HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南

1、HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南_本指南由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心艾滋病參比實驗室組織有關(guān)專家撰寫，由中國疾病預防控制中心批準執(zhí)行。編寫主持人：蔣巖編寫人員： 潘品良 蔣巖 李敬云 鐘平 尚紅 李太生審核咨詢專家及技術(shù)人員：邵一鳴 康來儀 朱效科 王佑春 汪寧 朱紅 郭志宏 季陽 劉海林 肖瑤 邱茂鋒 馬春濤編寫單位：中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心 參編單位：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院上海市疾病預防控制中心中國醫(yī)科大學北京協(xié)和醫(yī)院技術(shù)顧問：Mike Ussery, Hao Zhang美國國立衛(wèi)生研究院 過敏及傳染病研究所James W. Bremer美國Ru

2、sh 大學醫(yī)學中心VQA實驗室Trever Peter克林頓基金中國艾滋病防治項目實驗室專家Donald J. Brambilla美國華盛頓大學新英格蘭研究所Francis F. Mandy加拿大公共衛(wèi)生局疾病預防控制中心國家免疫學實驗室前 言隨著HIV-1病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診斷和抗病毒治療監(jiān)測以及艾滋病科研工作中的廣泛應用，我國開展該項檢測工作的實驗室日益增多。自1997年艾滋病實驗室首次引進HIV-1病毒載量檢測技術(shù)，截至2007年底，全國已經(jīng)配備了近120臺HIV-1病毒載量檢測儀，覆蓋了疾控、醫(yī)院、檢疫、軍隊等系統(tǒng)。目前，雖然許多實驗室已經(jīng)將病毒載量檢測納入艾滋病相關(guān)輔助診斷

3、和治療監(jiān)測工作，但大多數(shù)實驗室開展工作的時間較短，經(jīng)驗不足，因此，急需加強該領(lǐng)域的培訓和質(zhì)量控制工作，以保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性。為了加強質(zhì)控和保證檢測質(zhì)量，并得到國際上的認可，艾滋病參比實驗室2004年開始參加美國NIH組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證工作。在通過考核和積累經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，2005年啟動了國內(nèi)HIV-1病毒載量檢測能力驗證工作。在積極組織實驗室能力驗證的同時，艾滋病參比實驗室也對實驗室技術(shù)人員進行培訓，積極開展室內(nèi)質(zhì)控。這些工作對提高HIV-1病毒載量的檢測技術(shù)，保證質(zhì)量起到了重要作用。為了進一步規(guī)范艾滋病實驗室HIV-1病毒載量檢測，建立標準化質(zhì)量控制程序，準確開展各

4、項檢測及質(zhì)量控制工作，特制定本指南。本指南是根據(jù)各種HIV-1病毒載量檢測方法的技術(shù)要求，結(jié)合現(xiàn)行的國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)規(guī)范而制定。本指南針對HIV-1病毒載量檢測的實驗室設(shè)置、樣品管理、檢測技術(shù)、質(zhì)量控制、生物安全等方面提出指導。本指南自2006年初正式開始編寫，性病艾滋病預防控制中心多次組織了有國內(nèi)外專家參加的指南編寫專項技術(shù)咨詢會，與會專家對指南提出了很多建設(shè)性意見和建議，美國NIH病毒載量檢測質(zhì)量保證實驗室專家多次對指南進行認真的審閱和具體指導。指南編寫過程中，也認真聽取了實驗室一線檢測人員的具體需求和建議，并補充了大量的實驗數(shù)據(jù)，包括HIV-1病毒載量檢測值的穩(wěn)定性、凍融影響實驗與不同檢測

5、方法之間比較的實驗數(shù)據(jù)等。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次修訂、補充和審定，于2007年11月完成HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南的最后定稿。由于國內(nèi)外還沒有可作為參考的HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量控制的相關(guān)指南，因此本指南主要提出一些原則上的參考建議，其中定有不妥之處，希望廣大同仁提出意見，以便不斷完善。致 謝在本指南的編寫過程中，世界衛(wèi)生組織、克林頓基金中國艾滋病防治項目和美國NIH等國際組織與機構(gòu)給予了大力支持，全國HIV-1病毒載量檢測實驗室一線操作人員提出了許多建設(shè)性的意見和具體需求，艾滋病參比實驗室工作人員毛瑋、陶曉霞進行了大量的補充實驗和文字編輯工作，才保證本指南的編寫順利完成，在此一并

6、向他們表示真誠的感謝。中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心主任吳尊友研究員在本指南編寫過程中提出了重要的修改意見，在此特別致謝。HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南（2007版）目錄第一章 總則第二章 實驗室設(shè)置第三章 樣品的采集、處理、保存、運輸?shù)谒恼?常用HIV-1病毒載量檢測方法簡介第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制第六章 外部質(zhì)量控制第七章 實驗室生物安全附表1 常見問題分析和處理附表2 HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單附表3 HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單附表4 HIV-1病毒載量檢測報告單附表5 HIV-1病毒載量能力驗證結(jié)果專用報告單（NASBA)附表6 HIV-1病

