基因工程制藥pa課件

1、基因工程制藥pa 基因工程菌的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)設(shè)備 基因工程藥物的分離純化工藝五、基因工程菌的培養(yǎng)和分離純化技術(shù)基因工程制藥pa基因工程藥物的分離純化 目的產(chǎn)物在初始原料中的含量較低； 含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了目的產(chǎn)物外，還有大量的細(xì)胞、代謝、殘留物培養(yǎng)基、無機(jī)鹽等，特別是產(chǎn)物類似物對目的產(chǎn)物的分離純化影響很大。 目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易使其失活、變性。基因工程制藥pa基因工程藥物的分離純化 種類繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜 的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)。 應(yīng)用面廣，對其質(zhì)

2、量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源。基因工程制藥pa基因工程藥物的分離純化建立分離純化工藝的根據(jù) 含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn) 利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過程中的 各種因素均對分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。 菌體類型及其代謝特征：包括菌體的生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和 副產(chǎn)物種類、產(chǎn)物在細(xì)菌內(nèi)所處的位置，表達(dá)方式（胞內(nèi)、 胞外、包含體），代謝物種類、產(chǎn)物類似物、毒素和能降解 產(chǎn)物的酶類等； 原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量；基因工程制藥pa基因工程藥物的分離純化建立分離純化工藝的根據(jù) 生產(chǎn)工藝和條件：包括滅菌方式和條件，生產(chǎn)方式（連續(xù)、批式、半連續(xù)），生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工藝控制條件因素幾方式

3、等； 初始物料的物理，化學(xué)和生物特性：包括產(chǎn)物濃度、主要雜質(zhì)種類和濃度、鹽的種類和濃度、溶解度、pH、粘度、流體力學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)。基因工程制藥pa基因工程藥物的分離純化 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)的含量、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性、吸附性能等。 目的產(chǎn)物特性 產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成、相對分 子量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、 擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物學(xué)活性、親和 性、配基種類、表面活性等?；蚬こ讨扑巔a基因工程藥物的分離純化 產(chǎn)品質(zhì)量的要求 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途對產(chǎn)品

4、純度、生物活性、比活的要 求。包括允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì)的種類 和最大允許量，以及雜質(zhì)對使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)4. 定性等?；蚬こ讨扑巔a分離純化的基本過程 由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。 基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過4-5個(gè)步驟，包括 細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純化以及成品加工?；蚬こ讨扑巔a基因工程制藥pa基因工程制藥pa分離純化的技術(shù)分離純化技術(shù)要求： 技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性； 選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的地將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高純化倍數(shù)

5、； 收率要高； 兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟； 整個(gè)分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求?；蚬こ讨扑巔a1. 細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞收集：離心和膜過濾 細(xì)胞破碎： 機(jī)械法-高壓勻漿、超聲波、高速珠磨、高壓擠壓等。 非機(jī)械法-酶溶、化學(xué)滲透、熱處理、滲透壓沖擊法。 固液分離：分離細(xì)胞碎片是比較困難。一般用離心和膜 過濾?；蚬こ讨扑巔a2. 目的產(chǎn)物的分離純化 分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。色譜技術(shù)分為： Ion exchange chromatography （IEC） Reversed phase chromatography （

6、PRC） Hydrophobic interaction chromatography （HIC） Affinity chromatography （AC）基因工程制藥pa等電點(diǎn)等電點(diǎn)決定離子交換的種類及條件決定離子交換的種類及條件疏水性疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度特殊反應(yīng)性特殊反應(yīng)性產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制聚合性聚合性是否采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體是否采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體生物特異性生物特異性決定親和配基決定親和配基溶解性溶解性決定分離體系及蛋白濃度決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性穩(wěn)定性決定工藝采用

7、的溫度及流程時(shí)間決定工藝采用的溫度及流程時(shí)間微不均一性微不均一性影響產(chǎn)物的回收影響產(chǎn)物的回收基因工程制藥pa基因工程制藥pa分離純化工藝應(yīng)遵循的原則 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性； 盡可能減少組成工藝的步驟； 組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝和設(shè)備相適應(yīng)。 在工藝過程中盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量；基因工程制藥pa分離純化工藝應(yīng)遵循的原則 分離純化工藝所用的時(shí)間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物； 工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對設(shè)備條件要求低，能耗低； 具有較高的安全性基因工程制藥pa針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采用不同的策略 采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，

