熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

1、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)原則熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細(xì)胞中的熒光素酶，用其底物來檢測(cè)熒光素酶活性。檢測(cè)步驟如下：1)加裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。2)將上述裂解物轉(zhuǎn)移入微孔板或者試管中（根據(jù)檢測(cè)的需要選擇所用器材類型）。3)加入含有所有酶反應(yīng)成分（必須包括底物熒光素），使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)開始。4)用熒光儀或者液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)所發(fā)射的熒光。特點(diǎn)敏感度和檢測(cè)范圍：5 fg熒光素酶發(fā)射光的線性范圍：10 fg10 ng確切的檢測(cè)限依檢測(cè)儀器而定。特異性：本文介紹的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的操作步驟，通常用來檢測(cè)轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的活性。不適

2、用于對(duì)細(xì)菌熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)。器材和試劑器材在微孔板或試管中，用自動(dòng)或手動(dòng)熒光儀、液閃計(jì)數(shù)儀或者攝影膠片都可以檢測(cè)到熒光素酶活性，而且高度敏感。當(dāng)用微孔板時(shí)可以是白色，也可為黑色。試劑1)熒光素酶檢測(cè)試劑：熒光素酶檢測(cè)試劑包括熒光素、atp、coa、以及一些添加劑，這些試劑可以啟動(dòng)酶反應(yīng)。這種熒光酶檢測(cè)試劑的混合物可穩(wěn)定保存在在-60以下12個(gè)月，-15- 25一個(gè)月，28只能保存一周。避免反復(fù)凍融。應(yīng)避光保存，因?yàn)闊晒馑卦诠庹障聲?huì)發(fā)生氧化。2)裂解緩沖液：下面將加以介紹?；静僮鞑襟E下面的操作步驟適用于培養(yǎng)的真核細(xì)胞。提取物必須立刻檢測(cè)，否則必須在-15-25儲(chǔ)存大約一個(gè)月。不要反復(fù)凍融以避免

3、酶活性的降低。1)將熒光素酶報(bào)告基因與-gal對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行處理。2)徹底吸去培養(yǎng)皿（60mm）中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（pbs，無鈣和鎂離子）小心沖洗細(xì)胞3次，徹底去除剩余的pbs。10pbs緩沖液：nacl 100g，kcl 2.5g，na2hpo414.4g，kh2po42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。3)加入最小體積的triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液蓋過細(xì)胞，例如60 mm的培養(yǎng)皿用360 l裂解液，35毫米的培養(yǎng)板用150 l裂解液。用橡皮刮將細(xì)胞刮離培養(yǎng)皿。將裂解物轉(zhuǎn)移到微量離心管中。triton/甘氨酰甘氨酸裂解緩沖液：1%（v/v）t

4、riton x-100，25mmol/l甘氨酰甘氨酸（ph7.8），15mmol/l mgso4，4mmol/l egta，1mmol/l dtt（臨用前加入）4)在漩渦混合器上輕輕振蕩細(xì)胞裂解液，以最大速度4離心以去除細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量離心管中，置于冰上以備分析。5)在開始化學(xué)發(fā)光反應(yīng)之前，將100 l的細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移到熒光儀或者液閃計(jì)數(shù)儀所用的檢測(cè)器皿中（我們建議用96孔板）。加入360 l熒光素酶分析緩沖液。熒光素酶分析緩沖液：25m mol/l甘氨酰甘氨酸（ph 7.8），15mmol/l mgso4，4mmol/l egta，2mmol/l atp，1mmol/ l d

5、tt（臨用前加入）6)用25mmol/l（ph7.8）的甘氨酰甘氨酸稀釋熒光素至200mol/l。熒光素貯液：1mmol/l d-熒光素（合成晶體蛋白，sigma），25mmol/l甘氨酰甘氨酸（ph 7.8），10mmol/l dtt。（分成1ml小份，-70保存在避光盒中幾個(gè)月）7)樣品中加入200 l稀釋的熒光素液。熒光素在光照下迅速發(fā)生氧化，因此丟棄未用完的熒光素稀釋液。在562nm條件下進(jìn)行檢測(cè)。注意事項(xiàng)：1)熒光素酶檢測(cè)試劑需在15-25的條件預(yù)平衡后再進(jìn)行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)用液閃計(jì)數(shù)儀時(shí)，加入熒光素酶檢測(cè)試劑后立即輕輕混勻。.加入熒光素酶檢測(cè)試劑0.5-

6、10秒內(nèi)開始檢測(cè)發(fā)射光1-5秒，持續(xù)發(fā)光20秒后，產(chǎn)生光強(qiáng)度降低，其半衰期為5分鐘。2)如果細(xì)胞裂解后不能立即對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)，樣品可以在冰上保存大約5個(gè)小時(shí)，在-70可保存數(shù)月。3)利用上述方法檢測(cè)冷的樣品時(shí)，其信號(hào)強(qiáng)度將下降5-15%。4)在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號(hào)超出線性范圍（信號(hào)溢出），可用裂解液將樣品進(jìn)行稀釋。5)我們建議不要儲(chǔ)存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入bsa至終濃度為2.5mg/ml，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6)如果樣品中的熒光素酶的活性較高，應(yīng)盡可能減少所用來檢測(cè)的樣品的體積。在這種情況下，按照標(biāo)準(zhǔn)操作，可以相應(yīng)減少所使用的熒光素酶檢測(cè)試劑（熒光素酶試劑體積/樣品體積=100l/20-50l），這樣對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。7)一些熒光儀在進(jìn)行檢測(cè)前需要1-2秒的穩(wěn)定，因此，我們建議在開機(jī)后過一段時(shí)間再進(jìn)行檢測(cè)操作。8)有一些熒光儀需要在不改變樣品體積的條件下加入更多的檢測(cè)試劑（如30