分光光度法測(cè)定生鮮乳及乳粉中亞硝酸鹽方法優(yōu)化

1、 分光光度法測(cè)定生鮮乳及乳粉中亞硝酸鹽方法優(yōu)化 摘要：亞硝酸鹽是致癌物質(zhì)，檢測(cè)食品中的亞硝酸鹽，對(duì)食品安全的意義尤為重要。其中乳及其乳制品的檢測(cè)方法，目前主要以gb 5009.33的檢測(cè)方法為主，其中第二法分光光度法術(shù)以使用廣泛，但國(guó)標(biāo)法中分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽存在取樣量大，批量操作過程復(fù)雜情況。本課題主要針對(duì)以上問題，用分光光度法對(duì)生鮮乳及乳粉中的亞硝酸鹽含量測(cè)定過程進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后，樣品取樣量生鮮乳為18ml,奶粉為2g，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)回收率達(dá)到88%以上；rsd值為1.06%1.93%，與國(guó)標(biāo)法回收率90%；rsd值為0.66%1.44%。從回收率及rsd可以得出，優(yōu)化后的方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度與

2、國(guó)標(biāo)法相當(dāng)。操作過程中使用高速離心機(jī)，能更好分離提取溶液，能很好的提升工作效率并保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，具有較好的操作性。關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽；分光光度法；乳制品1.引言亞硝酸鹽是自然界環(huán)境中最普遍存在的含氮化合物之一1，是自然界常見的有害化學(xué)成分。因其具有作為發(fā)色劑、防腐劑以及增強(qiáng)產(chǎn)品的風(fēng)味的作用而被添加到食品中來。牛奶及其制品因其中含有豐富而全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，中國(guó)居民膳食指南推薦每日攝入300g及以上牛奶或其制品，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾娜粘Ｊ称?。事?shí)上天然牛奶中一般不含或含極有少量的亞硝酸鹽，一般不會(huì)危害人體健康。牛奶中出現(xiàn)較高的亞硝酸鹽可能的來源主要有：來源一是草料在喂養(yǎng)奶牛后，在其消化系統(tǒng)消化過程

3、中產(chǎn)生，來源二是在飼喂過程產(chǎn)生，來源三是生產(chǎn)用水中存在，來源四是為了延長(zhǎng)牛奶的保質(zhì)期人為添加2 。由于亞硝酸鹽對(duì)人體健康有如此嚴(yán)重的危害，而牛奶及其奶制品與我們生活息息相關(guān)，因此，檢測(cè)其在乳及乳制品中的含量和可能被人體攝入量應(yīng)引起高度重視。目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定食品中亞硝酸鹽含量的方法主要有熒光法、分光光度計(jì)法、離子色譜法及催化光度法等。分光光度法由于實(shí)用性強(qiáng)，設(shè)備常用，因此為國(guó)內(nèi)外測(cè)定食品中亞硝酸鹽時(shí)常見選擇的方法3。但是目前國(guó)標(biāo)法中的分光光度法實(shí)驗(yàn)存在樣品使用量大、試劑消耗大、大量樣品操作不靈活、同時(shí)沉淀后過濾難等問題。為了減少樣品跟試劑的使用以及提高實(shí)驗(yàn)的效率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)國(guó)標(biāo)法的操作進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)

4、整優(yōu)化。2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb 5009.33-2016第二法中的分光光度法測(cè)定樣品的亞硝酸鹽的實(shí)驗(yàn)原理是樣品中加入乙酸鋅溶液以除去蛋白質(zhì)及脂肪。此時(shí)在弱酸環(huán)境下,對(duì)氨基苯磺酸會(huì)與亞硝酸鹽發(fā)生重氮化,得到的產(chǎn)物再與鹽酸萘乙二胺偶合反應(yīng)形成紫紅色的特殊染料,在特定波長(zhǎng)下，會(huì)呈現(xiàn)線性關(guān)系?；谙嗤膶?shí)驗(yàn)原理情況下，參照卞玲娟等4對(duì)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)進(jìn)行修改的實(shí)驗(yàn)分析，對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，減少取樣量，便于大批量樣品的前處理，在沸水浴搖床上進(jìn)行震搖能有效促進(jìn)樣品與飽和硼砂溶液的混合。在沉淀蛋白和脂肪的操作中使用高速離心機(jī)，更有效地分離和沉淀，更方便之后的過濾操作。本次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)主要以鮮牛乳及奶粉作

5、為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證方法的可行性。同時(shí)按照國(guó)標(biāo)法實(shí)驗(yàn)方法操作，作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)。2.2試劑配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（5.0g/ml）：吸取2.50ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（200g/ml）于100ml容量瓶中，定容，搖勻。亞鐵氰化鉀溶液(106g/l)：在電子天平上稱106.0g亞鐵氰化鉀于小燒杯中,加去離子水溶解,稀釋至1000ml。乙酸鋅溶液(220g/l)：在電子天平上稱220.0g乙酸鋅于燒杯中,加入30ml冰乙酸進(jìn)行溶解,加去離子水稀釋至1000ml。飽和硼砂溶液(50g/l)：在電子天平上稱5.0g硼酸鈉試劑,用100ml熱水進(jìn)行溶解,冷卻后備用。鹽酸萘乙二胺溶液(2g/l)

