生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 前 言 隨著生物化學(xué)的發(fā)展和生物化學(xué)教學(xué)內(nèi)容的不斷豐富。 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)也在不斷更新和提高。1992年，我們編寫 了一本生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)作為?？粕鷮?shí)驗(yàn)教材，并 在實(shí)驗(yàn)教學(xué)的過程中不斷修改并加以充實(shí)。這次編寫的 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)是在以往工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物化 學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革、作為本、?？粕锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)教改項(xiàng)目 的一個(gè)重要內(nèi)容。 在這次編寫過程中，我們確立了這樣一個(gè)指導(dǎo)思想去 掉了許多定性和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，加大了定量分析的內(nèi)容； 在同一項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)介紹了不止一種方法和技術(shù) 增加了部分大實(shí)驗(yàn)，力求使學(xué)生有一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)訓(xùn) 練過程，

2、有利于培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力、分析問題能力 和獨(dú)立操作能力，以達(dá)到知識(shí)、能力和素質(zhì)的全面提 高。 本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)共計(jì)十五個(gè)實(shí)驗(yàn)，分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、提高實(shí) 驗(yàn)、高級(jí)實(shí)驗(yàn)三篇，內(nèi)容覆蓋了當(dāng)今生物化學(xué)研究中常 用的方法與技術(shù)。 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定(pH法) 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 酶的特性 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 菜花(花椰菜)中核酸的分離 和鑒定 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一一 3，5二硝基水楊酸比色定糖法 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二二 Fo

3、1in酚法測定血清蛋白質(zhì)含量 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三三 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四四 蛋白質(zhì)分子量測定（葡聚糖凝膠薄 層層析法） 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五五 脂肪酸的-氧化 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六六 核酸濃度測定定磷法 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七七 血液中轉(zhuǎn)氨酶活力的測定(分光光 度法) 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八八 維生素C的定量測定 提高實(shí)驗(yàn) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 酯酶的分離、純化與活性測定 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 酯酶同功酶的垂直板不連續(xù)聚 丙烯酰胺凝膠電泳分析 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影 響（米氏常數(shù)的測定） 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成

4、員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 酯酶的分離、純化與活性測定酯酶的分離、純化與活性測定 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 酯酶是A酯酶，B酯酶和膽堿酯酶的總稱，它與人體有機(jī)磷藥物中毒機(jī) 制有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)利用離子交換層析法分離和純化酯酶，常用的陽離子交換劑有弱酸 性的羧甲基纖維素(CM纖維素)，陰離子交換劑有弱堿性的二乙氨基乙基纖維 素(DEAE纖維素). 蛋白質(zhì)的混合物與纖維素離子交換劑的酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)相結(jié)合，結(jié)合 力的大小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的靜電引力，這又與溶液的pH有關(guān)，因?yàn)?pH決定離子交換劑和蛋白質(zhì)的解離程

5、度。鹽類的存在可以降低離子交換劑的解 離基團(tuán)與蛋白質(zhì)的相反電荷基團(tuán)之間的靜電引力。因此，被吸附的蛋白質(zhì)的洗 脫通過改變pH或離子強(qiáng)度(或二者同時(shí)改變)來實(shí)現(xiàn)；與離子交換劑結(jié)合力小的 蛋白質(zhì)首先從層析柱中被洗脫下來。本實(shí)驗(yàn)采用CM纖維素離子交換劑，通過 柱層析，經(jīng)梯度洗脫從鼠腎丙酮粉抽提液中分離、純化酯酶。 梯度洗脫法是在洗脫過程中，使洗脫液的pH或鹽濃度(或兩者同時(shí))發(fā)生連 續(xù)的梯度變化，從而使吸附在柱上的各組分在不同的梯度下洗脫下來。本實(shí)驗(yàn) 采用的是鹽離子濃度梯度洗脫法，其裝置由兩個(gè)彼此相連的容器組成，在與層 析柱相連接的一個(gè)容器(混合瓶)中，放入梯度洗脫開始時(shí)所需濃度的鹽溶液 (低濃度)，