8、通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理； 采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體； 采用融合性戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親合層析進(jìn)行純化 表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白?；蚬こ讨扑巔a針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（pI5或 pI8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去所有的雜蛋白； 重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標(biāo)蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（10-8

9、10-4 mol/L）； 基因工程制藥pa針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的； 凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的； 徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性?；蚬こ讨扑巔a多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來說，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則：u 應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用u 應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法u 應(yīng)盡量選擇高效的分離方法u 應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段基因

10、工程制藥pa分離純化過程的規(guī)模化 蛋白質(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：u 實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）u 實(shí)驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心） 因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝基因工程制藥pa包含體的形成： 原核、酵母和真核生物由于異源和同源蛋白過表達(dá)所形成的致密的不溶性顆粒。包含體的形成與過表達(dá)蛋白的內(nèi)在性質(zhì)（如分子量、折疊途徑等）無直接關(guān)系。因?yàn)榇竽c桿菌胞質(zhì)環(huán)境是一個(gè)還原性環(huán)境，所以含有較多二硫鍵的蛋白較容易錯(cuò)誤折疊形成包含體。相比之下，周質(zhì)空間有利于二硫鍵的形成，但是包含體的形成也會發(fā)生。包含體的產(chǎn)生有利

11、有弊?；蚬こ讨扑巔a包含體的性質(zhì)： 致密；折光性；組成（幾乎全部都是過表達(dá)蛋白，雜質(zhì)主要是細(xì)菌外膜蛋白，離心時(shí)一起沉降）；通常對蛋白酶降解不敏感（發(fā)酵升溫至42可促進(jìn)包含體形成并進(jìn)一步抑制蛋白酶）基因工程制藥pa 分離包含體并復(fù)性蛋白質(zhì)的操作步驟并不復(fù)雜，從破碎細(xì)胞開始，然后將細(xì)胞勻漿離心，回收包含體后，加入變形劑溶解包含體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在體外折疊時(shí)，蛋白質(zhì)分子間由于存在錯(cuò)誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低。究其原因，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響?；蚬?/p>

12、程制藥pa一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中，涉及兩種疏水相互作用。一是分子內(nèi)的疏水相互作用，二是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用。前者促使蛋白質(zhì)正確折疊，后者導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集而無活性，兩者互相競爭，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率。因此，在復(fù)性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵?；蚬こ讨扑巔a細(xì)胞破碎效率較重要（溶菌酶處理高壓勻漿）固-液相分離（離心）去污劑或/和低濃度尿素或鹽酸胍洗滌，去可溶性蛋白和膜蛋白高濃度尿素或鹽酸胍溶解包含體，可添加DTT(二硫蘇糖醇)打開二硫鍵逐步透析或稀釋去除變性劑基因工程制藥pal 透析或稀釋速度，溫度，pH，離子強(qiáng)度，目的蛋白的濃 度（通常10-

13、100微克/ml）以及目的蛋白中的雜質(zhì)會影響 復(fù)性過程，甚至導(dǎo)致目的蛋白聚集沉淀。l 對含有二硫鍵蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巰基乙胺 （cysteamine）等還原劑打開二硫鍵，使用過量的氧化硫氨 試劑或銅離子誘導(dǎo)的空氣氧化可以加速二硫鍵氧化形成。 復(fù)性過程添加L-精氨酸有時(shí)可以大幅度提高復(fù)性效率，可 能是由于增加了復(fù)性中間體的可溶性。l 復(fù)性過程添加某些去垢劑可以提高復(fù)性效率。l 通過抑制分子間非特異性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在親和層析柱上復(fù)性）?；蚬こ讨扑巔al 避免或減少包含體形成的有效方法是減緩蛋白合成速率， 如降低發(fā)酵溫度、使用弱啟動(dòng)若啟動(dòng)子、降低基因劑量等。l 使用