6、：在萬分之一電子天平上準(zhǔn)確稱取0.2g鹽酸萘乙二胺,加入去離子水定容到100ml,混勻后置于棕色瓶中進(jìn)行避光低溫保存。鹽酸(20%):用量筒小心量取20ml鹽酸,加入去離子水稀釋至100ml。對(duì)氨基苯磺酸溶液(4g/l)：在萬分之一電子天平上準(zhǔn)確稱取0.4g對(duì)氨基苯磺酸,加入濃度為20%鹽酸定容到100ml,小心混勻后置于棕色瓶中避光低溫保存。2.3儀器與設(shè)備uv1800型可見光分光光度計(jì)（日本島津公司），分析天平，sigma離心機(jī)2.4計(jì)算公式亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計(jì))的含量計(jì)算:x1代表測(cè)試樣品中亞硝酸鈉的含量,單位為毫克每千克(mg/kg);v1代表測(cè)定用樣液體積,單位為毫升(ml);v2

7、代表試樣處理液總體積,單位為毫升(ml)；m2代表測(cè)定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量,單位為微克(g);m3代表試樣質(zhì)量,單位為克(g);1000代表轉(zhuǎn)換系數(shù)3.實(shí)驗(yàn)步驟3.1優(yōu)化方法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)3.1.1樣品前處理生鮮乳樣品：取10支50ml離心管，用移液管往離心管準(zhǔn)確取試樣18ml樣品，并用萬分之一天平稱重。分別加標(biāo)0.0ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml各兩支，做好標(biāo)記，各加2.5ml50g/l飽和硼砂溶液，加入70左右的去離子水12ml，混勻。乳粉：取10支50ml離心管，萬分之一天平稱取試樣2g(精確至0.001g)，分別加標(biāo)0.0ug/ml

8、、0.9ug/ml、1.8ug/ml、2.7ug/ml、3.6ug/ml各兩支，做好標(biāo)記。往各離心管加2.5ml50g/l飽和硼砂溶液，加入70左右的去離子水30ml，混勻。將上述離心管，放于搖床沸水浴加熱震搖15分鐘，取出置冷水浴中冷卻至室溫。再向離心管中加入1ml106g/l亞鐵氰化鉀溶液，置于振蕩器中振勻，再加入1ml220g/l乙酸鋅溶液并加水定容到40ml，振蕩器振勻，放置30分鐘后以25攝氏度，轉(zhuǎn)速r9000離心3分鐘。上清液用濾紙過濾，棄去少量初始濾液后，收集剩余濾液備用。3.1.2測(cè)定取8支10ml帶塞比色分別加入0.000、0.015、0.030、0.060、0.090、0.

9、120、0.150、0.180ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，另吸取4ml上述樣品濾液于10ml帶塞比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入0.6ml4g/l對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置5min后，分別加入0.3ml2g/l鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min。用1cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)538nm 處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)做試劑空白。3.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)3.2.1國(guó)標(biāo)法樣品的前處理生鮮乳樣品：取10個(gè)250ml具塞錐形瓶，用天平稱取生鮮乳90g(精確至0.001g),置于250ml具塞錐形瓶中，分別加標(biāo)0.0ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.

10、4 ug/ml各兩支，做好標(biāo)記。分別往具塞錐形瓶中加入12.5ml飽和硼砂溶液，然后加入70左右的水約60ml，搖勻。乳粉：取10支150ml具塞錐形瓶，各稱取乳粉樣品10g(精確至0.001g),置于瓶中。分別加標(biāo)0.0ug/ml、0.9ug/ml、1.8ug/ml、2.7ug/ml、3.6ug/ml各兩支，做好標(biāo)記。各加入12.5ml飽和硼砂溶液,加入70左右的水150ml，混勻。將上述錐形瓶于沸水浴中反應(yīng)15分鐘,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200ml容量瓶中,加入5ml106g/l亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5ml220g/l乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻

11、度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,濾液備用。3.2.2國(guó)標(biāo)法的測(cè)定吸取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液,分別置于50ml帶塞比色管中，另吸取40.0ml上述濾液于相同規(guī)格比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入2ml4g/l對(duì)氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3min5min后各加入1ml2g/l鹽酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混勻,靜置15min,用1cm比色杯,以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn),于波長(zhǎng)538nm處 測(cè)吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。同時(shí)做試劑空白。54.結(jié)果分析按照優(yōu)化后的方法和

12、國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比，先取得足量生鮮乳樣品，各分成五份，一份樣品直接按測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)定分析，另外四份分別加標(biāo)0.1、0.2、0.3、0.4ug/ml，每份樣品都進(jìn)行6組平行測(cè)試，測(cè)定的結(jié)果見表1和表2。表1 生鮮乳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)加標(biāo)回收結(jié)果樣品測(cè)定值（mg/kg）加標(biāo)量（ug/ml）加標(biāo)測(cè)定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.0290.10.12293.001.260.20.21191.001.190.30.29789.331.820.40.38188.001.55由表1可以看到，經(jīng)過優(yōu)化后的試驗(yàn)方法在測(cè)定生鮮乳的加標(biāo)回收率在88%93%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.19%1.82%之間。表2 生鮮乳

