浙江大學(xué)生物化學(xué)甲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)酶基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)——底物專一性激活劑和抑制劑最適溫PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 浙江大學(xué)生物化學(xué)甲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)酶基本性浙江大學(xué)生物化學(xué)甲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)酶基本性 質(zhì)實(shí)驗(yàn)質(zhì)實(shí)驗(yàn)底物專一性激活劑和抑制劑底物專一性激活劑和抑制劑 最適溫最適溫 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠?、?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1. 初步掌握正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的使用。 2. 運(yùn)用正交法測(cè)定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種因素對(duì)酶活 力的影響。 二、實(shí)驗(yàn)基本原理二、實(shí)驗(yàn)基本原理 酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的，它受多種因素的影響，如酶濃 度、底物濃度、溫度、 pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應(yīng) 速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過(guò)某一因素在一系列變化條件下 的酶活性測(cè)定求得該因素的影響，這是單因素的試驗(yàn)方法。對(duì)于多

2、因素的 試驗(yàn)可以通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法來(lái)完成。正交法是借助于正交表，簡(jiǎn)化的表 格計(jì)算，正確分析結(jié)果，找到實(shí)驗(yàn)的最佳條件，分清因素的主次，這樣就 可以通過(guò)比較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到好的實(shí)驗(yàn)效果。實(shí)踐證明正交法是一個(gè)多、 快、好、省的方法。目前已廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)中。 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交法測(cè)定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個(gè)因素對(duì) 酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時(shí)酶的 活性最大。 第1頁(yè)/共14頁(yè) 三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑 1、實(shí)驗(yàn)材料 純化的蔗糖酶（樣品） 2、實(shí)驗(yàn)試劑 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6

3、、5.6； 3,5二硝基水楊酸試劑； 甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml, 在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。 乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水楊酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天 以后使用。 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器 1. 試管及試管架； 2. 吸量管； 3. 恒溫水浴箱 （37、50、65、100 ）； 4可見(jiàn)光分光光度計(jì)。 第2頁(yè)/共14頁(yè) 五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟 1 1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 、

4、確定試驗(yàn)因素和水平、確定試驗(yàn)因素和水平 本實(shí)驗(yàn)取四個(gè)因素，即底物濃度S、酶濃度E、溫度、pH值。每個(gè) 因 素選三個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)因素和選用水平如表1。 表表1 1 因素、水平表因素、水平表 因素因素 水平水平 S （ml） E （ml） 溫度溫度 （） pH 10.51.0503.6 20.20.6375.6 30.80.2654.6 作因素、水平表時(shí)，各因素的水平，最好不要按大小順序排列。按一般 方法，如對(duì)四個(gè)因素三個(gè)水平的各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗(yàn)，而 用正交表只需做9次試驗(yàn)。 第3頁(yè)/共14頁(yè) 、選擇合適的正交表、選擇合適的正交表 合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應(yīng)

5、該不大于所選 正交表的總自由度。 正交表 Ln（ tq） L 正交表的代號(hào) n 處理數(shù)（試驗(yàn)次數(shù)） t 水平數(shù) q 因素?cái)?shù) 試驗(yàn)次數(shù) n = q( t1 )+1= 4（31）+19 總自由度 V總= n-1 各列自由度 V列 = K（該列水平數(shù)）1 例如本實(shí)驗(yàn)選用四個(gè)因素，每個(gè)因素選三個(gè)水平，四個(gè)因素各占一 列，那么四個(gè)因素的自由度分別為： V1 = 31 = 2， V2 = 31 = 2， V3 = 31 = 2， V4 = 31 = 2。 四個(gè)因素的自由度總和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8 因?yàn)楦饕蛩刈杂啥瓤偤褪?，它沒(méi)有超過(guò)L9（34）的總自由度= 91 = 8。 所以

6、選擇正交表L9（34）是適合的。 第4頁(yè)/共14頁(yè) 3. 3. 在所選的正交表上進(jìn)行表頭設(shè)計(jì)在所選的正交表上進(jìn)行表頭設(shè)計(jì) 由于本實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)四因素各三水平的試驗(yàn)，這樣將四個(gè)因素依次放在 L9（34）的第1，2，3，4列上，這項(xiàng)把因素放入正交表頭的工作，叫做表頭設(shè) 計(jì)。見(jiàn)表2。正交表都應(yīng)具有以下兩個(gè)特性： （1）在每一列中，各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等。即在任何一列中，數(shù)字1和數(shù)字2 和數(shù)字3都出現(xiàn)三次（幾個(gè)水平就均出現(xiàn)幾次）。 （2）任何兩列中，橫行組成的數(shù)對(duì)出現(xiàn)次數(shù)相等，均出現(xiàn)一次（這里有9個(gè) 不同的數(shù)對(duì)，均出現(xiàn)一次） （1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、 （2，3）、（3，1