14、親水性蛋白作為融合伴侶可以增加融合蛋白的可溶性， 如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP） 和硫氧化還原蛋白（thioredoxin）后兩者還具有分子內(nèi)伴 侶作用，在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)分子伴侶蛋白，促進(jìn)外源蛋白的 正確折疊。l 過表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶可以促使蛋白的正確折疊，大腸桿菌 周質(zhì)空間的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫鍵，但是不催 化異構(gòu)，DsbC是一種二硫鍵異構(gòu)酶。l 在培養(yǎng)基中加入硫醇也可以促進(jìn)打開錯(cuò)配的二硫鍵，形成正 確的折疊蛋白。基因工程制藥pa分子大小分子大小凝膠過程凝膠過程分辨率適中；分級分離式流速分辨率適中；分級分離式流速較慢（較慢（8h/循環(huán)）脫鹽時(shí)流循環(huán)）脫鹽時(shí)流速

15、快（速快（30min/循環(huán)）；容量受循環(huán)）；容量受限于樣品體積限于樣品體積分級分離、適于脫鹽，大規(guī)分級分離、適于脫鹽，大規(guī)模純化的最后一步、用于去模純化的最后一步、用于去除雜質(zhì)的聚合體；脫鹽可用除雜質(zhì)的聚合體；脫鹽可用于任何階段、特別是步驟銜于任何階段、特別是步驟銜接時(shí)的緩沖液更換接時(shí)的緩沖液更換電荷電荷離子交換離子交換分辨率通常較高；流速較快分辨率通常較高；流速較快（合適的填料）；容量很大，（合適的填料）；容量很大，樣品體積不受限樣品體積不受限最適于早期純化，即大體積最適于早期純化，即大體積樣品且蛋白純度較低時(shí)使用樣品且蛋白純度較低時(shí)使用等電點(diǎn)等電點(diǎn)色譜聚焦色譜聚焦分辨率較高；流速大；容量大

16、，分辨率較高；流速大；容量大，樣品體積不受限樣品體積不受限純化最后階段純化最后階段疏水特性疏水特性疏水作用疏水作用分辨率較高；流速大；容量大，分辨率較高；流速大；容量大，樣品體積不受限樣品體積不受限適于任何階段，特別適于樣適于任何階段，特別適于樣品離子強(qiáng)度較高，如沉淀，品離子強(qiáng)度較高，如沉淀，離子交換后離子交換后反相反相分辨率較高；流速很快；容量分辨率較高；流速很快；容量大大適用于最后階段；特別適于適用于最后階段；特別適于分子量較小的肽分子量較小的肽生物親和性生物親和性親和親和分辨率極高；流速大，容量大，分辨率極高；流速大，容量大，樣品體積不限樣品體積不限適于任何階段，特別是樣品適于任何階段，

17、特別是樣品濃度小，雜質(zhì)含量多時(shí)使用濃度小，雜質(zhì)含量多時(shí)使用基因工程制藥pa層析分離技術(shù)（chromatography） 層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計(jì)的物理分離方法目前最常用的層析方法 離子交換層析 凝膠過濾層析 親和層析基因工程制藥pa離子交換層析 離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則基因工程制藥pa離子交換層析的基本原理離子交換層析（ion-exchange chromatography，IEC） IEC是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異，在離子

18、吸附劑上靜電吸附能力不同，用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫，從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)?；蚬こ讨扑巔a通過DEAE-纖維素將兩種不同帶電性的蛋白質(zhì)分離開圖中顯示的是帶正電的離子交換樹脂結(jié)合帶負(fù)電的蛋白基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)u 離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分 子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等。u 離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中 的其它陽離子或陰離子起交換作用u 如果有兩種以上的成分

19、被吸附在離子交換劑上，則在用 洗脫液洗脫時(shí)各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的 平衡常數(shù)離子交換劑的基本性能基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)u吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可通過改變pH使吸附的蛋 白質(zhì)失去電荷而解離下來u 不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即 親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可 將混合物中的成分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的離子交換劑的基本性能基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)u 陽離子交換劑：強(qiáng)酸性和弱酸性 可電離的基團(tuán) 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羥基（-OH）u 陰離子交換劑：強(qiáng)堿性和弱堿性 可

