植物基因工程中的λ噬菌體載體

1、植物基因工程中的植物基因工程中的 噬菌體載體噬菌體載體 20132013年年6 6月月2929日日 載體（載體（vectorvector）是把一個(gè)有用的目的）是把一個(gè)有用的目的DNADNA片段通過(guò)片段通過(guò) 重組重組DNADNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的 工具。工具。 植物基因工程技術(shù)中尤為重要的植物基因工程技術(shù)中尤為重要的是載體，不同目的是載體，不同目的 基因需要采用不同的載體?；蛐枰捎貌煌妮d體。 組成植物組成植物基因工程載體系統(tǒng)常見(jiàn)的幾種載體有：基因工程載體系統(tǒng)常見(jiàn)的幾種載體有： 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒(cosmid(

2、cosmid) ) m13m13單鏈?zhǔn)删w。單鏈?zhǔn)删w。 噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋 體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因 數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實(shí)數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實(shí) 驗(yàn)系統(tǒng)。驗(yàn)系統(tǒng)。 噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易 感宿主菌體內(nèi)。感宿主菌體內(nèi)。 噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁 殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能 使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增，使攜帶的外源

3、基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增， 所以噬菌體被開(kāi)發(fā)成基因工程的有用載體。所以噬菌體被開(kāi)發(fā)成基因工程的有用載體。 噬菌體噬菌體(bacteriophage(bacteriophage，phage)phage)簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 噬菌體分類噬菌體分類 毒性噬菌體（毒性噬菌體（virulent phagevirulent phage） ：吸附、穿入、生物合成、成熟、：吸附、穿入、生物合成、成熟、 釋放釋放 溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phagetemperate phage） ：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源源性轉(zhuǎn)換性轉(zhuǎn)換 噬菌體噬菌體 溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感染溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)

4、：溶菌周期的具有感染 性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。 DNADNA重組技術(shù)一般需要重組技術(shù)一般需要噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。 目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有： 單鏈單鏈M13M13噬菌體載體；噬菌體載體； 噬菌體載體；噬菌體載體； P1P1噬菌體載體；噬菌體載體； 噬菌粒載體；噬菌粒載體； 等等。等等。 其中使用最多的是入噬菌體。其中使用最多的是入噬菌體。 噬菌體噬菌體 噬菌體是溫和噬菌體，屬長(zhǎng)尾噬菌體科，頭殼

5、為直徑約噬菌體是溫和噬菌體，屬長(zhǎng)尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm50nm的二的二 十面體，其內(nèi)包裹一長(zhǎng)線狀雙鏈?zhǔn)骟w，其內(nèi)包裹一長(zhǎng)線狀雙鏈DNADNA分子（分子（46500bp46500bp）。）。 左臂：從左臂：從A到到J長(zhǎng)約長(zhǎng)約 20kb，其中的基因編，其中的基因編 碼構(gòu)成頭部、尾部、碼構(gòu)成頭部、尾部、 尾絲對(duì)組裝完整噬菌尾絲對(duì)組裝完整噬菌 體所需要的蛋白質(zhì)。體所需要的蛋白質(zhì)。 中段：從中段：從J到到N長(zhǎng)約長(zhǎng)約 20kb，是，是DNA整合整合 和切出，溶原生長(zhǎng)所和切出，溶原生長(zhǎng)所 需的序列需的序列 ，但非溶菌但非溶菌 生長(zhǎng)所必需生長(zhǎng)所必需 右臂：長(zhǎng)約右臂：長(zhǎng)約10kb，控，控 制溶菌和溶原

6、生長(zhǎng)最重制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重 要的調(diào)控基因和序列、要的調(diào)控基因和序列、 以及以及DNA復(fù)制起始均復(fù)制起始均 在這區(qū)域內(nèi)。在這區(qū)域內(nèi)。 基因組長(zhǎng)約基因組長(zhǎng)約50kb 50kb ，至少包括，至少包括6161個(gè)基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似個(gè)基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似 性成簇排列。性成簇排列。左右臂包含左右臂包含DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生 長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必需的。長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必需的。 在在DNA雙鏈分子的兩個(gè)雙鏈分子的兩個(gè)5 端各有端

7、各有12個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ)個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ) 粘性末端，粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，當(dāng)且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，當(dāng)噬菌體噬菌體感染宿感染宿 主細(xì)胞后主細(xì)胞后，其，其DNA可迅速通過(guò)粘性末端配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀可迅速通過(guò)粘性末端配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀 DNA分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos 位點(diǎn)。位點(diǎn)。 cos位點(diǎn)位點(diǎn) （cohesive end site） 如果將左右臂和中段都去除，僅留下如果將左右臂和中段都去除，僅留下DNADNA而端包裝而端包裝 噬菌體所必需的噬菌體所必需的coscos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列

