生物負(fù)載測(cè)定

1、微生物的定義和分類微生物的定義和分類 原核類原核類：細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)細(xì)胞：細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)細(xì)胞 立克次氏體、衣原體立克次氏體、衣原體 微生物微生物 真核類真核類：真菌：真菌( (酵母菌、霉菌）、原生動(dòng)物、酵母菌、霉菌）、原生動(dòng)物、 顯微藻類顯微藻類 非細(xì)胞類非細(xì)胞類：病毒、類病毒、朊病毒：病毒、類病毒、朊病毒 1 1 定義：定義： 一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱。一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱。 細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)顯微鏡檢照片細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)顯微鏡檢照片 放大放大10001000倍桿菌倍桿菌 放大放大10001000倍球菌倍球菌 2 2 微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖微生物細(xì)胞

2、結(jié)構(gòu)示意圖 細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖 真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖 3 3 微生物的五大共性微生物的五大共性 1 1、體積小，面積大、體積小，面積大 巨大的營(yíng)養(yǎng)吸收面、代謝廢物的排泄面和環(huán)境信息的接受面巨大的營(yíng)養(yǎng)吸收面、代謝廢物的排泄面和環(huán)境信息的接受面 2 2、吸收多，轉(zhuǎn)化快、吸收多，轉(zhuǎn)化快 高速生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，活的化工廠高速生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，活的化工廠。 3 3、生產(chǎn)旺，繁殖快、生產(chǎn)旺，繁殖快 大腸埃希菌大腸埃希菌20min20min分裂分裂1 1次，次，4848小時(shí)后的重量則達(dá)到地球的小時(shí)后的重量則達(dá)到地球的 40004000倍。倍。 注：因營(yíng)養(yǎng)條件的限制，實(shí)際不可能發(fā)生。注：因營(yíng)養(yǎng)條

3、件的限制，實(shí)際不可能發(fā)生。 4 4、適應(yīng)強(qiáng)，易變異、適應(yīng)強(qiáng)，易變異 極端環(huán)境的驚人適應(yīng)能力極端環(huán)境的驚人適應(yīng)能力 5 5、分布廣，種類多、分布廣，種類多 空氣、水體、土壤、動(dòng)植物都有分布，微生物有空氣、水體、土壤、動(dòng)植物都有分布，微生物有1010多萬(wàn)種。多萬(wàn)種。 4 4 微生物的存在對(duì)醫(yī)療器械的影響微生物的存在對(duì)醫(yī)療器械的影響 活的微生物對(duì)滅菌影響活的微生物對(duì)滅菌影響 非過(guò)度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負(fù)載增加，滅菌非過(guò)度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負(fù)載增加，滅菌 難度加大，可能導(dǎo)致滅菌失敗。難度加大，可能導(dǎo)致滅菌失敗。 活的微生物對(duì)使用者危害活的微生物對(duì)使用者危害 滅菌不徹底的無(wú)菌醫(yī)療醫(yī)療器械，

4、根據(jù)使用方式的不滅菌不徹底的無(wú)菌醫(yī)療醫(yī)療器械，根據(jù)使用方式的不 同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應(yīng)。同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應(yīng)。 微生物尸體對(duì)使用者的危害微生物尸體對(duì)使用者的危害 典型例子：典型例子：G G- -菌細(xì)胞壁脂多糖成分菌細(xì)胞壁脂多糖成分( (內(nèi)毒素內(nèi)毒素) )通過(guò)輸液通過(guò)輸液 進(jìn)入人體血液，致使人體發(fā)熱。進(jìn)入人體血液，致使人體發(fā)熱。 5 5 基本概念基本概念 生物負(fù)載的定義生物負(fù)載的定義 一件產(chǎn)品和一件產(chǎn)品和/ /或或無(wú)菌屏障無(wú)菌屏障上或其中存活的微生物總數(shù)。上或其中存活的微生物總數(shù)。 對(duì)滅菌來(lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)為無(wú)菌屏障內(nèi)的所有微生物。對(duì)滅菌來(lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)為無(wú)菌屏障內(nèi)的所有

5、微生物。 因?yàn)?，滅菌需要?dú)缙琳蟽?nèi)的所有微生物。因?yàn)?，滅菌需要?dú)缙琳蟽?nèi)的所有微生物。 對(duì)使用來(lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)為產(chǎn)品與人體的接觸面，因?qū)κ褂脕?lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)為產(chǎn)品與人體的接觸面，因 為屏障通常不與人的自然腔道、血管、肌肉等接觸。為屏障通常不與人的自然腔道、血管、肌肉等接觸。 對(duì)生產(chǎn)過(guò)程控制來(lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)是屏障內(nèi)所有的微對(duì)生產(chǎn)過(guò)程控制來(lái)說(shuō)：生物負(fù)載應(yīng)是屏障內(nèi)所有的微 生物，反映過(guò)程的控制水平。生物，反映過(guò)程的控制水平。 6 6 基本概念基本概念 校正因子校正因子correction factorcorrection factor 用于補(bǔ)償無(wú)法從產(chǎn)品和用于補(bǔ)償無(wú)法從產(chǎn)品和/ /或微生物培養(yǎng)中完全