7、毒載量能力驗證結(jié)果專用報告單（RT-PCR)參考文獻縮略語第一章 總 則1.1意義 HIV-1病毒載量是艾滋病防治工作中一項重要的實驗室檢測指標。檢測HIV-1病毒載量可以監(jiān)控和預測病程，指導艾滋病患者的抗病毒治療，包括確定治療時機、選擇治療方案、評價治療效果；結(jié)合疾病臨床癥狀和其它實驗指標，可作為早期感染診斷的輔助手段；還可用于嬰兒早期感染的輔助診斷以及采供血機構(gòu)樣品的窗口期檢測。為了準確地檢測HIV-1病毒載量，必須對開展HIV-1病毒載量檢測的實驗室進行規(guī)范化管理和質(zhì)量控制，才能保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性。1.2目的 指導HIV-1病毒載量檢測工作，規(guī)范實驗室質(zhì)量控制與管理。1.3適用

8、范圍 適用于我國開展HIV-1病毒載量檢測工作的所有實驗室。第二章 實驗室設(shè)置各種HIV-1病毒載量檢測方法需要相應的輔助設(shè)備才能完成檢測。以下為HIV-1病毒載量檢測實驗室不同分區(qū)內(nèi)必備的輔助設(shè)備及耗材。2.1樣品處理區(qū)：2.1.1生物安全柜：二級2.1.2離心機（32000g，可離心1.5mL 管子）2.1.3冰箱：4，-20，-802.1.4水浴箱：準確度小于0.52.1.5加樣器1套（20L、200L、1000L），為專用設(shè)備2.1.6有濾芯的一次性吸頭（無DNA和RNA酶）2.1.7計時器2.1.8旋渦振蕩器：震動頻率可調(diào)2.1.9 一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.2試劑準

9、備區(qū)：2.2.1超凈工作臺（或密閉工作臺）2.2.2加樣器1套（20L、200L、1000L），為專用設(shè)備2.2.3離心機（18000g，可離心1.5mL 管子）2.2.4冰箱：4，-202.2.5 計時器2.2.6旋渦振蕩器，震動頻率可調(diào)2.2.7有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）2.2.8 1.5mL 管子（無DNA和RNA酶）和1.5mL 試管架2.2.9一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.3擴增產(chǎn)物分析區(qū)：2.3.1 HIV-1病毒載量檢測儀2.3.2加樣器1套（20L、200L、1000L）2.3.3冰箱：4，-202.3.4水浴箱 ( 41 )2.3.5旋渦振蕩器：震動

10、頻率可調(diào)2.3.6有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）2.3.7一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.4 HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖病毒載量儀,加樣器離心機冰箱-20，4水浴箱洗手池紫外燈擴增產(chǎn)物分析區(qū)生物安全柜加樣器離心機冰箱-80，-20冰箱水浴箱洗手池紫外燈樣品處理區(qū)超凈工作臺加樣器漩渦振蕩器冰箱-20，4實驗臺紫外燈試劑準備區(qū)2.4.1總體原則：各區(qū)獨立、控制風向、因地制宜、方便工作。具體來說： 2.4.1.1各區(qū)必須是相互獨立的，有條件各區(qū)內(nèi)可分別設(shè)置緩沖間，以保證不同區(qū)之間始終完全分隔開。2.4.1.2各區(qū)的儀器設(shè)備

11、以及各種物品必須是專用的。2.4.1.3 試劑準備區(qū)和樣品處理區(qū)可保持低度正壓（或常壓）狀態(tài)，使空氣流向始終由室內(nèi)向外，以避免擴增污染物進入此區(qū)域。2.4.1.4 擴增產(chǎn)物分析區(qū)可保持低度負壓狀態(tài)，使空氣流向始終由室外向內(nèi)，以防止擴增產(chǎn)物造成其他區(qū)域的交叉污染?？砂惭b排風扇或其他排風裝置。2.4.1.5擴增產(chǎn)物分析區(qū)可以設(shè)在遠離其他各區(qū)的地方。2.4.1.6工作時必須遵循單一工作流向進行，即工作流向只能從試劑準備區(qū)開始，到樣品處理區(qū)，然后再到擴增產(chǎn)物分析區(qū)。第三章 樣品的采集、處理、保存和運輸 樣品采集、處理、保存和運輸，按照所使用檢測方法的要求嚴格執(zhí)行。用于HIV-1病毒載量檢測的樣品推薦采

12、用抗凝血漿。3.1 樣品的采集3.1.1 采樣器材：一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等。3.1.2 抗凝劑： 通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸櫞酸鈉） ，并符合不同檢測方法對樣品的要求。3.1.3 樣品標識：在采血管上貼對應的樣品編號，并填寫HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）。3.1.4 樣品采集量：通常采集全血35ml, 采集的樣品量應盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。3.1.5 樣品的混勻：采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻。3.1.6 獲取其它信息：包括采集對象的基本信息和流行病學資料，抗