8、、 標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成coscos質(zhì)?；蚍Q為質(zhì)?；蚍Q為 粘粒的載體。粘?？刹迦胝沉５妮d體。粘粒可插入45kb45kb長(zhǎng)的外源長(zhǎng)的外源DNADNA，然后，然后 用用噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌 后，粘粒的后，粘粒的DNADNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克 隆。所以粘粒主要用于隆。所以粘粒主要用于DNADNA文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)的構(gòu)建。 當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后, 雙鏈DNA 分子通過(guò)cos 而成環(huán)狀。 在感染早期, 環(huán)狀DNA 分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間, 噬 菌體有兩條復(fù)

9、制途徑可供選擇: 一是裂解生長(zhǎng)。環(huán)狀 DNA 分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次, 合成了大量的 噬菌體基因產(chǎn)物, 形成子代噬菌體顆粒, 成熟后使細(xì) 菌裂解, 釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另 一是溶源性生長(zhǎng)。噬菌體DNA 整合進(jìn)宿主菌的基因 組,然后像細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制, 并傳 遞給下一代細(xì)菌。 由于噬菌體頭部包裝容量的限制，重組-DNA分子 大小只能在3952kb之間。 噬菌體的繁殖方式噬菌體的繁殖方式 在感染的細(xì)胞內(nèi)在感染的細(xì)胞內(nèi), , 噬菌體有兩條復(fù)制途徑噬菌體有兩條復(fù)制途徑: : 1 1、裂解生長(zhǎng)、裂解生長(zhǎng) 2 2、溶源性生長(zhǎng)、溶源性生長(zhǎng) DNADNA重組技術(shù)一般需要重組技

10、術(shù)一般需要噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。 噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建 構(gòu)建方式：構(gòu)建方式： 1 1、插入型。只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)，可便于外源、插入型。只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)，可便于外源 DNADNA插入，這種載體叫插入型載體（插入，這種載體叫插入型載體（insertion insertion vectorsvectors）。）。 2 2、置換型。含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間、置換型。含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間 的的DNADNA區(qū)段可以被外源區(qū)段可以被外源DNADNA片段所取代。這種載體片段所取代。這種載體 叫置換型載體（叫置換型載體（replacement vect

11、orsreplacement vectors）。）。 至今已用噬菌體開(kāi)發(fā)出許多插入型和置換型載體至今已用噬菌體開(kāi)發(fā)出許多插入型和置換型載體 插入型載體插入型載體: ZAP,ZAP, gt10,gt11: ZAP,ZAP, gt10,gt11等等 置換型載體置換型載體: GEM-11, GEM-12,EMBL3,EMBL4: GEM-11, GEM-12,EMBL3,EMBL4等等 構(gòu)建過(guò)程構(gòu)建過(guò)程 野生型野生型噬菌體噬菌體DNA必須經(jīng)過(guò)改造才能成為理想必須經(jīng)過(guò)改造才能成為理想 的載體，其構(gòu)建過(guò)程主要有：的載體，其構(gòu)建過(guò)程主要有：刪除基因組中非刪除基因組中非 必需區(qū)，建立外源必需區(qū)，建立外源DN

12、A片段的替換點(diǎn)，增加承載片段的替換點(diǎn)，增加承載 外源外源DNA片段的容量。片段的容量。在非必需區(qū)內(nèi)插入或替在非必需區(qū)內(nèi)插入或替 換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。建立重組建立重組 DNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受 體細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入體細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入 病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性， 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分分 子運(yùn)輸車子運(yùn)輸車”的基本機(jī)理。的基本機(jī)理。 噬菌體載體的應(yīng)用噬

13、菌體載體的應(yīng)用 一、建立一、建立cDNA文庫(kù)文庫(kù) 噬菌體載體系統(tǒng)是在噬菌體載體系統(tǒng)是在eDNAeDNA文庫(kù)構(gòu)建中最早使用的載體文庫(kù)構(gòu)建中最早使用的載體 系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是插入片段的裝載容量大，適合于系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是插入片段的裝載容量大，適合于 全長(zhǎng)的全長(zhǎng)的eDNAeDNA克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組 噬菌體顆粒的感染活性在噬菌體顆粒的感染活性在44環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常 適合于適合于eDNAeDNA文庫(kù)的長(zhǎng)期保存。文庫(kù)的長(zhǎng)期保存。 cDNA與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 導(dǎo)導(dǎo)宿主細(xì)

