酵母菌的基因工程課件

1、酵母菌的基因工程課件 5.2 酵母菌的基因工程 酵母菌的基因工程課件 發(fā)展歷程 1974年rlarckwalker和Miklos發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)釀 酒酵母中存在質(zhì)粒。 1978年Hmnen將來自一株釀酒酵母的leu 2基因 導(dǎo)入另一株釀酒酵母，彌補(bǔ)了后者的Leu2缺陷， 標(biāo)志著酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立。 1981年Hinnen等用酵母基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人 干擾素。 我國也在1983年首次用酵母菌表達(dá)了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。 1996年在全世界科學(xué)家的通力合作下，完成了 第一個(gè)真核生物釀酒酵母全基因組的測序。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)勢在于： 安全無毒，不致

2、病； 有較清楚的遺傳背景，容易進(jìn)行遺傳操作； 容易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入。DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展優(yōu)化， 多數(shù)酵母菌可以取得較高的轉(zhuǎn)化率； 培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵； 5. 能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中； 有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。 缺陷在于： 表達(dá)效率相對低 2. 酵母常有密碼子偏性，真核基因在其中表達(dá)時(shí)需要人工 修正。 酵母菌的基因工程課件 5.2 .1 酵母菌的宿主系統(tǒng) 廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌 提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變宿主菌 抑制超糖基化作用的突變宿主菌 4. 減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 酵母菌的基因工程課件 廣泛用于外源基因表

3、達(dá)的酵母宿主菌 目前已廣泛用于外源基因表達(dá)的研究的酵母菌包括： 酵母屬 如釀酒酵母 克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母 畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母 裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母 漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母 其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研 究最詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基 因最理想 酵母菌的基因工程課件 提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變宿主菌 使啤酒酵母中異源蛋白產(chǎn)量提高和質(zhì)量改善的突變 突變突變 產(chǎn)生的異源蛋白產(chǎn)生的異源蛋白 增加產(chǎn)量（倍數(shù)）增加產(chǎn)量（倍數(shù)） 作用位點(diǎn)作用位點(diǎn) SSC1 凝乳酶原凝乳酶原 Ca2+-ATPase 牛生長因子牛生長因子 3-10 轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)錄后 SSC2 凝乳酶原凝

4、乳酶原 轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)錄后 牛生長因子牛生長因子 rgrl 鼠鼠淀粉酶淀粉酶 5-10 轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)錄后 osel 內(nèi)啡肽內(nèi)啡肽 7-12 轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)錄后 NDS 人血清蛋白人血清蛋白 溶酶原活化劑抑制因子溶酶原活化劑抑制因子2型型 10 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 ss1l 1 抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶P 人溶菌酶人溶菌酶 10 羧肽酶羧肽酶Y rho 人溶菌酶人溶菌酶 10 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人表皮因子人表皮因子 NDE 酵母菌的基因工程課件 抑制超糖基化作用的突變宿主菌 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖 基團(tuán)，常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心 和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 突變類型 生物效應(yīng) mnn 甘露

5、糖生物合成缺 陷型 alg 天門冬酰胺側(cè)鏈糖 基化缺陷 och 外側(cè)糖鏈添加缺陷 型 酵母菌普遍擁有完 整的糖基化系統(tǒng)，但野 生型釀酒酵母對異源蛋 白的糖基化反應(yīng)很難控 制，呈超糖基化傾向， 因此超糖基化缺陷菌株 非常重要。 酵母菌的基因工程課件 減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 Lys Lys Ubiquitin 76 aa Lys Lys Ubiquitin ligase E3 Ubiquitin ligase E3 蛋白酶體 酵母菌的基因工程課件 減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 泛素降解途徑衰減的釀酒酵母 UBI

6、4缺陷型： 在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)， UBI4-突變株正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子 的濃度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突變 株是外源基因表達(dá)理想的受體。 UBA1缺陷型： UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株式致死性 的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能 削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。 Ubc4-ubc5雙突變型： 七個(gè)泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同 樣有效。 酵母菌的基因工程課件 5.2.2 酵母菌的載體系統(tǒng) 載體的一般結(jié)構(gòu) 選擇標(biāo)記 復(fù)制子 表達(dá)盒 啟動子 先導(dǎo)序列 終止子 有用的蛋白結(jié)構(gòu)域 1酵母菌中的野生型質(zhì)粒 2酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 酵