13、病毒藥物使用情況，以往的實驗室檢測結(jié)果，在HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）上備注欄注明。3.2 樣品的處理3.2.1 一般要求在采血后6小時內(nèi)進行離心，室溫下800-1200xg離心10分鐘。3.2.2 分離后，吸出血漿，分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時間。在凍存管上貼樣品編號。3.2.3 血漿樣品不能滅活。3.2.4 做好樣品處理記錄。3.3 樣品的保存3.3.1保存條件：根據(jù)血漿檢測時間而定，4天內(nèi)可在4暫時保存，3個月以內(nèi)應凍存于-20以下，3個月以上應置于-70以下。不推薦使用自動除霜冰箱。3.3.2血漿樣品凍融不應超過3次。3.3.3監(jiān)控并記錄保存溫度以及

14、樣品狀態(tài)的變化。3.3.4防止樣品變質(zhì)、泄漏及污染。3.4 樣品的運輸根據(jù)可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定的要求運輸，并嚴格控制運輸?shù)睦鋬鰻顟B(tài)，防止樣品凍融。3.5 樣品的發(fā)送和接收3.5.1發(fā)送樣品時必須填寫樣品HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）。3.5.2接收樣品時，核對樣品數(shù)量，檢查樣品狀況，按HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）核對。3.5.3 樣品管破損造成樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品，不宜作HIV-1病毒載量檢測；如果樣品已經(jīng)融化， 4保存并盡快檢測，記錄凍融一次。第四章 常用HIV-1病毒載量檢測方法簡介目前常用的HIV

15、RNA測定方法為核酸序列依賴性擴增(NASBA) 技術(shù)，代表產(chǎn)品為NucliSens ECL 及其升級產(chǎn)品熒光實時PCR技術(shù)NucliSens EasyQ儀；逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)（RT-PCR）技術(shù)，代表產(chǎn)品為AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay；分枝DNA信號放大系統(tǒng)（bDNA）技術(shù)，代表產(chǎn)品為bDNA 340分析儀；實時熒光定量PCR擴增技術(shù)（real-time PCR），M2000與國產(chǎn)試劑盒均屬此類技術(shù)。41 核酸序列依賴性擴增(NASBA)技術(shù)最早產(chǎn)品為NucliSens ECL定量RNA測定方法，最近被NucliSens EasyQ新一代熒光實時定量PCR所取代。N

16、ASBA技術(shù)是一種等溫擴增系統(tǒng)，其擴增基礎(chǔ)在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng)，此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在體外模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復制過程。此方法可分成四個步驟：核酸釋放、提取、擴增和測定。擴增后的產(chǎn)物使用NASBA QR電化學發(fā)光（ECL）系統(tǒng)進行檢測和定量，此系統(tǒng)包括親和素標記的磁珠、生物素標記的核苷酸片段（此片段可與新合成的RNA產(chǎn)物的一端互補結(jié)合）及可特異與四種產(chǎn)物結(jié)合的探針（探針上標記有銣元素），這四種探針可分別與不同的RNA產(chǎn)物結(jié)合。將四種探針分別置于不同的反應管內(nèi)，在適當?shù)臈l件下（410C）幾種成分將結(jié)合在一起，形成復合體。這些復合體可在ECL讀數(shù)儀中被分別讀取銣元素

17、的激發(fā)信號，根據(jù)野生型病毒核酸測定值與其他三個內(nèi)標物測定值的比較可得到野生型病毒的拷貝數(shù)。Nuclisens EasyQ 結(jié)合NASBA（核酸序列基礎(chǔ)分析）技術(shù)與分子熒光探針技術(shù)（Molecular Beacon）檢測血漿中的HIV RNA水平。這種結(jié)合的方法使用了實時擴增分析（real-time amplification assay），提高了對診斷質(zhì)量的要求。42 逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)技術(shù)目前用得最廣泛的儀器為COBAS AMPLICOR和相應的檢測試劑COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM 1.5版。聚合酶鏈反應人類免疫缺陷病毒HIV-1定量檢測試劑盒1.5版是在聚合酶

18、鏈反應全自動診斷儀上定量測定人血漿中人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1）RNA水平的體外核酸擴增檢測試劑盒。該檢測試劑盒可以通過兩種樣品處理程序進行檢測，即標準的和超敏感的操作步驟，定量測定含量為50-750,000拷貝/毫升 HIV-1 RNA。標準的樣品處理程序中，HIV-1 RNA通過應用裂解液裂解病毒顆粒從而直接從血漿中分離出來，然后用乙醇沉淀RNA。采用超敏感的制備方法，血漿中HIV-1病毒顆粒首先通過高速離心濃縮，然后用裂解試劑裂解病毒顆粒。再用乙醇沉淀RNA。COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM試劑盒1.5版包括5個主要步驟：試劑準備；樣品制備；靶RNA的逆

