預(yù)循環(huán)以100%地將加樣吸管中的溶液完全清除，然后按下列方法清除殘留的stop&glo試劑：1.用去離子水清洗吸管10次，清除殘留的stop&glo試劑。2.再用70%乙醇清洗10次，并用清洗液將管子浸泡30分鐘。3.再用去離子水清洗10次，清除殘留的乙醇。10.如何保存stop&glo試劑將一定體積的stop&glo試劑保存在玻璃管及硅化的聚丙烯管子中，放在-70o c。在未作處理的塑料管中，這一試劑不穩(wěn)定。stop&glo底物儲(chǔ)存液的保存條件已作改變！19

11、99二月。stop&glo底物溶于stop&glo底物試劑中，所得50貯液在-20o c會(huì)沉淀。當(dāng)沉淀發(fā)生時(shí)，50貯液的顏色會(huì)改變，如用于測(cè)定海腎熒光素酶，則酶活力會(huì)降低。最好新鮮配制50貯液，并立即使用，如需保存，則將50貯液保存-70o c達(dá)4周，活力不會(huì)改變。12.被動(dòng)裂解液與報(bào)告基因裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑有何差別這三種裂解液能同雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)（dlr）一同使用嗎被動(dòng)裂解液經(jīng)特別配方以最有效地減小海腎熒光素酶底物海腎熒光素的自發(fā)熒光水平。兩個(gè)熒光素酶在被動(dòng)裂解液中，室溫可保存6小時(shí)。報(bào)告基因裂解液原則上可用于制備細(xì)胞裂解物，并用于dlr測(cè)試，但實(shí)際上這不可行，因較被動(dòng)裂解液會(huì)導(dǎo)致高一些的海腎熒光素的自發(fā)熒光水平。細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑的海腎熒光素的自發(fā)熒光水平很高，不能被采用于制備dlr測(cè)試系統(tǒng)的細(xì)胞裂解物。13.被動(dòng)裂解液能裂解培養(yǎng)的植物細(xì)胞嗎它能裂解哺乳動(dòng)物組織所得的初級(jí)細(xì)胞嗎 被動(dòng)裂解液不能裂解植物細(xì)胞。它能裂解一些類型的哺乳初級(jí)細(xì)胞。一種細(xì)胞能否被它裂解需作測(cè)試。 14.加入stop&glo試劑后，還殘留有螢火蟲(chóng)熒光素酶活性嗎螢火蟲(chóng)熒光素酶能立即被stop&glo試劑湮滅，殘留有螢火蟲(chóng)熒光素酶活性低于%。15.熒光素酶測(cè)試試劑ii是否是熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)的同一試劑熒光素酶測(cè)試試