7、母菌的基因工程課件 酵母菌種的野生型質(zhì)粒 釀酒酵母中的2環(huán)狀質(zhì)粒 幾乎所有的釀酒酵母 都含有2雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒， 拷貝數(shù)維持50-100個(gè)。 Irs反向重復(fù)序列 600bp，重組FLP編碼產(chǎn) 物驅(qū)動Irs的同源重組 REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒 的穩(wěn)定性STB REP的結(jié) 合位點(diǎn) 接合酵母屬中的 pSRI、pSR1、pSB2和 pSR1以及克魯維酵母屬 中的pKD1質(zhì)粒等，均有 類似的結(jié)構(gòu)。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌種的野生型質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中的線性質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線 性質(zhì)粒pGKL1和pGKL2，拷貝數(shù)為50-100 個(gè)，分別攜帶K1和K2兩種能致死宿主細(xì)胞的 毒素蛋白

8、基因。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 含有ARS的YRp和YEp質(zhì)粒及其構(gòu)建 ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，大小在0.8- 1.5Kb,染色體上每30-40bp就有一個(gè)ARS元件。 由染色體ARS構(gòu)成的質(zhì)粒稱為Yrp，而由2質(zhì)粒 構(gòu)建的雜合質(zhì)粒為Yep。 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá) 200個(gè)，但是經(jīng)過幾代培養(yǎng)后，質(zhì)粒丟失率達(dá) 50%-70%，主要由于分配不均勻所致。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻 分配有關(guān)的序列。將CEN插入到ARS質(zhì)粒 中，獲得的新載體稱為YCp。 YC

9、p質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷 貝數(shù)通常只有1-5個(gè)。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元 件構(gòu)建人工酵母染色體，可以克隆擴(kuò)增大 片段的外源DNA，這是構(gòu)建YAC載體的基 本思路 YAC載體的裝載量可高達(dá)800kb，適用于構(gòu) 建人的基因組文庫。 酵母菌的基因工程課件 5.2.3 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) l酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 l轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn) l用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 酵母菌的基因工程課件 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn) 定的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化法。在C

10、a2+和PEG的存在下， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)存活的原生質(zhì)球總數(shù)的1%-5%。但 是操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率 的嚴(yán)重制約。 原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法德一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體 細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化 的原生質(zhì)占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%-33%。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的堿金屬細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+ 等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收 質(zhì)粒DNA，而且具有以下特性： l吸收吸收線性DNA的能力明顯大于環(huán)狀 DNA，二者相差80倍。 l共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象較為罕見。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 酵母菌電擊轉(zhuǎn)化 酵母

11、菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條 件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免 使用PEG，它對受電擊的細(xì)胞具有較大的 負(fù)作用。其優(yōu)勢在于不依賴于受體細(xì)胞的 遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn) 化率高達(dá)105轉(zhuǎn)化子/gDNA。 酵母菌的基因工程課件 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn) l單雙鏈DNA均可高效轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈 DNA的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍 l含有酵母復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后， 能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制。 l不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高 效地同源整合入染色體，這對于體內(nèi)定點(diǎn) 突變酵母基因組極為有利。 l同源重組的頻率取決于整合型質(zhì)粒與受體 菌基因組之間的同源程度以及同源區(qū)域長

12、 度，一般來說，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50- 80%。 酵母菌的基因工程課件 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因 用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要由營 養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類。 營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要由氨基酸和核苷酸 生物合成記憶如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade。 但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的 受體非常困難。 酵母菌的基因工程課件 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 顯性標(biāo)記基因 顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物只 標(biāo)記基因 編碼產(chǎn)物 遺傳表型 Aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗G418 Cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素 Dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和

13、磺胺 Cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 Suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑 酵母菌的基因工程課件 5.2.4 酵母菌的表達(dá)系統(tǒng) l酵母菌啟動子的基本特征和選擇 l酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng) l外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素 l酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 酵母菌的基因工程課件 酵母菌啟動子的基本特征和選擇 l用于啟動轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的酵母菌 型啟動子由基本區(qū)和調(diào)控區(qū)兩部分組成， 基本區(qū)包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 l調(diào)控區(qū)位于基本區(qū)上游幾百堿基對的區(qū)域 內(nèi)，由上游激活系列（UAS）和上游阻遏 序列（URS）等順式元件組成。 l利用啟動子探針質(zhì)?？蓮?/p>