19、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA；用HIV-1特異互補引物進行靶cDNA PCR擴增；通過比色與探針結(jié)合的擴增產(chǎn)物的測定。HIV-1病毒RNA的定量檢測是采用HIV-1定量標準品來完成的。HIV-1定量標準品是包括作為HIV-1 靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-1擴增子單一探針結(jié)合區(qū)的非感染性RNA 轉(zhuǎn)錄物。將已知拷貝數(shù)的HIV-1定量標準品加到每一個樣品中和HIV-1靶序列一起共同進行樣品制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增、雜交和檢測并和HIV-1靶序列一起擴增。COBAS AMPLICOR 分析儀根據(jù)HIV-1定量標準品的數(shù)據(jù)計算每一個樣品的HIV-1 RNA的含量。該定量標準品補償了抑制因素的影響并且擴增過程的質(zhì)控

20、使每一個樣品的HIV1 RNA得以準確定量。43 分枝DNA（bDNA）技術(shù)分枝DNA測定技術(shù)基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即分枝DNA信號放大系統(tǒng)，這是一個人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可結(jié)合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。此檢測系統(tǒng)不涉及核酸擴增反應。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標記物，每次實驗設(shè)置一系列外部標記，通過實驗樣品反應強度與外部標記樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。每一種bDNA檢測都有各自的步驟或試劑。bDNA檢測通常包括以下步驟：（1）將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加到微孔中；（2）孵育。此步驟可釋放病毒核酸，降解RNA酶或

21、使DNA變性, 然后靶探針結(jié)合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷卻洗板；（4）加信號放大探針(bDNA)到各孔內(nèi)；（5）孵育. 此步驟使bDNA雜交到靶探針的相應部位；（6）冷卻洗板；（7）加標記探針到各孔內(nèi)；（8）孵育，此步驟使酶標記的探針雜交到bDNA上；（9）冷卻洗板；（10）加化學發(fā)光底物到各孔中；（11）孵育，此步驟讓酶和底物相互作用，產(chǎn)生化學發(fā)光信號。發(fā)射的光強以相對光量值(RLUs)表示。產(chǎn)生的光強直接與各樣品中病毒RNA或DNA的載量成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同處理的標準所制作的標準曲線計算獲得。44 實時（real-time）熒光定量PCR擴增實時熒光

22、定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，檢測PCR的產(chǎn)物使用熒光標記的寡核苷酸探針。檢測的

23、原理基于熒光信號增長曲線與循環(huán)數(shù)相關(guān)。（3）RT-PCR反應，病毒RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產(chǎn)物的檢測，基于檢測閾值的設(shè)定，當病毒載量高時，低循環(huán)數(shù)即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環(huán)數(shù)時才能檢測到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。利用標準品制作循環(huán)數(shù)與載量的標準曲線就能對樣品載量進行定量檢測。第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制是在良好實驗室整體環(huán)境支持下，從樣品接收到發(fā)出報告整個過程每個環(huán)節(jié)的管理過程，包括：（1）人員；（2）實驗室分區(qū)和環(huán)境；（3）儀器；（4）檢測過程（試劑、操作過程，質(zhì)控品使用）；（5）數(shù)據(jù)。5.1人

24、員HIV-1病毒載量檢測人員分為檢驗人、復核人、簽發(fā)人。5.1.1 所有相關(guān)檢驗人員需經(jīng)操作培訓，能獨立熟練地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。5.1.2復核人、簽發(fā)人應具備對檢測過程進行分析、解決問題的能力。5.2實驗室分區(qū)和環(huán)境5.2.1實驗室分區(qū)的功能HIV-1病毒載量檢測實驗室原則上應分為三個獨立工作區(qū)：試劑準備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。不同檢測方法的分區(qū)功能和要求可有所不同。5.2.1.1 試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存；5.2.1.2 樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣；5.2.1.3 擴增產(chǎn)物分析區(qū)：產(chǎn)物擴增的測定、結(jié)果分析、登記及報告。嚴

25、格要求三區(qū)的空氣流向：從試劑準備區(qū)到樣品處理區(qū)，然后到擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆向流動。實驗室的設(shè)置及輔助設(shè)備的具體要求參見第二章。5.2.2 實驗室環(huán)境的要求5.2.2.1實驗室有足夠的空間；5.2.2.2采光好，應避免陽光直射設(shè)備；5.2.2.3室溫控制在1825；5.2.2.4室內(nèi)相對濕度控制在5070%；5.2.2.5電源穩(wěn)定，HIV-1病毒載量檢測儀應配備穩(wěn)壓電源；5.2.2.6室內(nèi)保持干凈整潔，無灰塵。5.2.2.7實驗前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸鈉及時處理操作臺面。5.3 儀器設(shè)備質(zhì)控5.3.1加樣器、溫濕度計須經(jīng)計量部門校準，每年一次。每季度期間核查一次。5.3.2 HIV-