6、采集的數(shù)值?；蛭⑸锱囵B(yǎng)中完全采集的數(shù)值。 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 culture conditionsculture conditions 促進(jìn)微生物復(fù)蘇、生長(zhǎng)和促進(jìn)微生物復(fù)蘇、生長(zhǎng)和/ /或繁殖所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式。或繁殖所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式。 回收率回收率 recovery efficiency recovery efficiency 用一特定技術(shù)從產(chǎn)品上采集和用一特定技術(shù)從產(chǎn)品上采集和/ /或培養(yǎng)微生物能力的測(cè)定值?；蚺囵B(yǎng)微生物能力的測(cè)定值。 樣品份額（樣品份額（SIPSIP） sample item portion sample item portion 從某一產(chǎn)品單元上取出的用于

7、試驗(yàn)的部分從某一產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。 7 7 產(chǎn)品選擇產(chǎn)品選擇的基本原則的基本原則 選擇和處理用于生物負(fù)載測(cè)定的產(chǎn)品的程序，應(yīng)能確保所選擇和處理用于生物負(fù)載測(cè)定的產(chǎn)品的程序，應(yīng)能確保所 選產(chǎn)品對(duì)包括包裝材料和過(guò)程的常規(guī)生產(chǎn)具有代表性。選產(chǎn)品對(duì)包括包裝材料和過(guò)程的常規(guī)生產(chǎn)具有代表性。 若為若為生物負(fù)載測(cè)定的目的對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分類生物負(fù)載測(cè)定的目的對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分類，應(yīng)記錄每一分，應(yīng)記錄每一分 類內(nèi)包含這一產(chǎn)品的理由。理由應(yīng)包含所選產(chǎn)品在是整個(gè)類內(nèi)包含這一產(chǎn)品的理由。理由應(yīng)包含所選產(chǎn)品在是整個(gè) 分類里具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)。分類里具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)。 由于生物負(fù)載測(cè)定易受時(shí)間推由于生物負(fù)載測(cè)定易受時(shí)間

8、推 移的影響而改變，應(yīng)考慮生物移的影響而改變，應(yīng)考慮生物 負(fù)載測(cè)定的取樣時(shí)限。負(fù)載測(cè)定的取樣時(shí)限。 8 8 部分液體產(chǎn)品可能部分液體產(chǎn)品可能 存在支持微生物生存在支持微生物生 長(zhǎng)的現(xiàn)象長(zhǎng)的現(xiàn)象 SIPSIP取樣的基本要求取樣的基本要求 如果已驗(yàn)證生物負(fù)載在本產(chǎn)如果已驗(yàn)證生物負(fù)載在本產(chǎn) 品上或內(nèi)是均勻分布的，則品上或內(nèi)是均勻分布的，則 SIPSIP可以是該產(chǎn)品的任何部分可以是該產(chǎn)品的任何部分。 否則，樣品應(yīng)包含能代表所否則，樣品應(yīng)包含能代表所 制產(chǎn)品的每種相應(yīng)材質(zhì)而隨制產(chǎn)品的每種相應(yīng)材質(zhì)而隨 機(jī)選取的產(chǎn)品部位。機(jī)選取的產(chǎn)品部位。 若已知生物負(fù)載分布，可以若已知生物負(fù)載分布，可以 從認(rèn)為對(duì)滅菌工藝

9、最有嚴(yán)峻從認(rèn)為對(duì)滅菌工藝最有嚴(yán)峻 挑戰(zhàn)的產(chǎn)品部分選擇挑戰(zhàn)的產(chǎn)品部分選擇SIPSIP。 9 9 SIP選擇選擇產(chǎn)品產(chǎn)品 表面積表面積植入物（不可吸收）植入物（不可吸收） 質(zhì)量質(zhì)量 粉粉末末 手術(shù)服手術(shù)服 植入物（可吸收）植入物（可吸收） 長(zhǎng)度長(zhǎng)度管路（直徑一致）管路（直徑一致） 體積體積流流體體 生物負(fù)載的測(cè)定生物負(fù)載的測(cè)定 測(cè)定方法 微生物的采集微生物的采集 （洗脫系數(shù)洗脫系數(shù)） 采集微生物的技術(shù)能力采集微生物的技術(shù)能力 （追求合適的采集技術(shù)）（追求合適的采集技術(shù)） 微生物的可能種類和微生物的可能種類和 它們?cè)诋a(chǎn)品上的位置它們?cè)诋a(chǎn)品上的位置 采集技術(shù)對(duì)微生物活性的影響采集技術(shù)對(duì)微生物活性的影響

