電泳知識(shí)總結(jié)

1、1. 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生定向遷移（與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)）的現(xiàn)象。利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)分離、分析的技術(shù)叫做電泳技術(shù)。2.生物大分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度由什么決定？答：樣品性質(zhì)方面：粒子大小，形狀，帶電荷多少，帶電性質(zhì)；電泳條件方面：介質(zhì)阻力，電場(chǎng)強(qiáng)度，溶液黏度。3.粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)、粒子所帶電荷量(Q)成正比，而與粒子半徑(r)及溶液粘度()成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動(dòng)速度與粒子形狀有關(guān)。4. 遷移率與下列（ D )因素?zé)o關(guān)？A.電荷數(shù)量 B.粒子大小 C.溶液黏度 D.電場(chǎng)強(qiáng)度電泳遷移率（/泳

2、動(dòng)度/淌度）m：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的移動(dòng)速度。m = V/E = Q/6r 【影響遷移率的因素：1. 待分離大分子的性質(zhì) ：所帶的電荷、分子大小和形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快；2. 緩沖液pH和離子強(qiáng)度：pH值距pI愈遠(yuǎn)，Q越大，V越大 ；pH過高或過低蛋白變性緩沖液；緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度；離子強(qiáng)度過低或過高的不利影響；3. 電場(chǎng)強(qiáng)度：E高，帶電顆粒泳動(dòng)快。過高，產(chǎn)生焦耳熱，樣品和Buffer擴(kuò)散增加，條帶增寬；蛋白變性。過低，電泳時(shí)間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場(chǎng)強(qiáng)度以縮短電泳時(shí)間時(shí)，需附有冷卻裝置；4. 電滲 ：在 電場(chǎng)中液體對(duì)固體支

3、持物的相對(duì)移動(dòng)；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆粒泳動(dòng)速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減慢顆粒泳動(dòng)速度；5. 支持介質(zhì)：篩孔越小，則顆粒在移動(dòng)的過程中所受到的阻力也就越大；介質(zhì)的純度影響聚焦效果；介質(zhì)的非特異性吸附會(huì)增大電滲?！?. 等電點(diǎn)的定義？蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)有哪些特點(diǎn)？ 答：當(dāng)溶液的pH為一定數(shù)值時(shí)，其中的蛋白質(zhì)正負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此時(shí)的pH值就是該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最小。6.下列不是區(qū)帶電泳的是（ C ）A.紙電泳 B.醋酸纖維素薄膜電泳 C. 等電聚焦電泳 D.聚丙烯酰胺凝膠電泳7. 等電聚焦與等速電泳的差別？答：區(qū)帶窄，分辨率高。自由界面電泳：部

4、分分離 8. 電滲現(xiàn)象：外加電場(chǎng)作用下，與固體支持物接觸的液體層發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲流：電滲現(xiàn)象中液體的整體流動(dòng)。是毛細(xì)管電泳分離的主要驅(qū)動(dòng)力，是毛細(xì)管中的溶劑因軸向直流電場(chǎng)作用發(fā)生的定向流動(dòng)。其大小直接影響分析結(jié)果的精確度，準(zhǔn)確度。9.（凝膠電泳）為什么要用支持介質(zhì)？支持介質(zhì)應(yīng)具備哪些特性？答：抗對(duì)流；抗擴(kuò)散。物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；化學(xué)惰性不干擾大分子的電泳過程；均勻，電內(nèi)滲小，結(jié)果重復(fù)性好。10. 兩大類支持介質(zhì)薄膜類和凝膠類的特點(diǎn)？答：薄膜類化學(xué)惰性好，能將對(duì)流減到最??；分離主要原理：生物大分子的電荷密度。凝膠類高粘度和摩擦阻力對(duì)流和擴(kuò)散都?。痪哂蟹肿雍Y作用。分離主要原理：電荷密度+分子大小

5、。11. 在聚丙烯酰胺凝膠方法中，引發(fā)劑和加速劑的作用？答：引發(fā)劑：提供原始自由基，通過自由基傳遞，使Acr成為自由基，啟動(dòng)聚合反應(yīng)。加速劑：加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。Bis是交聯(lián)劑。12. 決定PAG特性的主要因素：?jiǎn)误w和交聯(lián)劑的總濃度；單體和交聯(lián)劑的比例。凝膠總濃度一定時(shí)，Bis的含量影響凝膠孔徑。PAG的分子篩效應(yīng)取決于凝膠孔徑與樣品分子大小接近的程度。選擇合適的凝膠濃度，完成不同的分離任務(wù)。a:b100 凝膠呈糊狀；a:b30 凝膠富有彈性，且完全透明；a2%和b0.5% 凝膠不可能聚合。什么是分子篩效應(yīng)？分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)

