豆制品火鍋麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測(cè)定

1、豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測(cè)定BJS 2019091 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的測(cè)定和確證。2 原理 采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取樣品中的喹諾酮類化合物，經(jīng)離心和過濾后，上清液經(jīng)HLB

2、固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)和確證，內(nèi)標(biāo)法定量。3 試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。3.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.3 甲酸（CHOOH）：色譜純。3.4 甲醇（CH3OH）。3.5 氨水（NH4OH）：濃度25%28%。3.6 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O82H2O）。3.7 檸檬酸（C6H8O7H2O）。3.8 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）。3.9 氫氧化鈉（NaOH）。3.10 鹽酸（HCl）：含HCI 38%。3.11 乙酸銨（CH3COONH4

3、）：色譜純。3.12 磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取71.63 g磷酸氫二鈉（3.8），用水溶解并定容至1000 mL。3.13 檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g檸檬酸（3.7），用水溶解并定容至1000 mL。3.14 Mcllvaine緩沖溶液：將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液（3.13）與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液（3.12）混合，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.00.1。3.15 EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（0.1 mol/L）：稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉（3.6）至1625mL Mcllvaine緩沖溶液

4、（3.14）中，超聲使其溶解。3.16 5%甲醇水溶液：取5 mL甲醇（3.4），用水稀釋至100 mL。3.17 25%氨水甲醇溶液：取25 mL氨水（3.5），用甲醇（3.4）稀釋至100 mL。3.18 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見附錄A表A.1，純度99%。3.19 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg，置10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超聲使溶解，用乙腈（3.1）定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移至溶劑瓶中于-18以下避光保存，有效期6個(gè)月。3.20 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

5、：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.19）1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為0.01 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約0.015mg/mL），于4以下避光保存，有效期3個(gè)月。3.21 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.20）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約1.5 g/mL），于4以下避光保存，臨用新配。3.22 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別稱取氘代同位素標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg，至10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超

6、聲溶解，用乙腈（3.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18以下避光保存，有效期6個(gè)月。3.23 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.22）0.01mL于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0 g/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4以下避光保存，臨用新配。3.24 固相萃取小柱（500 mg，6 mL）：HLB柱或相當(dāng)者。使用前依次以6 mL甲醇、6mL水活化，保持柱體濕潤(rùn)。4 儀器和設(shè)備4.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。4.2 分析天平：感量0.001g和0.00001 g。4.3 渦旋振蕩器4

7、.4超聲儀4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速8000 r/min4.6 均質(zhì)器4.7 氮?dú)鉂饪s儀5 測(cè)定步驟5.1 試樣制備與保存豆制品、火鍋和麻辣燙的食材從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18冷凍存放?；疱伒琢稀⒙槔睜C底料固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4冷藏存放。半固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，放入研缽中，迅速研磨均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記于4冷藏存放。液體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，攪拌均勻后裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4冷藏存放。5.

8、2 樣品溶液制備 提取：稱取5.0 g均勻樣品（精確至0.001g），置50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.1mL，加入20 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15），渦旋混勻1min，超聲提取15 min，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，殘?jiān)肊DTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15）同法重復(fù)提取兩次，每次10 mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15）定容至刻度，混勻。用濾紙過濾（必要時(shí)10000 r/min離心5 min后過濾），續(xù)濾液待凈

9、化。凈化：精密吸取上述待凈化液25.0 mL，以約1 mL/min的流速全部通過固相小柱（3.24），用3 mL 5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6 mL甲醇、3 mL氨水甲醇（3.17）洗脫，合并甲醇及氨水甲醇洗脫液，45 氮吹至近干，準(zhǔn)確加入2.0 mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)?，過0.22 m濾膜，續(xù)濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。5.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備稱取5.0 g空白試樣（精確至0.001g），置50 mL離心管中，除不加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液外，其余同5.2操作處理后得到空白基質(zhì)，共制備6份。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.21）0 mL、0.010 mL、

10、0.020 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL及混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.025 mL于試管中，氮吹至近干，精密加入1.0 mL空白基質(zhì)復(fù)溶，過0.22 m濾膜，制成濃度為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度為0 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、75 ng/mL、150 ng/mL、300 ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)濃度約25ng/mL）。5.4 測(cè)定5.4.1 液相色譜參考條件 1） 色譜柱：C18色譜柱，2.1 mm50 mm1.7

11、 m，或性能相當(dāng)者。 2） 柱溫：40。 3） 流速：0.25 mL/min。 4） 進(jìn)樣量：2 L。 5） 流動(dòng)相：A-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脫條件見表1。表1 梯度洗脫條件時(shí)間（min）A(%)B(%)09010390108703010703010.55951359513.190101590105.4.2 質(zhì)譜參考條件 1） 電離方式：電噴霧電離（ESI）； 2） 掃描方式：正離子掃描； 3） 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM； 4） 離子源參數(shù)參考條件：離子源接口電壓， 4000 V；離子源接口溫度，350 ；脫溶劑溫度，250 ；離子源加熱溫度， 4