10、 （避免采集技術(shù)對(duì)微生物的傷害）（避免采集技術(shù)對(duì)微生物的傷害） 檢測(cè)時(shí)產(chǎn)品的物理或化學(xué)特性檢測(cè)時(shí)產(chǎn)品的物理或化學(xué)特性 （確認(rèn)：抑菌物質(zhì)存在與否，如何去除）（確認(rèn)：抑菌物質(zhì)存在與否，如何去除） 微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) （培養(yǎng)系數(shù)修正培養(yǎng)系數(shù)修正） 微生物計(jì)數(shù)微生物計(jì)數(shù) 1010 生物負(fù)載的微生物鑒定生物負(fù)載的微生物鑒定 鑒定的意義鑒定的意義 通過(guò)微生物的鑒定，了解微生物的基本來(lái)源，為日常微生通過(guò)微生物的鑒定，了解微生物的基本來(lái)源，為日常微生 物的控制提供依據(jù)；滅菌工藝的的適合性提供依據(jù)（是否物的控制提供依據(jù)；滅菌工藝的的適合性提供依據(jù)（是否 存在耐受特定滅菌因子的芽孢菌的存在）。存在耐受特定滅

11、菌因子的芽孢菌的存在）。 通常鑒定的方法通常鑒定的方法 常規(guī)鑒定常規(guī)鑒定：染色特性；細(xì)胞形態(tài)；菌落；選擇性培養(yǎng)的使染色特性；細(xì)胞形態(tài)；菌落；選擇性培養(yǎng)的使 用；生化特性；用；生化特性； 分子水平鑒定分子水平鑒定：DNADNA測(cè)序后與測(cè)序后與數(shù)據(jù)庫(kù)提供遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)提供遺傳序列比對(duì)比對(duì)。 1111 生物負(fù)載測(cè)定方法的確認(rèn)生物負(fù)載測(cè)定方法的確認(rèn) 若測(cè)定方法中包括采集產(chǎn)品上微生物，則對(duì)該技術(shù)適當(dāng)性若測(cè)定方法中包括采集產(chǎn)品上微生物，則對(duì)該技術(shù)適當(dāng)性 的評(píng)價(jià)；的評(píng)價(jià)； 確定回收率確定回收率, ,以便得到修正系數(shù)；以便得到修正系數(shù)； 液體類的產(chǎn)品非常便捷液體類的產(chǎn)品非常便捷, ,通常不需要回收率通常不需要

12、回收率. . 對(duì)包括培養(yǎng)條件和微生物計(jì)數(shù)技術(shù)在內(nèi)的微生物計(jì)數(shù)適當(dāng)對(duì)包括培養(yǎng)條件和微生物計(jì)數(shù)技術(shù)在內(nèi)的微生物計(jì)數(shù)適當(dāng) 性的評(píng)價(jià)；性的評(píng)價(jià)； 不是所有的微生物可以通過(guò)單一培養(yǎng)基能有效培養(yǎng)出來(lái)的。不是所有的微生物可以通過(guò)單一培養(yǎng)基能有效培養(yǎng)出來(lái)的。 微生物鑒定技術(shù)適合性的評(píng)價(jià)。微生物鑒定技術(shù)適合性的評(píng)價(jià)。 1212 常規(guī)測(cè)定和數(shù)據(jù)判讀常規(guī)測(cè)定和數(shù)據(jù)判讀 確定確定樣品大小和取樣頻率。樣品大小和取樣頻率。 測(cè)定方法要規(guī)定測(cè)定方法要規(guī)定, ,并形成作業(yè)指導(dǎo)書(shū)并形成作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 根據(jù)生物負(fù)載的使用目的確定鑒定的程度根據(jù)生物負(fù)載的使用目的確定鑒定的程度, ,通常鑒定是否存在芽孢通常鑒定是否存在芽孢 生物負(fù)載數(shù)據(jù)

13、用于確定滅菌工藝的處理程度，則生物負(fù)載數(shù)據(jù)用于確定滅菌工藝的處理程度，則根據(jù)具體要求進(jìn)行根據(jù)具體要求進(jìn)行應(yīng)應(yīng) 滿足滅菌工藝設(shè)定、驗(yàn)證和常規(guī)控制特定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的關(guān)于生物負(fù)載滿足滅菌工藝設(shè)定、驗(yàn)證和常規(guī)控制特定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的關(guān)于生物負(fù)載 數(shù)據(jù)使用的切實(shí)可行的要求。數(shù)據(jù)使用的切實(shí)可行的要求。 規(guī)定規(guī)定醫(yī)療器械上或醫(yī)療器械上或屏障內(nèi)屏障內(nèi)的生物負(fù)載的可接受限量。的生物負(fù)載的可接受限量。中國(guó)有中國(guó)有GB15980-GB15980- 19951995的標(biāo)準(zhǔn)，但未有明確的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。如果生物負(fù)載的信息用于設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，但未有明確的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。如果生物負(fù)載的信息用于設(shè)定 滅菌條件，則限量比較好設(shè)定。滅菌條件，則限量比