6、出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。醋酸纖維素薄膜電泳的特點(diǎn)是什么？分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。簡(jiǎn)述聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及應(yīng)用范圍。特點(diǎn)：具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量?。?g100g）、分辨率高等。應(yīng)用范圍：可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析。還可結(jié)合去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS），以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。13.聚丙烯酰胺凝膠電泳有什么優(yōu)點(diǎn)？（1）可以在天然狀態(tài)分離生物大分子；（2）可分析蛋白質(zhì)和別的生物大分子的混

7、合物；（3）電泳分離后仍然保持生物活性。14.瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)：(1)屬于大孔膠。可以分析107的大分子，其電泳分辨率低于PAGE的。瓊脂糖濃度決定形成凝膠后的孔徑。(2)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，吸附小，分辨率高，重復(fù)性好；(3)機(jī)械強(qiáng)度較高；(4)瓊脂糖無毒，熱可逆，制備簡(jiǎn)單；(5)利于樣品回收；(6)瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，染色、脫色程序簡(jiǎn)單快速。15簡(jiǎn)述電泳的基本操作。一，安裝膜具；裝封膠條，注意封膠條平面朝下，不能有裂口；蓋上凹玻璃；將凹玻璃沖外裝進(jìn)槽里；將楔子插進(jìn)，將底部插緊。二，配制凝膠溶液三，灌膠，加到頂部，來回傾斜去氣泡四，樣品制備。五，加樣：通過電極緩沖液，小心地將樣品

8、加到凝膠凹形樣品槽底部。六，電泳七，剝膠:電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記.八，染色與脫色16.電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。（1）電泳性質(zhì)高度特異性；（2）電泳方法溫和性。17. 常見的不正常電泳現(xiàn)象有：涂抹痕跡；條紋拖尾；條帶變淺；前段指示劑缺失；條帶僅在凝膠頂部；混雜因素等。等電聚焦電泳：18.IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)

9、的等電點(diǎn)位置上，也就是說被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。19.IEFE的特點(diǎn)？答：優(yōu)點(diǎn)：1.分辨率高（精密度可達(dá)0.01pH單位）， 靈敏度高（最低檢出量達(dá)0.1ng）。2.電泳區(qū)帶相當(dāng)狹窄。3.重復(fù)性好。缺點(diǎn)：1.要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀。2.樣品中的成分必須停留在其pI，不適用在pI不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。20. 進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件：有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的pH梯度有一個(gè)抗對(duì)流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通入直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)形成

10、一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，正極附近是低pH區(qū)，負(fù)極附近是高pH區(qū)。21. 理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征：分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；可溶性好；對(duì)280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測(cè)定。簡(jiǎn)述等電聚焦電泳的限制條件。答：（1）要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀； （2）樣品中的成分必須停留在其pI，不適用在pI不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。列舉幾個(gè)等電聚焦電泳的應(yīng)用。答：（1）分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽：區(qū)分人血

11、清蛋白；測(cè)出異常免疫球蛋白；基因分型 （2）測(cè)定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽； （3）雙相電泳中，IEFE作為第一相。理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征有？答：（1）分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離； （2）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定； （3）各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力； （4）在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻； （5）兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多； （6）可溶性好； （7）對(duì)280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測(cè)定。SDS-PAGE22. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）。它是根據(jù)SDS和還原劑將蛋白質(zhì)分子解聚后

12、亞基的大小，在恒定pH（堿性）緩沖系統(tǒng)的分離。主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量。23. SDS電泳的遷移速率主要取決于分子大小，為什么？SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中與SDS分子結(jié)合時(shí)，可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用 。24. SDS的其他作用包括：陰離子去污劑：作為變性劑和助溶性試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑：斷裂二硫鍵。25.樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度十

13、分重要，影響它們結(jié)合的因素主要有三個(gè)：溶液中SDS單體的濃度： SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的是單體。單體的濃度與SDS總濃度，溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)。為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3。樣品緩沖液的離子強(qiáng)度： 因?yàn)镾DS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量?jī)H決定于平衡時(shí)SDS的單體濃度，不是總濃度，而只是在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所以SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，常為10100mmol/L。二硫鍵是否完全被還原 ：只有二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量的結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移

14、率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。樣品緩沖液中的-巰基乙醇的濃度通常為4-5，二硫蘇糖醇的濃度通常為2-3.前者有揮發(fā)性，所以最好在配置樣品前加入。26. 配制凝膠過程中的注意事項(xiàng)： * 凝膠配制過程要迅速, 加速劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。 * 水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡 * 膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面 * 梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平 *剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分27.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖系統(tǒng)的選擇和凝膠濃度的選擇應(yīng)注意什么？緩沖系統(tǒng)的選擇：在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范

15、圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用凝膠濃度的選擇：不同分子質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度28.提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。蛋白溶液中SDS過量會(huì)引起什么變化？答：（1）蛋白質(zhì)本身電荷被屏蔽； （2）氫鍵斷裂； （3）疏水作用被取消； （4）多肽折疊被破壞。試列舉幾個(gè)影響蛋白質(zhì)恢復(fù)活性的因素。答：（1）SDS的純度； （2）蛋白酶； （3）二硫鍵；