20、電離的基團(tuán) 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3)3）離子交換劑的分類基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)強(qiáng)離子交換劑 的電離率基本不受pH值影響，在整個(gè)pH范 圍都是離子化的，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑 的電離率受pH影響大，通常僅在pH69之間 是離子化狀態(tài)，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑 在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低， 離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑 在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低， 離子交換能力逐漸減弱離子交換劑的分類基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)u 離子交換樹脂 最常見的離子交換樹

21、脂是含有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物u 離子交換樹脂的優(yōu)點(diǎn) 流速快，對小分子物質(zhì)的交換容量大，因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化常用的離子交換劑基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換纖維素 離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大。陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖維素）常用的離子交換劑基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換葡聚糖 離子

22、交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（Sephadex G）Sephadex 的優(yōu)點(diǎn)l 親水性強(qiáng)、不會引起生物分子的變性和失活，母鏈對蛋白 質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小l 電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便， 流速快l 既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng) 因而Sephadex 是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)常用的離子交換劑基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換葡聚糖包括陽離子交換劑 CM-Sephadex C-25, CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25, Sephade

23、x C-50陰離子交換劑 DEAE-Sephadex A-25, DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25, QAE-Sephadex A-50常用的離子交換劑基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE 或CM 基團(tuán)的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因而具有穩(wěn)定的外形體積基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常

24、用的離子交換劑離子交換瓊脂糖： Sepharose Fast Flow 分類類型強(qiáng)度功能基團(tuán)陰離子交換DEAE中等-OCH2+CH2NH(CH2CH3)2QAE強(qiáng)-OCH2+CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3陽離子交換CM弱-OCH2COO-SP強(qiáng)-CH2CH2CH2SO3-基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的選擇原則選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì) 根據(jù)分離目的選擇介質(zhì) 酸性物質(zhì)用 交換劑分離 堿性物質(zhì)用 交換劑分離 氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化曲線來選擇陰離子陽離子基因工程制藥pa離子交換介質(zhì)的選擇原則對Pi=5的酸性蛋白質(zhì)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)在pH 5.5-9

25、.0 的范圍內(nèi)應(yīng)首選 DEAE-纖維素當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時(shí)在pH 3.5-4.5 的范圍內(nèi)應(yīng)首選CM-纖維素基因工程制藥pa離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要基因工程制藥pa離子交換層析的基本操作樣品進(jìn)柱 為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20% 為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高。 交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)基因工程制藥pa離子交換層析的洗脫 在洗脫方式上，陽離子交換主要是改變pH，它主

26、要應(yīng)用于等電點(diǎn)大于5的蛋白質(zhì)，而陰離子交換主要是改變鹽濃度，適用于大部分蛋白質(zhì)。 IEC 的洗脫一般分為3種 同步洗脫 分步洗脫 梯度洗脫基因工程制藥pa離子交換層析需注意的問題緩沖液的選擇 陽離子：Tris 陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽介質(zhì)處理 陽離子：Na+型 陰離子：Cl-型洗脫 原理：改變鹽濃度 改變pH 方式：連續(xù)洗脫 梯度洗脫介質(zhì)再生基因工程制藥pau 20種氨基酸中，大部分帶正電荷或負(fù)電，這是IEC應(yīng)用 范圍廣的原因。u IEC處理量大，附載系數(shù)高，一步縮小樣品體積很多。u IEC去除雜質(zhì)能力強(qiáng)，如對熱原質(zhì)、核酸、外毒素、小牛 血清中大部分蛋白及電荷性有差別的蛋白均可去除u 利用蛋白

27、在不同pH和鹽濃度下帶電性的不同，通過不同 條件下應(yīng)用同種類或不同類型介質(zhì)（如DEAE、CM）， 分兩步IEC使目標(biāo)蛋白達(dá)到提純目的，這是除親和柱層 析外，別的柱層析達(dá)不到的分離能力?；蚬こ讨扑巔au IEC原則上講可放在純化工藝的任何一步，他屬吸附型 層析，單步損失也較大。擴(kuò)大純化工藝時(shí)，尤其要按放 大直徑考慮，而不能只單獨(dú)放大柱高。一般來說柱高不 能大于柱直徑的4倍，否則純化結(jié)果和小試會相差較多?；蚬こ讨扑巔a親和層析 AC 具有分離純化目標(biāo)單一，回收率很高的特點(diǎn)。從理論上來講，AC得到的是相當(dāng)純的物質(zhì)，這種分離純化能力是其他任何柱層析都難以相比的。 AC柱制作工藝復(fù)雜，同時(shí)在色譜洗脫