14、較好設(shè)定。 根據(jù)根據(jù)一段時(shí)間得到的生物負(fù)載測(cè)定數(shù)據(jù)來(lái)確定趨勢(shì)一段時(shí)間得到的生物負(fù)載測(cè)定數(shù)據(jù)來(lái)確定趨勢(shì)，進(jìn)行趨勢(shì)管理，進(jìn)行趨勢(shì)管理。 1313 生物負(fù)載測(cè)定方法的維持 產(chǎn)品和/或生產(chǎn)過(guò)程的改變 通常重新進(jìn)行回收率的測(cè)試或生物負(fù)載的測(cè)試。 生物負(fù)載測(cè)定方法的改變 應(yīng)對(duì)生物負(fù)載測(cè)定常規(guī)方法的任何變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。 評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的變化的影響； 設(shè) 新的回收率。 先前進(jìn)行的確認(rèn)和回收率是否仍有效。 生物負(fù)載測(cè)定方法的重新確認(rèn) 1414 重復(fù)回收重復(fù)回收確定回收率確定回收率 重復(fù)回收進(jìn)行重復(fù)回收進(jìn)行回收率回收率確認(rèn)確認(rèn) 使用自然的產(chǎn)品，初次采集的微生物數(shù)值占連續(xù)多次采集使用自然的產(chǎn)品，初次采集的微生物數(shù)值占連

15、續(xù)多次采集 總數(shù)值的比值?？倲?shù)值的比值。 方法的理論基礎(chǔ)方法的理論基礎(chǔ) 生物負(fù)載的確認(rèn)方法應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，直到回收的微生物累計(jì)生物負(fù)載的確認(rèn)方法應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，直到回收的微生物累計(jì) 數(shù)量沒(méi)有明顯增加。每重復(fù)一次后，從產(chǎn)品上或產(chǎn)品部分?jǐn)?shù)量沒(méi)有明顯增加。每重復(fù)一次后，從產(chǎn)品上或產(chǎn)品部分 上洗脫液全部回收并計(jì)數(shù)。比較連續(xù)回收得到的累計(jì)結(jié)果。上洗脫液全部回收并計(jì)數(shù)。比較連續(xù)回收得到的累計(jì)結(jié)果。 注意注意：本方法未必精確。產(chǎn)品上回收的微生物數(shù)量及實(shí)際存在的微生本方法未必精確。產(chǎn)品上回收的微生物數(shù)量及實(shí)際存在的微生 物數(shù)量之間的確切關(guān)系永遠(yuǎn)無(wú)法驗(yàn)證物數(shù)量之間的確切關(guān)系永遠(yuǎn)無(wú)法驗(yàn)證。 1515 重復(fù)回收重復(fù)回收確定

16、回收率確定回收率 產(chǎn)品要求 本身具有一定的微生物負(fù)載水平，如果產(chǎn)品本身負(fù)載水平低，則不適 合采用該方法，應(yīng)采用產(chǎn)品人工接種法。 重復(fù)采集的次數(shù) 準(zhǔn)確的重復(fù)次數(shù)通常取決于 產(chǎn)品特性，構(gòu)成生物負(fù)載的微生物和初始 污染水平等。預(yù)試驗(yàn)可用于確定重復(fù)的次數(shù)。 在某些產(chǎn)品上，進(jìn)行重復(fù)處理后有必要確定產(chǎn)品上是否還存在存活微 生物。這可以通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)： 用熔化的回收培養(yǎng)基涂在產(chǎn)品表面上，讓培養(yǎng)基變硬，然后使產(chǎn)品在 規(guī)定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)形成的菌落計(jì)數(shù)。 將產(chǎn)品浸于液體回收培養(yǎng)基中，在規(guī)定的培養(yǎng)條件下，檢查是否生長(zhǎng)。 浸于液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)后，若產(chǎn)品中的一小部分出現(xiàn)存活的微生物， 可通過(guò)MPN方法來(lái)計(jì)數(shù)結(jié)果

17、。但是若全部結(jié)果都表明有微生物生長(zhǎng)， 則不能采用MPN法，應(yīng)重新考慮確認(rèn)方法。 1616 重復(fù)回收的修正系數(shù) 1717 處理處理 產(chǎn)品數(shù)產(chǎn)品數(shù) 12345 16050705545 21012523 310200 401001 瓊脂覆蓋21210 總的菌落計(jì)數(shù)7364795349 第一次處理：6050705545 總數(shù)：7364795849 第一次處理的回收率：82%78%89%95%92% 第一次處理后的平均回收率： = 87.2 %范圍= 78%95% 計(jì)算中已包括了瓊脂覆蓋得到的菌落數(shù)。某些醫(yī)療器械可能會(huì)無(wú)法應(yīng)用瓊脂覆蓋。 運(yùn)用首次處理后平均回收率，運(yùn)用首次處理后平均回收率， 回收效率的修

18、正系數(shù)可為：回收效率的修正系數(shù)可為： 15. 1 2 .87 100 有些應(yīng)用中可使用平均回收率范圍的最低值，以反應(yīng)出最壞情況。有些應(yīng)用中可使用平均回收率范圍的最低值，以反應(yīng)出最壞情況。 這一決定將會(huì)影響數(shù)據(jù)的使用。這一決定將會(huì)影響數(shù)據(jù)的使用。 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品上人工接種微生物后，初次采集的微生物數(shù)量占 接種 到產(chǎn)品上的微生物的比值?？蔀槊恳划a(chǎn)品計(jì)算百分率，并 用其確立回收率。 產(chǎn)品的要求 產(chǎn)品首先應(yīng)進(jìn)行適合的滅菌，并確保可能對(duì)微生物有抑制 的滅菌介質(zhì)的有效去除。 如用EO滅菌時(shí)，則應(yīng)驗(yàn)證殘留水平是否存在對(duì)微生物的抑 制作