26、1病毒載量檢測儀、離心機可以委托公司校準，每年一次。5.3.3冰箱、水浴箱用校準合格的溫度計測量溫度，并做好記錄。5.4檢測過程質(zhì)控 5.4.1試劑質(zhì)控5.4.1.1 所有試劑盒須嚴格按要求條件保存。5.4.1.2試劑盒拆封時，要記錄拆封時間，所有試劑嚴格控制在有效期內(nèi)使用。5.4.1.3使用經(jīng)中國食品藥品監(jiān)督管理局注冊的試劑。5.4.2 實驗用水：要求使用無DNA和RNA酶的水。5.4.3 操作過程質(zhì)控嚴格執(zhí)行儀器和試劑的標準操作程序（SOP），不得擅自修改。5.4.4質(zhì)控品的使用每次實驗需同時使用試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品以及一個HIV-1 RNA為5000-15000拷貝/毫升的外部質(zhì)控品。5.4

27、.4.1外部質(zhì)控品的制備按實際使用量的要求配制大樣品量的血漿（推薦每次配置量可使用兩年），用0.2m濾膜過濾除菌，充分混勻。用無菌凍存管定量分裝，標記，封口，凍存于-80以下非自動除霜冰箱內(nèi)。5.4.4.2外部質(zhì)控品的定值隨機選出10管外部質(zhì)控品，按照實驗室的檢測條件進行HIV-1病毒載量檢測，將拷貝值換算成Log10值，計算算術(shù)平均值（m）和標準偏差（s）。5.4.4.3質(zhì)控圖的繪制和使用根據(jù)外部質(zhì)控品的定值，繪制質(zhì)控圖。在質(zhì)控圖上顯示所有10次質(zhì)控品檢測值的Log10值、平均值以及1.5s 值范圍。每次檢測都應帶1個外部對照，將得到的外部對照Log10值標在質(zhì)控圖上，根據(jù)是否在1.5s 值

28、范圍判斷實驗結(jié)果是否有效，每次測得值在平均值1.5S內(nèi)方為有效。使用新批次的外部對照質(zhì)控品時，必須重新繪制質(zhì)控圖。5.4.5 試劑盒質(zhì)控品的使用每次實驗按照試劑盒說明書的要求使用試劑盒提供的質(zhì)控品，并滿足質(zhì)控品的要求。5.5 數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告5.5.1 在試劑盒及外部質(zhì)控品結(jié)果滿足要求的前提下，對樣品進行分析。5.5.2 外部質(zhì)控品不合格，樣品需要重新檢測。5.5.3 結(jié)果超過檢測上限的樣品應稀釋以后重新檢測。5.5.4 復核人對檢測結(jié)果進行仔細復核并對結(jié)果提出結(jié)論、簽字。5.5.5 簽發(fā)人對結(jié)果的結(jié)論進行審核、分析、總結(jié)、簽字。5.5.6 按不同方法的要求，以拷貝/毫升或國際單位/毫升為單

29、位報告樣品的HIV-1病毒載量值。第六章 外部質(zhì)量控制HIV-1病毒載量檢測的外部質(zhì)量控制可以通過參加外部質(zhì)量評價，提高實驗結(jié)果的可比性，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，改進實驗室工作，提高檢測質(zhì)量。艾滋病參比實驗室自2004年開始參加由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）組織的HIV-1病毒載量檢測考核工作，考核盤有5個樣品組成，分別考核實驗室檢測的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和準確性，通過將結(jié)果與國際上參與考核的所有實驗室結(jié)果進行比對評估，給出綜合評估結(jié)果。通過參加考核，保證艾滋病參比實驗室的不同HIV-1病毒載量檢測系統(tǒng)的有效性。目前，艾滋病檢測實驗室通過參加艾滋病參比實驗室組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證來實施外

30、部質(zhì)量控制。6.1 HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織艾滋病參比實驗室為HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織者，負責制定國內(nèi)HIV-1病毒載量檢測能力驗證的計劃并組織實施。建議國內(nèi)所有從事HIV-1病毒載量檢測的實驗室參加該PT項目，在規(guī)定時間內(nèi)使用有效試劑與實驗樣品一起檢測，填寫HIV-1病毒載量實驗結(jié)果報告單（附表4-6），上報艾滋病參比實驗室。鼓勵有條件的實驗室參加國際組織的PT活動。 6.2 HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的實施6.2.1 PT樣品組成：每次5份。包括陰性、不同拷貝數(shù)的陽性樣品。6.2.2 PT頻率：一年2次，分別為3月和9月。6.2.3 PT