28、過程中配體不可避免的脫落，不但柱子的使用壽命有限，而且必須經(jīng)特別處理才可以注射或服用，因此成本比較昂貴，一般不放在純化工藝的前面基因工程制藥pa疏水層析 疏水作用柱層析（Hydrophobic interaction chromatography，HIC） HIC 是以蛋白質(zhì)的疏水性為分離基礎(chǔ)的。具體說就是一種通過表面疏水性的差異來分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。疏水鍵的形成對于非極性雙方無特異性要求，不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強(qiáng)弱、分布及空間位阻效應(yīng)各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。 在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強(qiáng)弱順序?yàn)椋篢rp、ILe、Phe、Pro、Val、

29、Leu、Met、Ala?；蚬こ讨扑巔a疏水層析 影響HIC的因素當(dāng)介質(zhì)和上樣蛋白質(zhì)濃度不變時(shí)，主要有： 鹽類： 其作用是使暴露出界面的非極性基，使容易形成疏水作用，其次是增加水相極性，提高界面的表面張力，鹽濃度越高，促疏水鹽為(NH4)2SO4。 混溶有機(jī)溶劑：作用是使界面張力減弱，減少疏水作用 基因工程制藥pa疏水層析 影響HIC的因素 溫度：當(dāng)體系溫度由4升高到25時(shí)，疏水作用力增加20%30%，這主要是由于動(dòng)能增加，提高表面張力，一般當(dāng)溫度降低，可增大鹽濃度，使疏水作用不降低。 pH：當(dāng)pHPI 時(shí)可消除表面電荷的相斥作用。 表面活性劑 變性劑基因工程制藥pa疏水層析 HIC 使用范圍

30、廣，原則上可用于所有蛋白質(zhì)純化，處理量大，特別是從大體積樣品中提取含量的目標(biāo)蛋白顯優(yōu)勢，可取代傳統(tǒng)的鹽析沉淀技術(shù)。 HIC對DNA及小牛血清（其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分）去除率較高，尤其對細(xì)胞DNA一步去除率可達(dá)到90%以上。 原則上HIC可放在純化工藝的任何位置，但大部分放在前面。由于它屬于吸附型柱層析，尤其是對蛋白質(zhì)空間內(nèi)部的疏水作用可使此步損失較大，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也有細(xì)微的作用?；蚬こ讨扑巔a金屬螯合層析 金屬螯合層析（Immobilozed Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC） IMAC是根據(jù)蛋白質(zhì)中組氨酸等氨基酸殘基和介質(zhì)中特殊

31、金屬離子進(jìn)行金屬螯合作用，形成絡(luò)合物以分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。 蛋白質(zhì)表面暴露出一定的氨基酸殘基（His、Cys、Try）是蛋白質(zhì)吸附所需要的。蛋白質(zhì)側(cè)鏈空間排列方式起重要作用，如電荷、分子體積、氨基酸組成等分子性質(zhì)相似，但二級和三級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)基因工程制藥pa金屬螯合層析 層析中的單純的離子吸附和其他的一些復(fù)雜因素可以減少或通過高離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行改善，螯合作用受pH可解析已吸附的物質(zhì)，但也有一些例外。 在IMAC中可應(yīng)用幾種洗脫方式，如pH梯度洗脫、競爭配體洗脫、有機(jī)溶劑洗脫、螯合劑洗脫。 IMAC純化蛋白質(zhì)時(shí)，金屬與蛋白質(zhì)表面暴露的氨基酸殘基作用。IMAC在分離相應(yīng)的蛋白質(zhì)時(shí)，分離