19、用。 1818 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 接種的微生物 最常用 需氧菌芽孢接種，因?yàn)槭褂眉?xì)菌繁殖體時(shí)，常因干 燥失去活性，所以通常不使用繁殖體。 芽孢懸液分布在產(chǎn)品上，應(yīng)包括最難洗脫 的部位。 但應(yīng)注意為了刻意追求WORST CASE，將芽 孢全部接種在最難的位置，導(dǎo)致回收率過(guò) 低的異常。 1919 接種法的修正系數(shù)接種法的修正系數(shù) 制備懸液稀釋液，每0.1mL中含有100個(gè)芽孢。向器械所選 部分接種0.1mL該稀釋懸液，并在單項(xiàng)流狀態(tài)下干燥。 注意接種體積，體積過(guò)大不易干燥；體積過(guò)小，則分布不 均勻。 使經(jīng)接種的產(chǎn)品經(jīng)受得住所選采集技術(shù)，采集的平均芽孢 數(shù)是35，其范圍為25

20、45之間。 回收率的修正系數(shù)如下： 2020 9 . 2 35 100 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 袋蠕動(dòng) 將試驗(yàn)樣品和一已知體積的洗脫液裝在一個(gè)無(wú)菌胃型袋 中。開(kāi)動(dòng)往復(fù)式攪棒，使洗脫液貫穿試驗(yàn)樣品內(nèi)外。 應(yīng)規(guī)定處理時(shí)間。 該方法尤其適用于軟質(zhì)、纖維和/或吸附性材料，但可能 不適用于能刺破袋的任何材質(zhì)（如帶針或含有堅(jiān)硬部分的 器械）。 若使用了較大大量的洗脫液，可能會(huì)生成含有低濃度微生 物的懸浮液。可使用膜過(guò)濾法濾掉洗脫液。 2121 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 超聲波洗脫 將試驗(yàn)樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當(dāng)容器中。將容器連同內(nèi)裝 物一起在超聲波清洗器中進(jìn)行處理

21、，或?qū)⒊暡ㄌ筋^浸入到容器內(nèi)洗 脫液中進(jìn)行處理。超聲波也能使微生物失去活性，尤其是大能量傳輸 時(shí)，使用超聲波探頭會(huì)比超聲波清洗器更有可能使其失去活性。根據(jù) 要求應(yīng)驗(yàn)證超聲法。 應(yīng)規(guī)定超聲處理的常規(guī)頻率和處理時(shí)間。而且，還應(yīng)規(guī)定試驗(yàn)樣品在 超聲波清洗器中的安放位置。應(yīng)注意限制同時(shí)進(jìn)行處理的試驗(yàn)樣品數(shù) 量，以便阻斷超聲處理源。 該方法尤其適用于不透液體的固體試驗(yàn)樣品以及形狀復(fù)雜的產(chǎn)品。該 方法對(duì)某些醫(yī)療器械可能產(chǎn)生破壞作用，尤其是對(duì)帶有電子部件的器 械，如植入式脈沖發(fā)生器。 超聲處理能量和超聲處理持續(xù)時(shí)間不應(yīng)太強(qiáng)或太長(zhǎng)，以免破壞微生物 并導(dǎo)致死亡，或是使洗脫液過(guò)熱。 2222 微生物采集技術(shù)和設(shè)備

22、微生物采集技術(shù)和設(shè)備 振搖（機(jī)械或手工方式） 將試驗(yàn)樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當(dāng)容器中，并用 機(jī)械振動(dòng)器（如往復(fù)式、軌道或機(jī)械腕搖床）進(jìn)行振搖。 也可用手工振搖，但其效力會(huì)因操作人員而異。 應(yīng)規(guī)定振搖時(shí)間和頻率。 可以加入一定大小的玻璃微珠增加表面磨損以及由此提高 回收效率。加入的玻璃微珠的大小以及振搖時(shí)間和頻率不 能導(dǎo)致過(guò)熱和/或?qū)ξ⑸镌斐煽赡艿钠茐摹?增加玻璃微珠將增加微生物可附著的表面積。 2323 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 渦旋混合 將試驗(yàn)樣品浸入裝有已知體積洗脫液的密閉容器內(nèi)，該容器壓在放置 在旋渦混合器的旋轉(zhuǎn)墊以形成渦旋。渦旋的形成取決于手動(dòng)施加的壓 力。渦旋

23、中的變化會(huì)使微生物洗脫產(chǎn)生差異。 應(yīng)規(guī)定所用容器、混合時(shí)間以及設(shè)定的混合器的速度。 該方法操作簡(jiǎn)單快捷，但僅適用于小的試驗(yàn)樣品。 沖洗 讓洗脫液通過(guò)試驗(yàn)樣品的內(nèi)腔。可以靠重力或泵來(lái)使液體流動(dòng)。另外 也可將洗脫液充入產(chǎn)品中，夾住并抖動(dòng)。 應(yīng)規(guī)定器械與洗脫液的接觸時(shí)間、沖洗速度及液體體積。 器械結(jié)構(gòu)及腔體尺寸會(huì)限制從內(nèi)表面完全移除微生物所必須的沖力。 2424 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 攪切（碎裂） 將試驗(yàn)樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當(dāng)容器內(nèi)。在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)攪切或振搖試 驗(yàn)樣品的時(shí)間。 根據(jù)試驗(yàn)樣品和攪切器來(lái)規(guī)定攪切時(shí)間，但不應(yīng)超過(guò)會(huì)導(dǎo)致洗脫液過(guò)熱和對(duì)微生物造成 破壞。 該技