7、）、（3，2）、（3，3），各出現(xiàn)一次。 以上這些特點(diǎn)保證了用正交表安排的試驗(yàn)計(jì)劃是均衡搭配的，因此分析 數(shù)據(jù)比較方便，可進(jìn)行綜合比較，結(jié)果比較可靠。在所選的正交表上進(jìn)行表 頭設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。 第5頁(yè)/共14頁(yè) 水平 因素 實(shí)驗(yàn)號(hào) 1 S 2 E 3 溫度 4 pH 11111 21222 31333 42123 52231 62312 73132 83213 93321 L9L9表表 表表2 2 表頭設(shè)計(jì)表頭設(shè)計(jì) 第6頁(yè)/共14頁(yè) 2 2、試驗(yàn)安排、試驗(yàn)安排 將本實(shí)驗(yàn)的四個(gè)因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再將各列 的水平數(shù)用該列因素相應(yīng)的水平寫(xiě)出來(lái)，便可得到下面的試驗(yàn)安排表 （表3）

8、。 表中試驗(yàn)號(hào)共9個(gè)，表示要做9次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)的條件如每一縱行 所示。如做第一個(gè)試驗(yàn)時(shí)S是0.5 ml，E是1.0mL，溫度50，pH為 3.6。第二個(gè)試驗(yàn)S是0.5ml，E是0.6mL，溫度37，pH為5.6，余類 推。 第7頁(yè)/共14頁(yè) 實(shí)驗(yàn)號(hào) 試劑（ml） 249168357 5%蔗糖溶液S0.50.20.80.50.20.80.50.20.8 0.2mol/L 乙酸緩沖溶液pH pH5.6 1.0 pH4.6 1.0 pH3.6 1.0 pH3.6 1.0 pH5.6 1.0 pH4.6 1.0 pH4.6 1.0 pH3.6 1.0 pH5.6 1.0 蒸餾水0.90.81.00.

9、51.60.61.31.20.2 37預(yù)溫5min50預(yù)溫5min65預(yù)溫5min 蔗糖酶（樣品）E (作相應(yīng)的預(yù)溫） 0.61.00.21.00.20.60.20.61.0 溫度37反應(yīng)10min50反應(yīng)10min65反應(yīng)10min DNS111111111 1005min 蒸餾水555555555 A520 表表3 3 試驗(yàn)安排試驗(yàn)安排表表 另取試管一支作非酶對(duì)照非酶對(duì)照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，緩沖液1.9ml。先加先加DNSDNS 1ml搖勻室溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品） 0.6ml搖勻室溫放置10分鐘，1005min，再加入蒸餾水5ml，混勻后在520nm處測(cè)光密度值。 第

10、8頁(yè)/共14頁(yè) 六、試驗(yàn)結(jié)果及分析六、試驗(yàn)結(jié)果及分析 實(shí)驗(yàn)做好后，把9個(gè)數(shù)據(jù)填入表4試驗(yàn)結(jié)果欄內(nèi)，按表中數(shù)據(jù)計(jì)算出各 因素的一水平試驗(yàn)結(jié)果總和、二水平試驗(yàn)結(jié)果總和、三水平試驗(yàn)結(jié)果總和， 再取平均值（各自被3除）。最后計(jì)算極差。極差是指這一列中最好與最壞 的之差，從極差的大小就可以看出那個(gè)因素對(duì)酶活力影響最大，那個(gè)影響 最小。找出任何條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結(jié)論。 以O(shè)D值 為縱座標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫座標(biāo)作圖。 實(shí)驗(yàn)的典型結(jié)果與異常分析實(shí)驗(yàn)的典型結(jié)果與異常分析 試驗(yàn)確定的最佳條件與理論很吻合。如出現(xiàn)與理論明顯不一致的現(xiàn)象 可能是試驗(yàn)過(guò)程中如加樣及時(shí)間控制等出現(xiàn)較大誤差所致。 3 ,

11、3 , 3 第9頁(yè)/共14頁(yè) 水平 因素 實(shí)驗(yàn)號(hào) 1 S(ml) 2 E(ml) 3 溫度() 4 pH值 試驗(yàn)結(jié)果 A520 11 0.51 1.01 501 3.6 21 0.52 0.62 372 5.6 31 0.53 0.23 653 4.6 42 0.21 1.02 373 4.6 52 0.22 0.63 651 3.6 62 0.23 0.21 502 5.6 73 0.81 1.03 652 5.6 83 0.82 0.61 503 4.6 93 0.83 0.22 371 3.6 (一水平試驗(yàn)結(jié)果總和) (二水平試驗(yàn)結(jié)果總和) (三水平試驗(yàn)結(jié)果總和) /3 /3 /3 級(jí)差 表表4 4 試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算表試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算表 第10頁(yè)/共14頁(yè) 七、注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1、各試劑加樣一定要準(zhǔn)確。 2、保溫時(shí)間各管要一致。 3、加DNS后應(yīng)立即搖勻。 八、參考資料八、參考資料 童一中，生物統(tǒng)計(jì)法，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1987 丁鳴丁鳴 第11頁(yè)/