13、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定加標(biāo)回收結(jié)果樣品測(cè)定值（mg/kg）加標(biāo)量（ug/ml）加標(biāo)測(cè)定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.0310.10.12695.001.330.20.21893.500.790.30.30390.670.660.40.39390.500.81由表2中可以看出，國(guó)標(biāo)方法對(duì)生鮮乳測(cè)定的回收率在90.5%95%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.66%1.33%之間。按照優(yōu)化后的方法和國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行試驗(yàn)比較，取足量奶粉樣品，各分成五份，一份直接測(cè)試樣品含量，另外四份分別加標(biāo)0.9、1.8、2.7、3.6ug/ml，每一份樣品都進(jìn)行6組平行測(cè)試，測(cè)定的結(jié)果見表3和表4。表3 奶粉優(yōu)化實(shí)驗(yàn)加標(biāo)回

14、收結(jié)果樣品測(cè)定值（mg/kg）加標(biāo)量（ug/ml）加標(biāo)測(cè)定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.2520.91.10795.001.371.81.94494.001.062.72.70090.671.583.63.43888.501.93由表3可見，優(yōu)化后的測(cè)試方法在測(cè)定奶粉樣品的加標(biāo)回收率在88.5%95%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%1.93%之間。表4 奶粉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定加標(biāo)回收結(jié)果樣品測(cè)定值（mg/kg）加標(biāo)量（ug/ml）加標(biāo)測(cè)定值（mg/kg）回收率（%）rsd（%）0.2520.91.09894.001.081.81.87290.001.122.72.72791.671.2

15、63.63.50190.251.44表4是根據(jù)國(guó)標(biāo)法對(duì)奶粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，可以看出國(guó)標(biāo)方法在測(cè)定奶粉的回收率在90.25%94%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.081.44之間。綜合表1以及表2的回收率發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)方法測(cè)得的回收率結(jié)果比優(yōu)化后的方法的結(jié)果略高一些，而從兩者的rsd值看，國(guó)標(biāo)法rsd值0.66%1.33%也比優(yōu)化后的方法的rsd值1.19%1.82%小一些，但差別不大。而從表2、表3來看，兩種方法對(duì)奶粉的測(cè)定也有跟生鮮乳測(cè)試類似的結(jié)果。說明國(guó)標(biāo)法比優(yōu)化后方法測(cè)得的結(jié)果相對(duì)更優(yōu)一些，從相對(duì)平均偏差來看也是國(guó)標(biāo)法精密度更高一些，穩(wěn)定性更好一些。這其中原因可能是，經(jīng)過優(yōu)化的試驗(yàn)方法，其取

16、樣量比國(guó)標(biāo)方法小很多，相對(duì)的樣品結(jié)果出現(xiàn)的誤差也會(huì)增大，樣品加標(biāo)后，在處理過程中的損失也相對(duì)大一些。另外，從四個(gè)表中的數(shù)據(jù)看，隨著加標(biāo)量的增加回收率有一個(gè)輕微下降的趨勢(shì)，可能的原因，一個(gè)是亞硝酸鹽相對(duì)不穩(wěn)定，加標(biāo)量越多，損失越大，另外，由于隨著加標(biāo)量的遞加，飽和硼砂溶液的添加量卻沒增加導(dǎo)致的，飽和硼砂溶液在實(shí)驗(yàn)中是助提劑，可能會(huì)存在影響，后續(xù)可進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。依據(jù)沒加標(biāo)的樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，生鮮乳樣品的亞硝酸鹽含量非常低，比國(guó)標(biāo)的限量值低得多，而從肖琴等6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，正常生鮮乳得亞硝酸鹽在0.03140.1069mg/kg左右，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)的限制值。因此，用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法替代國(guó)標(biāo)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

17、有助于提高工作效率，減少試劑的使用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果的回收率和精密度并無太大差異。而奶粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是同樣道理5.結(jié)論優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)，生鮮乳取樣量?jī)H18ml，乳粉取樣量?jī)H2g，試劑的使用僅為國(guó)標(biāo)法的1/5，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中省去一步樣品容器之間的轉(zhuǎn)移過程，這樣的轉(zhuǎn)移步驟的減少可以減少亞硝酸鹽的損失，增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。在去除樣品中的蛋白脂肪過程中，通過離心可以使蛋白質(zhì)等沉淀，脂肪上浮，能快速得到澄清樣液，可以大幅提高過濾效率，在處理大量樣品量時(shí)有更大得效率提升。在提高了工作效率，減少試劑用量的同時(shí)，優(yōu)化后的方法的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果回收率基本相同，其精密度也差別不大，證明該方法實(shí)用可靠。后續(xù)可通過繼續(xù)增加實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其方法的精密度及檢出限，或者拓寬檢測(cè)范圍，對(duì)其他產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)：1.丁曉雯,柳春紅.食品安全學(xué).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.2.趙佳,董