24、術(shù)提供了將試驗(yàn)樣品分成足夠小的部分的方法，以便通過(guò)接種平板培養(yǎng)技術(shù)對(duì)微生 物進(jìn)行計(jì)數(shù)。 擦拭 含有吸附性材料的棉拭子通常被固定于桿或把手上。樣品材料可以是可溶性的或不可溶 性的。 通常使用的方法是用洗脫液濕潤(rùn)棉拭子，并用棉拭子擦拭界定好的試驗(yàn)樣品的表面。在 有些情況下，可以先潤(rùn)濕表面，然后用干棉拭子擦拭，這樣可提高回收效率。然后將 棉拭子轉(zhuǎn)放至洗脫液中，并攪動(dòng)從棉拭子上洗脫微生物。另外，若使用的是可溶性棉 拭，拭子會(huì)溶解到稀釋液中。 擦拭法是對(duì)不規(guī)則形狀產(chǎn)品或難接近的區(qū)域取樣的一個(gè)有效的方法。該方法也可用于大 面積區(qū)域的取樣。 該方法會(huì)因擦拭方式的不同而更易出錯(cuò)。而且，通過(guò)擦拭不可能將表面上的

25、全部微生物 都收集起來(lái)。有些微生物會(huì)被棉拭子本身吸附，以致于被檢測(cè)不到。 棉拭子中不應(yīng)含有滅菌劑或抑菌劑。 2525 洗脫液體 2626 溶液水中的濃度應(yīng)用 緩沖蛋白胨水0.067 mol/L磷酸鹽； 0.43 % 氯化鈉； 0.1 % 蛋白胨； 通用 六偏磷酸鈉林格氏溶液 1/4 強(qiáng)度溶解海藻酸鈣拭子 蛋白胨水 0.1 %1.0%通用 磷酸鹽緩沖溶液0.02 mol/L磷酸鹽；0.9 %氯化鈉；通用 林格氏溶液1/4 強(qiáng)度通用 氯化鈉0.25 %0.9 %通用 硫代硫酸鹽林格氏溶液1/4 強(qiáng)度中和余氯 水稀釋含水樣品； 計(jì)數(shù)前制備可溶材料的等滲壓溶液； %此表并未包括全部。表面活性劑，如聚山

26、梨醇酯（Tween）80可以添加到洗脫液和稀釋液中。根據(jù)具體的應(yīng)用，通常濃度在0.01%0.1%之間。應(yīng)使用適 當(dāng)濃度的表面活性劑，并加以特殊處理以防止泡沫形成。 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 接觸板 接觸板或玻璃片可用凝固的培養(yǎng)基放在樣品表面上，使存活的微生物 能附著到該培養(yǎng)基的表面，然后再培養(yǎng)接觸板或玻璃片，至形成可計(jì) 數(shù)的菌落。 該方法優(yōu)點(diǎn)在于使用方便。結(jié)果與凝固培養(yǎng)基的接觸表面直接相關(guān)。 表面上自然集聚的細(xì)胞群、菌落在瓊脂表面散布、瓊脂干燥、可能存 在厭氧菌等都是潛在的不利因素。 由于該方法的回收率通常較低，所以只有在其它方法不適用的情況下 才使用。接觸板和玻璃片通常只適用

27、于平的或規(guī)則的表面。 瓊脂覆蓋 當(dāng)生物負(fù)載低以及產(chǎn)品構(gòu)造適合時(shí)，在產(chǎn)品的表面涂上熔化的瓊脂培 養(yǎng)基（最高溫度在45），培養(yǎng)至產(chǎn)生可見(jiàn)菌落。 表面上自然集聚的細(xì)胞群、菌落在瓊脂表面散布、瓊脂干燥、可能存 在厭氧菌等都是潛在的不利因素。 2727 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 最大可能數(shù)（MPN法） MPN法是一種沿用已久并有充分文獻(xiàn)根據(jù)，用于估算在產(chǎn)品內(nèi)隨機(jī)分布的存活微生物數(shù)量的方法。 它主要用于食品和水產(chǎn)品等行業(yè)（與液體、粉末和半固體的產(chǎn)品或者原材料一起使用）。這種方法 尤其適用于生物負(fù)載平均數(shù)低的產(chǎn)品。 這種方法包括（按體積或者重量）對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行重復(fù)取樣，其中每次取樣的樣品中均含有