32、率和回收率也高，它一般放在純化工藝的中后期。 某些蛋白質(zhì)、氨基酸和一些金屬離子的特異親力舉例如下： Cu同含氮化合物，單核苷酸，人乳鐵蛋白；Ni同含酪氨酸，色氨酸的蛋白質(zhì)或多肽；Zn同含組氨酸、半胱氨酸的蛋白質(zhì)或多肽?；蚬こ讨扑巔a濃縮、干燥及保存 蛋白質(zhì)的濃縮 減壓加溫蒸發(fā)濃縮 空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 冰凍法 吸收法 超濾法 沉淀法基因工程制藥pa濃縮、干燥及保存 干燥真空干燥適用于不耐高溫、易于氧化物質(zhì)的干燥和保存。整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器內(nèi)常放一些干燥劑如五氧化二磷、無水氯化鈣等。冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，同時(shí)增加了低溫因素。先將待干燥的液體冷凍到-20-40

33、，使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑升華成氣體而除去。既能在低溫條件下保護(hù)樣品在干燥過程中不會失活，又避免了液態(tài)樣品在低壓下因溶劑迅速氣化而產(chǎn)生大量氣泡的損失基因工程制藥pa濃縮、干燥及保存 保存 生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法有很大關(guān)系。其保存可分為兩種： 干粉 液態(tài) 但不論是干粉或液態(tài)都應(yīng)避免長期暴露于空氣中防止微生物的污染。 溫度對生物大分子的穩(wěn)定性和生物活性影響很大，故一般生物大分子都在低溫（04 ）保存時(shí)間也不宜過長，否則會招致樣品的失活?；蚬こ讨扑巔a濃縮、干燥及保存 干燥后的制品 性質(zhì)一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于

34、干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保存在04冰箱即可。 為了取樣方便和避免取樣時(shí)吸潮和被污染，可先將樣品分裝成小瓶，每次用時(shí)只取出一小瓶。基因工程制藥pa濃縮、干燥及保存 液態(tài)貯藏 這種方法對保持生物大分子活性是不利的，有些樣品在溶液中會較短的時(shí)間內(nèi)分解或失活，液態(tài)保存時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 樣品不能太稀 一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑 貯藏溫度要嚴(yán)格按照要求，絕對不能亂放，有些樣品只能貯藏于04冰箱，有些可貯藏于-20冰箱，有的可貯藏與-80冰箱甚至液氮中，應(yīng)視不同物質(zhì)而定?；蚬こ讨扑巔a蛋白質(zhì)的定量 蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量相差很大，功能各異，要建立一個(gè)理想而

35、又通用的蛋白質(zhì)定量測定的方法是很困難的。下面列出根據(jù)其不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：物理性質(zhì) 紫外分光光度法化學(xué)性質(zhì) 凱式定氮法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、膠 體金法染色性質(zhì) 考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法其他性質(zhì) 熒光法基因工程制藥paDNA、RNA的定量 用紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm兩個(gè)波長的光吸收，然后，按1A260相當(dāng)于50 g/ml雙鏈DNA、40 g/ml單鏈DNA或RNA及20g/ml單鏈寡核苷酸，計(jì)算樣品含量。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。 DNA和RNA 純品的A260/A280值分別為1.8和2.0，如果樣

36、品中有蛋白質(zhì)或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時(shí)就無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量?；蚬こ讨扑巔a蛋白質(zhì)的鑒定 n 濃度鑒定n DNA、RNA 的定量n 純度鑒定n 分子量測定n 等電點(diǎn)測定n 活性測定基因工程制藥pa蛋白質(zhì)的鑒定 純度鑒定電泳法：SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳) )，IEF(等點(diǎn)聚焦電泳)化學(xué)法：N-端測定，C-端測定儀器法：HPLC，質(zhì)譜，氨基酸組成分析分子量測定SDS-PAGE凝膠過濾氨基酸組成分析毛細(xì)管電泳基因工程制藥pa蛋白質(zhì)的鑒定等電點(diǎn)測定等電聚焦電泳活性測定激酶：標(biāo)記ATP磷酸化酶：定磷利用靶酶活性氧化還原酶ELISA（酶聯(lián)

37、免疫吸附劑測定）基因工程制藥paGM-CSF 下游生產(chǎn)工藝流程基因工程制藥pa一、原材料的質(zhì)量控制 確保編碼藥物的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量的安全性和一致性。 明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證； 提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分（如啟動(dòng)子、復(fù)制子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物；六、基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程制藥pa 提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性； 闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性； 提供插入基因表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。六、基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程制藥pa二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。 生產(chǎn)基因工程