12、00 ；霧化氣流速，2.9 L/min；干燥氣流速，10.0 L/min；加熱氣流速，10.0 L/min。 5）定性離子對(duì)、定量離子對(duì)參見表2。表2 喹諾酮類藥物主要質(zhì)譜參數(shù)序號(hào)組分母離子子離子Q1 預(yù)四極桿電壓碰撞電壓Q3 預(yù)四極桿電壓（m/z）（m/z）（V）(V)（eV）1諾氟沙星320.2*302.0-16-21-21231.1-15-39-252氧氟沙星362.2*318.2-30-18-24261.1-30-28-193洛美沙星352.0*265.0-25-23-29308.0-25-17-224培氟沙星334.0290.1-25-18-20*316.2-25-21-225氟羅沙

13、星370.0*326.0-30-20-23269.0-29-28-266沙拉沙星386.2342.0-15-19-25299.1-29-30-20*368.1-14-22-267雙氟沙星400.0*356.0-17-20-25299.0-17-28-288司帕沙星393.0*349.0-30-21-28292.0-30-21-249環(huán)丙沙星332.1*314.1-25-21-22287.8-24-17-30231.0-25-40-4010達(dá)氟沙星358.0*340.1-26-23-24283.2-14-24-3082.1-26-44-1511恩諾沙星360.0*342.1-27-20-2531

14、6.0-13-20-22245.2-28-27-1712D8-環(huán)丙沙星340.3322.1-10-21-2213D5-恩諾沙星365.1321.1-11-19-2214D5-諾氟沙星325.3307.2-10-20-21注：1.“*”表示定量離子；2. 所列質(zhì)譜參考條件是在島津（LC/MS-8050）質(zhì)譜儀上完成的，此處所列試驗(yàn)用儀器型號(hào)僅供參考，不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)方法使用者嘗試不同廠家或型號(hào)的儀器；3. 對(duì)不同質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳；4. 由于喹諾酮類化合物離子化受基質(zhì)干擾較為顯著，方法使用者可根據(jù)實(shí)際情況選擇表中所列離子對(duì)進(jìn)行定性定量測(cè)定。5.4.3

15、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3）按濃度由低到高依次進(jìn)樣檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.5 定性在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差應(yīng)在2.5%之內(nèi)；且試樣譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液定性離子的相對(duì)豐度，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍時(shí)，則可確定為樣品中存在此種待測(cè)物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）典型圖譜見附錄B。表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度，%50%20%50%10%20%10%允許的相對(duì)偏差，%20%25%30%50%5.6 定量待測(cè)樣液中喹諾酮藥物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，諾氟沙星、氧氟沙星、

16、培氟沙星、氟羅沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)，洛美沙星、雙氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，司帕沙星、沙拉沙星、恩諾沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。本方法中所列內(nèi)標(biāo)能基本滿足方法要求，如條件允許，可采用各化合物的對(duì)應(yīng)同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)。6 結(jié)果計(jì)算試樣測(cè)定結(jié)果按公式（1）計(jì)算目標(biāo)物的含量：. (1)式中：X試樣中被測(cè)組分的含量，單位為微克每千克（g/kg）；m試樣的稱樣量，單位為克（g）；C由工作曲線計(jì)算得到的試樣中被測(cè)組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V定容體積，單位為毫升（mL）。F稀釋倍數(shù)計(jì)算結(jié)果需扣除空白值（空白基質(zhì)），并保留三位有效數(shù)字。7 檢測(cè)方法靈敏度、

17、準(zhǔn)確度、精密度7.1 靈敏度諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星檢出限均為5 g/kg，環(huán)丙沙星檢出限為7.5 g/kg，沙拉沙星檢出限為7.5 g/kg。諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星定量限均為15 g/kg，環(huán)丙沙星定量限為22.5 g/kg，沙拉沙星定量限為22.5 g/kg。7.2 準(zhǔn)確度本方法在15.0100.0 g/kg的添加水平上的回收率范圍為65.0%120.0%。7.3 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15%。附錄A標(biāo)準(zhǔn)品信息表

18、A.1 標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量序號(hào)化合物名稱英文名CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量1諾氟沙星Norfloxacin70458-96-7C16H18FN3O3319.332氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C18H20FN3O4361.373洛美沙星Lomefloxacin98079-51-7C17H19F2N3O3351.354培氟沙星Pefloxacin70458-92-3C17H20FN3O3333.365氟羅沙星Fleroxacin79660-72-3C17H18F3N3O3369.346鹽酸沙拉沙星Sarafloxacin Hydrochloride91296-87-6C20H18ClF2N3O3421.817鹽酸雙氟沙星Difloxacin Hydro