31、樣品的接收與保存：要求參加PT的實驗室收到考核樣品后，立即進行核對、檢查，填寫HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單（附表3），3天內(nèi)將接收專用單傳回艾滋病參比實驗室。如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量不足、空管等情況，及時書面回報，艾滋病參比實驗室負責補寄或更換。收到樣品后應及時檢測或在-70度以下保存。6.2.4 PT樣品的檢測：要求將考核樣品同實驗室常規(guī)樣品一起檢測，由常規(guī)檢測人員進行，不應作為特殊樣品處理。6.2.5 PT結(jié)果的報告和處理：參加PT的實驗室必須在規(guī)定的時間內(nèi)（收到樣品3個月內(nèi)），用電子郵件報告實驗結(jié)果，并將HIV-1病毒載量實驗結(jié)果報告單（附表4-6）和打印的儀器原始記錄一起

32、上報給艾滋病參比實驗室，后者將負責結(jié)果錄入和處理。評分原則：比n呢體要求參加考核裝和保存。及抗病毒治療6.2.6評分原則：沒有任何問題者為優(yōu)秀；出現(xiàn)6.2.6.1中的一條為良好；出現(xiàn)至少6.2.6.1中的兩條或至少6.2.6.2中的一條為不合格。6.2.6.1次要問題：一個樣品結(jié)果在1.52.0S內(nèi)；一個假陽性；一個無效結(jié)果；一個抄寫錯誤。6.2.6.2主要問題：兩個樣品結(jié)果超過2.0S；兩個及以上假陽性；兩個及以上無效結(jié)果；兩個及以上抄寫錯誤。6.2.7 評估結(jié)果反饋：艾滋病參比實驗室根據(jù)各實驗室的兩次考核結(jié)果，每年反饋最后的評估結(jié)果。6.2.8抱怨和申訴：參評實驗室如對評估結(jié)果或其它方面存

33、有異議，可以在收到結(jié)果后10天內(nèi)向艾滋病參比實驗室提出異議，后者在核實情況后予以答復。6.2.9 現(xiàn)場督導：根據(jù)考核情況的需要，艾滋病參比實驗室組成技術(shù)專家組對不合格實驗室進行現(xiàn)場檢查。檢查內(nèi)容包括：實驗原始數(shù)據(jù)、實驗室布局、儀器運行狀況、輔助設(shè)備校準狀況、實驗耗材質(zhì)量、樣品保存、試劑盒使用狀態(tài)、人員培訓狀況、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制等。第七章 實驗室生物安全7.1相關(guān)依據(jù)病原微生物實驗室生物安全管理條例、實驗室生物安全通用要求、可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣品運輸管理規(guī)定、人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法和全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范。7.2安全細則7.2.

34、1進入實驗室應穿工作服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴禁在實驗室內(nèi)進食、飲水和吸煙以及使用化妝品。7.2.2所有樣品包括試劑盒中的人源性成份（如陰、陽性對照）都應在生物安全柜內(nèi)進行處理。7.2.3樣品應盛裝在有螺旋蓋的管子中，以防樣品濺出或產(chǎn)生交叉污染。當具有潛在傳染性的物質(zhì)溢出時，立即用0.1%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處理污染區(qū)及器材；接觸過標本的器材應置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄前進行高壓滅菌處理。7.2.4避免試劑盒中各種有毒有害化學成分（如疊氮鈉、二甲基亞砜、異硫氰酸胍）對人體或環(huán)境可能造成的危害。7.3生物安全培訓7.3.1所有涉及HIV-1病毒載量檢測的人員都應經(jīng)過嚴

35、格的技術(shù)培訓，要掌握生物安全保障的原則、措施。每個人的安全教育均應記錄在實驗室和人事檔案中。7.3.2省級及以上疾控中心艾滋病實驗室負責HIV/AIDS檢測生物安全培訓及HIV-1病毒載量檢測培訓。7.3.3檢測相關(guān)人員應主動接受實驗室生物安全員以及安全負責人的監(jiān)督。所有實驗室意外事件均應進行記錄和報告。7.3.4所有人員要保護自身和環(huán)境的安全。7.3.5參照實驗室安全指南和標準操作程序的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行具體操作。7.4職業(yè)暴露處理7.4.1實驗室應建立完善的艾滋病職業(yè)暴露后的預防機制。7.4.2發(fā)生職業(yè)暴露后，首先進行應急處理，然后根據(jù)暴露級別和暴露源頭嚴重程度，評估風險級別，并決定是否進行預防

36、性用藥和用藥程序，如需要時，盡早開始服用抗病毒藥物。7.4.3按規(guī)定進行職業(yè)暴露登記、檢測和報告，注意做好保密工作。附表1 常見問題分析（一）NASBA問題原因 處理方法血清或血漿樣品中有特殊物質(zhì) 化凍緩慢引起的細胞裂解離心至上清清亮 硅膠難以重新懸浮 樣品中核酸水平太高 劇烈震蕩混懸，由于洗滌/洗脫效率不高可影響敏感度。樣品最多帶有相當于106個細胞的DNA。 硅膠干燥不佳 丙酮剩余太多 用100-1000 l槍頭吸干凈干燥溫度太低 干燥時間最多延長2分鐘 檢查加熱模塊的溫度 加入硅膠的樣品離心后難以溶解 硅膠孵育時間太長 ( 12 min) 增加震蕩時間和強度 無效結(jié)果；信號太低 酶未完全