14、胞，或不經(jīng)體外包裝直接宿主細(xì)胞，或不經(jīng)體外包裝直接轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，但宿主細(xì)胞，但 轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。 DNADNA作為外源基因的克隆載體作為外源基因的克隆載體 基因組中間部分占基因組中間部分占30% 30% 的的DNA(DNA(包括重組和溶源化基因包括重組和溶源化基因) )并并 不是噬菌體裂解生長(zhǎng)所必需的，裂解生長(zhǎng)所需的基因都在基不是噬菌體裂解生長(zhǎng)所必需的，裂解生長(zhǎng)所需的基因都在基 因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的克隆載體在部分或全部非必克隆載體在部分或全部非必 需基因的兩側(cè)含有限制酶位點(diǎn)，這就賦予了需基因的兩側(cè)含有限制酶位點(diǎn)，這就賦予了載體克隆大片載體克隆

15、大片 段的能力，外源基因插入到限制酶位點(diǎn)之間，在體外包裝成段的能力，外源基因插入到限制酶位點(diǎn)之間，在體外包裝成 噬菌體，雖然包裝效率僅達(dá)噬菌體，雖然包裝效率僅達(dá)10%10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌 中形成噬菌斑的效率可達(dá)中形成噬菌斑的效率可達(dá)100% 100% 。目前由。目前由衍生的許多載體衍生的許多載體 被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫(kù)中的應(yīng)被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫(kù)中的應(yīng) 用產(chǎn)生了非常好的效果。用產(chǎn)生了非常好的效果。 二、克隆外源目的序列二、克隆外源目的序列 為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入DNA

16、DNA的的PLPL 啟動(dòng)子或啟動(dòng)子或PRPR啟動(dòng)子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。啟動(dòng)子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。 噬菌體載體的克隆原理和步驟噬菌體載體的克隆原理和步驟 （1）通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體）通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體 通過(guò)噬菌體的增殖，從中提取噬菌體通過(guò)噬菌體的增殖，從中提取噬菌體DNA 噬菌體載體均含有與裂解生長(zhǎng)所必須的基噬菌體載體均含有與裂解生長(zhǎng)所必須的基 因片斷，不同的載體采用不同的大腸桿菌因片斷，不同的載體采用不同的大腸桿菌 宿主菌來(lái)增殖。宿主菌來(lái)增殖。 經(jīng)過(guò)裂解生長(zhǎng)獲得噬菌體經(jīng)過(guò)裂解生長(zhǎng)獲得噬菌體 顆粒，再經(jīng)過(guò)分級(jí)分離分化，可用于提取顆粒，再經(jīng)過(guò)分級(jí)分離分化，可用于提取 噬菌體噬菌體DNA。 （2） 載體與

17、外源片斷的酶切載體與外源片斷的酶切 插入型載體來(lái)說(shuō)，載體被酶切后，很容易插入型載體來(lái)說(shuō)，載體被酶切后，很容易 自身連接，一般對(duì)載體的進(jìn)行去磷酸化。自身連接，一般對(duì)載體的進(jìn)行去磷酸化。 置換型載體，切割后形成左臂、填充片斷、置換型載體，切割后形成左臂、填充片斷、 右臂，填充片斷的存在會(huì)影響連接效率，右臂，填充片斷的存在會(huì)影響連接效率， 必須純化左臂和右臂。必須純化左臂和右臂。 （3）外源片斷與載體的連接）外源片斷與載體的連接 通過(guò)載體的粘性末端，將載體連接成多聯(lián)通過(guò)載體的粘性末端，將載體連接成多聯(lián) 體，以利于將兩個(gè)體，以利于將兩個(gè)cos位點(diǎn)之間的片斷裝入位點(diǎn)之間的片斷裝入 噬菌體顆粒噬菌體顆粒

18、（4）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力 的噬菌體顆粒的噬菌體顆粒 利用特殊材料，制備噬菌體包裝蛋白利用特殊材料，制備噬菌體包裝蛋白 連接產(chǎn)物與包裝蛋白混合時(shí)，就可完成包連接產(chǎn)物與包裝蛋白混合時(shí)，就可完成包 裝反應(yīng)，形成有感染力的噬菌體顆粒裝反應(yīng)，形成有感染力的噬菌體顆粒 包裝蛋白對(duì)所包裝的包裝蛋白對(duì)所包裝的DNA大小有高度選擇大小有高度選擇 性，性， 范圍：范圍：DNA分子的分子的75105 噬菌體的改造噬菌體的改造 設(shè)計(jì)去除設(shè)計(jì)去除DNA上的多余序列和一些限制性酶切點(diǎn)：因?yàn)樯系亩嘤嘈蛄泻鸵恍┫拗菩悦盖悬c(diǎn)：因?yàn)?DNA較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過(guò)多，妨礙其應(yīng)用。較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過(guò)多，妨礙其應(yīng)用。 在中段非必需區(qū)，替換或插入某