28、相同數(shù)量的 可存活微生物（因而要求分布的隨機(jī)性），然后通過(guò)將樣品轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)，單獨(dú)記下有可 存活微生物存在的每個(gè)樣品。當(dāng)具有足量的洗脫液，可將其一系列的稀釋液接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中， 使部分接種的培養(yǎng)基在隨后的培養(yǎng)中不產(chǎn)生可見(jiàn)生長(zhǎng)。用表現(xiàn)出生長(zhǎng)的稀釋度，估算出樣品中或產(chǎn) 品取樣的絕大部分中存在的存活微生物的數(shù)量；關(guān)于此估算值，95%的可信區(qū)間是相對(duì)寬的。該估 算和其置信界限來(lái)自MPN表格（DeMan18），此表是在一定的假設(shè)條件下編制的，即根據(jù)泊松分布 原理，重復(fù)取樣樣品中存在的可存活微生物的數(shù)量是圍繞一個(gè)平均數(shù)量分布的。 MPN方法應(yīng)用的關(guān)鍵要求是微生物總數(shù)在整個(gè)（研究中的）產(chǎn)品上隨機(jī)分

29、布。因此，對(duì)于液體用的 醫(yī)療器械、黏性液體、粉末，或在單一產(chǎn)品使用如洗脫液等液體估算生物負(fù)載的情況下，MPN方法 可以有生物負(fù)載測(cè)定值。但是，這種方法并不普遍適用于在固體醫(yī)療器械上的生物負(fù)載測(cè)定。典型 的情況是，在這些器械上構(gòu)成低平均值生物負(fù)載的若干微生物的分布通常是隨機(jī)的，一個(gè)總數(shù)的微 生物總是有高比例的不可檢測(cè)的有機(jī)物和少量的帶“峰值”的微生物（實(shí)質(zhì)構(gòu)成平均值生物負(fù)載） 。在MPN的應(yīng)用中，“峰值”將會(huì)被簡(jiǎn)單地記錄為一個(gè)正值，因而，只以公式化的方式構(gòu)成此平均 值，而不是用數(shù)字表示。這可能導(dǎo)致對(duì)生物負(fù)載估計(jì)過(guò)低，而得出一個(gè)不符合要求的結(jié)果。 MPN法易于操作，并且該方法是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)，所以它更

30、適用于一般性評(píng)估而不是精確測(cè)定。 2828 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 膜過(guò)濾法 洗脫液過(guò)濾后，將濾器放到適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行 培養(yǎng)，形成可見(jiàn)菌落，是對(duì)存活微生物計(jì)數(shù)的一 種有效方法。通常，孔徑不大于0.45的過(guò)濾器適 于采集微生物。 對(duì)含有類似纖維狀產(chǎn)品殘留物等微粒的洗脫液進(jìn) 行膜過(guò)濾可能比較困難，因微粒會(huì)阻塞過(guò)濾器。 膜過(guò)濾法更適用于微生物濃度較低的懸液。 2929 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 平板傾注 使用平板傾注技術(shù)，將一定量的懸浮液在在約45的溫度與融化的瓊 脂相混合，然后傾注到平板放至凝固。對(duì)平板進(jìn)行培養(yǎng)至菌落形成并 進(jìn)行計(jì)數(shù)。 平板涂抹 平板涂抹技術(shù)是用

31、涂抹器將一定量懸液涂在固體營(yíng)養(yǎng)基表面。 螺旋涂板 螺旋涂板技術(shù)運(yùn)用自動(dòng)裝置將一定量微生物懸液涂在固體培養(yǎng)基表面 上。懸液涂抹是以遞減的速度從培養(yǎng)板中心以螺旋線軌跡向周邊運(yùn)動(dòng) 。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，對(duì)全板或部分板，運(yùn)用專用的計(jì)數(shù)柵和計(jì)數(shù)技術(shù)來(lái)統(tǒng) 計(jì)原始懸液中的存活微生物數(shù)量。 3030 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 檢測(cè)微生物的其它方法 估計(jì)生物負(fù)載時(shí)還可使用菌落計(jì)算以外的其他方法。這包 括測(cè)定新陳代謝物的活性（例如：新陳代謝物測(cè)定或落射 表面熒光）。這些方法稱為“間接法”，為了建立起與以 往確定的存活微生物數(shù)量的關(guān)系，它們必須對(duì)照菌落計(jì)數(shù) 進(jìn)行校準(zhǔn)。這些技術(shù)的一個(gè)主要限制就是需要相對(duì)較高的

32、 微生物數(shù)懸浮在樣品洗脫液中。一般來(lái)說(shuō)，所檢測(cè)到的微 生物數(shù)量的下限超過(guò)100 CFU。 3131 微生物鑒定（一） 微生物鑒定的方式和意義微生物鑒定的方式和意義 方式方式 形態(tài)鑒定、培養(yǎng)及生理特征、生化特征、 核酸特征鑒定 數(shù)值鑒定和自動(dòng)鑒定 意義意義 從鑒別污染微生物可了解潔凈室清潔，消毒步驟的效性，特別是對(duì)消 毒劑有效性評(píng)估有所幫助。微生物鑒別的結(jié)果也對(duì)調(diào)查污染的來(lái)源有 參考價(jià)值。 3232 常用的微生物操作技術(shù) 接種：將含有或可能含有微生物的樣品或培養(yǎng)物，種入培 養(yǎng)基的技術(shù)方法。 斜面培養(yǎng)基接種法、半固體培養(yǎng)基接種法、液體培養(yǎng)基接 種法、平板培養(yǎng)基接種法。 分離：使用一定的分離技術(shù)，將