37、溶解保證酶稀釋和使用前平衡至室溫，充分溶解并在一小時內(nèi)使用 磁珠未充分混勻或加入的量太少每次加入前先震蕩混勻，保證磁珠快速沉在管底樣品濃度太高 檢查檢測稀釋液、樣品及已稀釋樣品加入的量 擴增時溫度偏差 調(diào)整加熱溫度，應該在410.5C. （二）RT-PCR問題原因 處理方法QS_無效（QS_INVALID）QS稀釋系列的A660數(shù)值未在檢測的吸光度范圍內(nèi)。該樣品檢測的結(jié)果無效。結(jié)果無效的樣品應從樣品和質(zhì)控的制備開始重新進行逆轉(zhuǎn)錄、擴增和檢測。靶序列吸光度偏低(TARGETOD LO)所有HIV-1的稀釋度的A660數(shù)值低于檢測的線性范圍。報告結(jié)果根據(jù)所采取的標準的或極度敏感的提取方法可以是“H

38、IV-1 RNA 沒有檢測到（HIV-1 RNA低于400拷貝/毫升）”或“HIV-1 RNA 沒有檢測到（低于50拷貝/毫升）”。靶序列吸光度偏高(TARGETOD HI)所有HIV-1的稀釋度的A660數(shù)值高于檢測的線性范圍。報告結(jié)果形式為“不能確定”。（1）如果采用標準樣品處理程序，用HIV陰性的人血漿稀釋原始樣品并用標準的樣品處理程序重新檢測。報告的結(jié)果應乘以稀釋因子。（2）如果采用極度敏感的樣品處理程序，稀釋原始血漿樣品，用標準的樣品處理程序重新檢測。報告的結(jié)果應乘以稀釋因子。結(jié)果偏低（RESULT_LO）計算的拷貝數(shù)低于測定下限。對于標準的樣品處理程序，結(jié)果可以報告為“檢測到HIV

39、-1 RNA, 含量低于400拷貝/毫升”。如果需要定量的結(jié)果，原始樣品應該使用極度敏感的樣品處理程序重新檢測。對于極度敏感的樣品處理程序，可以報告為“檢測到HIV-1 RNA, 含量低于50拷貝/毫升”。結(jié)果偏高（RESULT_HI）計算的拷貝數(shù)高于測定上限。對于標準的樣品處理程序，結(jié)果可以報告為“HIV-1 RNA含量高于7.5105拷貝/毫升”。如果需要定量的結(jié)果，原始樣品可以用HIV-1陰性的人血漿稀釋并重新檢測。報告的結(jié)果應乘以稀釋因子。對于極度敏感的樣品處理程序，重新檢測。對于極度敏感的樣品處理程序，結(jié)果可以報告為“HIV-1 RNA含量高于1.0105拷貝/毫升”。如果需要定量的

40、結(jié)果，稀釋原始樣品用標準的樣品處理程序重新檢測。TARG_GANGE所有靶模板的A660數(shù)值都不在線性測定范圍之內(nèi)。可以報告為“未檢出。”重新檢測原始樣品，重復樣品和質(zhì)控制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴增和檢測步驟。OD_SEQUENCE提示有不合乎稀釋順序的A660值出現(xiàn)。重復整個實驗步驟包括樣品和質(zhì)控的制備、擴增和檢測。QS_SEQUENCE提示QS有不合乎稀釋順序的A660值出現(xiàn)。重復整個實驗步驟包括樣品和質(zhì)控的制備、擴增和檢測。（三）Easy Q問題原因 處理方法分子信標沒有檢測絕對信號水平太低用洗脫液重新檢測Q值設(shè)定（）的大小不同于WT值設(shè)定（）的大小內(nèi)參照數(shù)據(jù)設(shè)定的大小不同于WT數(shù)據(jù)設(shè)定的大小重新

41、設(shè)定內(nèi)參照數(shù)據(jù)測定的曲線不連續(xù)所測定曲線不連續(xù)性用洗脫液重新檢測沒有擴增內(nèi)參照和WT最大/最小信號的比值都低于閾值用洗脫液或者樣品再開始測擴增弱曲線斜率太低用洗脫液重新檢測計算錯誤曲線擬合程序產(chǎn)生錯誤用洗脫液重新檢測不正確的擴增動力學擬合曲線沒有正確地描述所觀察的數(shù)據(jù)用洗脫液重新檢測延遲時間太短起始熒光增加的速度太快用洗脫液重新檢測。確信加入酶和開始此輪運行之間的時間少于8分鐘。擴增弱內(nèi)參照值和WT值都沒有達到一個平臺值用洗脫液重新檢測沒有測到內(nèi)參照。沒加內(nèi)參照或者樣品的加入水平太高沒有測到內(nèi)參照的信號，可能是因為在核酸的分離物中沒有加內(nèi)參照或者WT的加入太高用（稀釋過的）樣品重新檢測（四）b