16、 （4）蛋白的結(jié)構(gòu)； （5）輔助因子和輔酶。為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？ 答：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。陰離子染料的三個(gè)缺點(diǎn)是什么？答：（1）溶液系統(tǒng)中的甲醇會(huì)引起NC膜皺縮或破壞； （2）不能用于帶正電荷的膜，如尼龍膜，會(huì)使膜本身染色； （3）靈敏度較低。凈電荷：29.蛋白質(zhì)的電泳行為：蛋白質(zhì)的凈電荷是組成它的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)上所有正、負(fù)電荷的總和。等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的物理化學(xué)常數(shù)，與其組成有關(guān)；pH=pI ，蛋白質(zhì)的凈電荷是零。30.電泳槽與凝膠中緩沖液的成分、pH值和

17、離子強(qiáng)度均不相同。使得不連續(xù)電泳過程中有三種物理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)；凝膠的分子篩效應(yīng)；一般電泳分離的電荷效應(yīng)。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 31.不連續(xù)體系對(duì)蛋白的分離作用 樣品的濃縮效應(yīng) A. 凝膠孔徑不連續(xù)性 B. 緩沖體系離子成分的不連續(xù)性 C. pH值的不連續(xù)性 D.電位梯度的不連續(xù)性高效毛細(xì)管電泳分析法HPCE：32.與普通電泳相比，毛細(xì)管電泳有什么優(yōu)點(diǎn)？答：使用細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管，抑制了對(duì)流和減小熱擴(kuò)散；分析速度快；分離效率很高；可使用在線檢測(cè)法；進(jìn)量少。33.毛細(xì)管電泳有什么缺點(diǎn)？答：制備能力差，光學(xué)檢測(cè)器的光路太短，非高靈敏度的檢測(cè)器難以測(cè)出樣品峰；凝膠、色譜填

18、充管需專門的灌制設(shè)備；大的側(cè)面/截面積比能放大吸附作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等的分離效率下降或不出峰，同時(shí)也會(huì)影響分離的重現(xiàn)性。34.高效毛細(xì)管電泳有什么特點(diǎn)？答：儀器簡(jiǎn)單，易自動(dòng)化；分析速度快，分離效率高；操作方便，消耗少；應(yīng)用范圍極廣。35.HPCE中電滲流的流動(dòng)為平流還是塞流？答：塞流。36.HPCE中影響電滲流的因素是什么？答：1）電場(chǎng)強(qiáng)度的影響；2）毛細(xì)管材料的影響；3）電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響；4）溫度的影響；5）添加劑的影響37.改變電滲流方向的方法？答：（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)； （2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑，內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。

19、電滲流流向陽(yáng)極。38.電內(nèi)滲的利弊是什么? 答：（1）利：對(duì)流電泳中增加陽(yáng)離子大分子的分辨率。 （2）弊：高電內(nèi)滲時(shí)阻礙大分子的遷移，耗時(shí)長(zhǎng)。39.HPCE中電滲流的作用是什么？答：（1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離； （2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速； （3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性。40.HPCE中影響電滲流的因素有哪些？答：（1）電場(chǎng)強(qiáng)度的影響，電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。 （2）毛細(xì)管材料的影響，不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同。 （3）電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響：

20、（1）溶液pH的影響；（2）陰離子的影響。 （4）溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”。 （5）添加劑的影響。41. 簡(jiǎn)述毛細(xì)管電泳基本工作原理：溶液中的帶電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。42.高效毛細(xì)管電泳分析在技術(shù)上采取了哪兩項(xiàng)重要改進(jìn)？一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。蛋白質(zhì)印跡43.敘述什么是蛋白質(zhì)印跡，且簡(jiǎn)述其優(yōu)勢(shì)。答：（1）定義：把電泳或色譜分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，再對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析的方法

21、。 （2）優(yōu)勢(shì)： 一旦轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，Pr比在凝膠中容易接近探針，且?guī)缀跛斜晦D(zhuǎn)移的Pr 都有相同的機(jī)會(huì)接觸探針； 轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上的Pr帶在探測(cè)過程中不會(huì)因擴(kuò)散而失去分辨率； Pr轉(zhuǎn)移到膜上后能進(jìn)行多種分析，能得到多份結(jié)果； 印跡法只需很少試劑（ng級(jí)），處理時(shí)間相對(duì)短，固定化膜容易操作和保存。 蛋白質(zhì)印跡法是高分辨電泳和靈敏、專一的免疫探測(cè)技術(shù)的結(jié)合！ 蛋白質(zhì)印跡法中分析蛋白質(zhì)時(shí)使用的探針： 用針對(duì)蛋白質(zhì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針； 通常使用抗體做探針； 抗體與附著于固定基質(zhì)上的靶蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)免疫印跡； 免疫印跡實(shí)現(xiàn)了高靈敏和特異性的結(jié)合。44.什么是電泳印記？答：生物大分子物質(zhì)（如核酸或蛋白質(zhì)）印跡到固相載體上經(jīng)封