33、混雜存在的微生物盡可能 在培養(yǎng)基中分開(kāi)并且生長(zhǎng)，從而獲得單一的一種菌株的方 法。 劃線分離法、涂布分離法、傾注分離法 培養(yǎng)：通常接種后的培養(yǎng)基都要在適宜的環(huán)境中條件下進(jìn) 行培養(yǎng)。主要是溫度、濕度、培養(yǎng)時(shí)間 ，特別是氧氣和二 氧化碳的需求。 需氧培養(yǎng)法、厭氧培養(yǎng)法、微需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng) 法 3333 常用的微生物操作技術(shù) 染色： 原因：微生物細(xì)胞含水量一般為80%90%，菌細(xì)胞對(duì)光的吸收和反射 與水溶液相近，在光學(xué)顯微鏡下，菌體透明，與背景幾乎無(wú)差別，故 常借助染色使菌體吸著染料產(chǎn)生與背景較明顯的差別。 常用細(xì)菌染色法 單染色法：僅使用一種染料，只能觀察形態(tài)和排列 復(fù)染色法：革蘭染色法，可

34、將全部細(xì)菌分成2類，革蘭陽(yáng)性菌、革蘭 陰性菌。 芽孢染色法：很有用的一種染色法，因?yàn)檠挎邔?duì)滅菌的壓力比較大， 存在滅菌失敗的風(fēng)險(xiǎn)特別是根據(jù)生物負(fù)載設(shè)定么軍參數(shù)的方法。 鞭毛染色法 3434 微生物鑒定（二） 核酸特征鑒定之一核酸特征鑒定之一 16SrRNA16SrRNA序列分析序列分析 基本步驟：基本步驟： 3535 DNA提取PCR擴(kuò)增 凝膠成像檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳 回收 序列分析數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì) 微生物鑒定（三） 16SrRNA 16SrRNA序列分析的注意事項(xiàng)序列分析的注意事項(xiàng) 引物的選擇引物的選擇 PCRPCR條件的設(shè)定條件的設(shè)定 3636 微生物的定義和分類微生物的定義和分類 原核類原核類

35、：細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)細(xì)胞：細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)細(xì)胞 立克次氏體、衣原體立克次氏體、衣原體 微生物微生物 真核類真核類：真菌：真菌( (酵母菌、霉菌）、原生動(dòng)物、酵母菌、霉菌）、原生動(dòng)物、 顯微藻類顯微藻類 非細(xì)胞類非細(xì)胞類：病毒、類病毒、朊病毒：病毒、類病毒、朊病毒 3737 定義：定義： 一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱。一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱。 細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)顯微鏡檢照片細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)顯微鏡檢照片 放大放大10001000倍桿菌倍桿菌 放大放大10001000倍球菌倍球菌 3838 微生物的存在對(duì)醫(yī)療器械的影響微生物的存在對(duì)醫(yī)療器械的影響 活的微生物對(duì)滅菌影

36、響活的微生物對(duì)滅菌影響 非過(guò)度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負(fù)載增加，滅菌非過(guò)度滅菌的工藝因醫(yī)療器械上生物負(fù)載增加，滅菌 難度加大，可能導(dǎo)致滅菌失敗。難度加大，可能導(dǎo)致滅菌失敗。 活的微生物對(duì)使用者危害活的微生物對(duì)使用者危害 滅菌不徹底的無(wú)菌醫(yī)療醫(yī)療器械，根據(jù)使用方式的不滅菌不徹底的無(wú)菌醫(yī)療醫(yī)療器械，根據(jù)使用方式的不 同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應(yīng)。同，可能出現(xiàn)炎癥、菌血癥等病理反應(yīng)。 微生物尸體對(duì)使用者的危害微生物尸體對(duì)使用者的危害 典型例子：典型例子：G G- -菌細(xì)胞壁脂多糖成分菌細(xì)胞壁脂多糖成分( (內(nèi)毒素內(nèi)毒素) )通過(guò)輸液通過(guò)輸液 進(jìn)入人體血液，致使人體發(fā)熱。進(jìn)入人體血液，致使人體發(fā)熱。 3939 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品接種法產(chǎn)品接種法確定回收率確定回收率 產(chǎn)品上人工接種微生物后，初次采集的微生物數(shù)量占 接種 到產(chǎn)品上的微生物的比值?？蔀槊恳划a(chǎn)品計(jì)算百分率，并 用其確立回收率。 產(chǎn)品的要求 產(chǎn)品首先應(yīng)進(jìn)行適合的滅菌，并確?？赡軐?duì)微生物有抑制 的滅菌介質(zhì)的有效去除。 如用EO滅菌時(shí)，則應(yīng)驗(yàn)證殘留水平是否存在對(duì)微生物的抑 制作用。 4040 微生物采集技術(shù)和設(shè)備微生物采集技術(shù)和設(shè)備 攪切（碎裂） 將試驗(yàn)樣品浸入裝有已知體積洗脫液的適當(dāng)容器內(nèi)。