42、DNA問題原因 處理方法注射器含有氣泡洗液瓶, 水瓶, 漂白液瓶是空的或管道連接松弛。加適量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶內(nèi)液面下。分析儀底部的加熱托盤上有液體管路連接松弛或一洗頭的分液或吸液針管堵塞。檢查管路連接。管路有堵塞或細菌滋生管路和試劑瓶沒有正確保養(yǎng)。每次實驗后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空廢液瓶；每周清洗洗液瓶, 水瓶和廢液瓶，管路系統(tǒng)。分析儀不能從孔內(nèi)吸取足夠的液體洗頭中有堵塞, 洗頭針頭彎曲, 廢液管連接松弛, 吸液泵損壞。檢查廢液管連接頭RLU值低試劑漏掉, 用錯試劑, 某種試劑配制錯誤, 漂白液污染, 孵育時間或溫度不正確, 或檢測板冷卻不足。在實驗前確定盛水試劑瓶已滿。確

43、定按產(chǎn)品要求儲存、配制試劑；環(huán)境溫度在18-30；試劑盒沒有過期；實驗中所使用的試劑來自同一批次；每周清洗過程中在管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高實驗被污染, 清洗不充分, 或有光泄露。確定全使用干凈的一次性無菌實驗材料；使用防氣溶膠的加樣槍頭；殘留的底物沒有倒回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加樣器；盛洗液的試劑瓶內(nèi)有足夠量的洗液；檢查分液、吸液操作；每周進行保養(yǎng)；分析倉門關(guān)閉嚴實；檢查背景RLU值。變異系數(shù)(CV)高移液操作錯誤,樣品質(zhì)量差, 孔有污染, 清洗不充分, 試劑沒有預熱充分, 試劑沒有充分混勻, 孔內(nèi)樣液蒸發(fā), 孔內(nèi)樣液濺灑, 有光漏。確定微量加樣器經(jīng)校準；使用防氣溶膠的槍頭；

44、槍頭緊密套在加樣器上；加試劑時槍頭位置在孔的中部；樣品凝塊或殘渣沒有被吸?。粯悠芳拥奈恢门c樣品ID和DMS規(guī)定的位置一致；樣品按產(chǎn)品說明收集,處理和儲存；只使用干凈的一次性無菌實驗材料；檢查分液吸液操作；盛洗液的試劑瓶內(nèi)已裝有足夠量的洗液；每種試劑在實驗開始前被輕輕混勻；每種試劑預熱充分,以防有沉淀；封閉墊組裝正確；孔內(nèi)樣液沒有濺灑；分析倉門關(guān)閉嚴實；檢查RLU背景。標準曲線平坦或不正常加標準時板的缺口在右邊,或標準加入順序有誤。加標準時板的缺口在左邊強或弱對照定量高強陽性對照受污染, 吸取誤差, 或標準曲線有問題。 確定各孔仔細加樣, 未觸及鄰孔；使用無菌槍頭；封閉墊組裝無誤；加樣器定期校準

45、；使用防氣溶膠的槍頭；標準和對照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲存, 配制。強或弱對照定量低對照降解, 對照濺灑, 對照孔液蒸發(fā), 對照加樣有誤, 或?qū)φ諞]有充分混勻。確定試劑盒在運輸和到貨后儲存在正確的溫度；使用無菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉墊組裝無誤；加樣器經(jīng)校準；小心處理測試板,防止濺灑；標準和對照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲存, 配制；樣品,標準,對照在吸取前至少震蕩5秒。附表2 HIV-1病毒載量檢測樣品送檢/接收單送檢單位送檢日期接收單位接收時間采樣時間采樣管抗凝劑樣品保存溫度樣品運輸條件姓 名性 別年齡職業(yè)國籍或民族戶籍所在地既往病史使用藥物抗HIV病毒藥物樣品編號樣品性質(zhì)樣品量（ml）備 注送樣人接收人附表3 HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單實驗室名稱接收日期收到樣品量編號體積（ul）樣品狀態(tài)外包裝是否完整是 否冰塊是否融化是 否樣品是否融化是 否計劃檢測日期檢測方法接收樣品后存放溫度4 -20 -80 其它接收人實驗室負責人填表日期： 附表4 HIV-1病毒載量檢測報告單送檢單位姓 名性 別年 齡國籍或民族職 業(yè)戶籍所在地送檢日期送 檢 樣品 編 號HIV-1病 毒 載 量（copies/ml）檢測人簽發(fā)人報告日