14、酵母菌基因組中 克隆和篩選具有特殊活性的強(qiáng)啟動子，另 一種方法是從已有的啟動子中構(gòu)建雜合啟 動子 酵母菌的基因工程課件 酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng) （1）溫度控制性啟動 子 釀酒酵母有a和兩種 單倍體，分別由 MATa和MAT兩種 等位基因決定。 MAT由順反子MAT1 和MAT2組成，前 者決定1的激活過 程，后者決定2阻 遏過程。 MATa中，a1和a2蛋白 共同決定a1- a2阻 遏。 A 25 Sir3-8ts Sir3-8ts hml2-102 1 a1 MATa MATa a1 hml2-102 受體細(xì)胞基因組 重組質(zhì)粒 a 型 啟 動 子 a 型 啟 動 子 型 啟 動 子 型

15、 啟 動 子 酵母菌的基因工程課件 酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng) （2）超誘導(dǎo)型啟動子 當(dāng)釀酒酵母生長在無半乳糖或葡萄糖存在的 培養(yǎng)基時(shí)，其GAL1、 GAL7、 GAL10啟動 子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖時(shí)， 啟動子活性被誘導(dǎo)1000倍。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng) （3）嚴(yán)緊控制表達(dá)系統(tǒng) 一種以人雄激素受體為中心的嚴(yán)緊控制表達(dá) 系統(tǒng)能有效地將外源基因的表達(dá)水平控制 在一個(gè)合適的范圍，以彌補(bǔ)釀酒酵母的宿 主-載體系統(tǒng)缺少的嚴(yán)緊控制表達(dá)機(jī)制 酵母菌的基因工程課件 外源基因在酵母菌種表達(dá)的限制性因素 l外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度 l外源基因mRNA的翻譯活性 l酵母

16、菌對密碼子的偏愛性 在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘 油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH，磷酸甘油激酶 PKG，乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨 基酸是由25個(gè)密碼子編碼的。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性 較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸 甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的 啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力， 往往使得有些重組蛋白與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而 不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表 達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。 酵母菌的基因工程課件 酵母

17、菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng) 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣 泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的搞笑表達(dá)穩(wěn)定 性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也 能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌性的重 組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲 醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑 中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長迅速、乙醇氧 化酶基因AOX1所屬強(qiáng)啟動子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性 事巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體， 所以

18、外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色 體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在 很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng) 多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序 列HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體， 但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞 有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是， HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體 DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個(gè)拷貝，因此 重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表賣弄抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋 白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。 酵母菌的基因工程課件 酵母菌的

19、蛋白修飾分泌系統(tǒng) l蛋白質(zhì)的分泌運(yùn)輸機(jī)制 l信號肽及其剪切系統(tǒng) l分泌型蛋白的糖基化修飾 酵母菌的基因工程課件 蛋白質(zhì)的分泌運(yùn)輸機(jī)制 酵母菌的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng) 與其他高等真 核生物相似， 高度分化的 細(xì)胞器結(jié)構(gòu) 在酵母菌蛋 白分泌運(yùn)輸 過程中起著 重要作用。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 核膜 高爾基體 泡囊 質(zhì)膜 酵母菌的基因工程課件 信號肽及其剪切系統(tǒng) 與其他真核生物相似，酵母菌信號肽序列的保守性 較低，大都由15-30個(gè)氨基酸殘基組成，含有三個(gè) 不同的結(jié)構(gòu)特征，即N端帶正電荷的n區(qū)，中間疏 水殘基的h區(qū)，C端極性的c區(qū)。 l n區(qū)的長度及氨基酸殘基性質(zhì)各異，都含正電荷。 l h區(qū)的疏水氨基酸殘基大都隨即排列。 l c區(qū)具有對應(yīng)于信號肽剪切位點(diǎn)的特征序列。 酵母菌的基因工程課件 分泌型蛋白的糖基化修飾 酵母菌中的蛋白質(zhì)糖基化修飾有兩個(gè)主要步 驟，即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配 以及在高爾基體中的糖外鏈延伸。 l進(jìn)入高爾基體的分泌型蛋白在其寡聚多糖 核上進(jìn)行外鏈的延伸反應(yīng)。 l酵母菌的修飾形式不同于高等真核生物。 l重組異源蛋白在酵母菌受體細(xì)胞中的超糖 基化會造成重組蛋白的生物活性降低以及 蛋白質(zhì)的免疫原性增加等。 酵母菌的基因工程課件 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 l乙肝肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、 l產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母