6、并配有攪拌裝置，另一容器(貯液瓶)中放入高濃度的鹽溶液，其濃 度即梯度洗脫最后所需的濃度。兩個(gè)容器的底部必須保持水平，液面的高度也 應(yīng)該相同。這樣，當(dāng)兩容器之間的通道打開，并使混合瓶溶液流進(jìn)層析柱時(shí)， 梯度即開始形成。由于這兩個(gè)容器是連通的，當(dāng)混合瓶的溶液開始流入層析柱， 它的液面高度就逐漸下降，為了維持兩容器的液面高度的一致，高濃度的鹽溶 液即從導(dǎo)管流入混合瓶，結(jié)果混合瓶中溶液的鹽濃度呈梯度上升。 原理原理 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 一 粗酶制劑的制

7、備 二 CM纖維素離子交換劑的處理 三 層析柱的安裝和平衡 四 加樣和梯度洗脫 五 酯酶活性的測定 六 結(jié)果處理 返 回 流程圖流程圖 結(jié) 果 處 理 酯酶活性測定 梯度洗脫 上樣 組合層析裝置 層析柱安裝 層析介質(zhì)處理 粗酶制劑制備 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 一、粗酶制劑的制備一、粗酶制劑的制備 殺死大白鼠，迅速剖腹取腎，置于冰浴中剔除脂肪 和結(jié)締組織。新鮮腎組織和15丙酮，按10g重量和 100m1容積的比例，一同置入Waring搗碎器中搗碎，為 避免溫度升高，搗碎0.5min后，把勻漿倒入燒杯中，置 于冰鹽浴冷至15，再搗碎0.5min，反復(fù)

8、3次。然后 把勻漿傾人布氏漏斗抽濾，用15丙酮洗滌3次，按 上述方法再搗碎濾餅，抽濾和洗滌一次。將最后得到的 濾餅散置于表面皿，放入真空干燥器干燥數(shù)天，即得丙 酮粉干品，每10g新鮮腎組織可制得丙酮粉34g。 按100mg丙酮粉加入5m1 1102mo1l pH6.0磷 酸緩沖液的比例，將二者放入燒杯中，置于冰箱內(nèi)抽提 30min，不時(shí)攪拌。抽提液在3000rmin下離心10min， 上清液即為粗酶制劑(保存于冰箱待用)。測定此粗酶制 劑的蛋白含量(按Fo1in酚試劑法)和酶活性。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 二、二、CM纖維素離子交換劑的處

9、理纖維素離子交換劑的處理 稱10g CM纖維素干品置于燒杯中， 加入100ml 0.5moll NaOH0.5mol從NaCl 溶液，混勻，靜置15min后，在布氏漏斗中 抽濾，水洗濾餅至中性。此濾餅再懸浮于 100m1 1mo1l HCl溶液中，混勻，靜置 10min后放入布氏漏斗抽濾，水洗濾餅至中 性。再將濾餅懸浮于100m1 0.5mo1l NaOH0.5mo1l NaCl溶液中，混勻，靜 置15min后放入布氏漏斗抽濾，水洗濾餅至 中性。最后將濾餅懸浮于所選擇的起始洗 脫緩沖液中。使用后的回收處理和上述步 驟相同，只是省略了將濾餅懸浮于1mo1l HCl溶液這一步。 返 回 天水師范學(xué)

10、院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 三、層析柱的三、層析柱的安裝安裝和平衡和平衡 洗凈一支1.540cm的玻璃(管)柱(也可選用規(guī)格合適的商 品層析柱)， 準(zhǔn)備兩個(gè)橡皮塞，將其中一個(gè)的中央插入一根 玻璃細(xì)管，上面覆蓋一圓形尼龍網(wǎng)片或一塊絹布。玻璃細(xì)管 上連接一根細(xì)膠管，與部分收集器相連，將這個(gè)橡皮塞安入 層析柱的下端，另一橡皮塞中央也插人一根玻璃細(xì)管，并接 上一根膠管與洗脫液混合瓶下口相連。此橡皮塞塞入層析柱 的上端。兩端膠管上各備一個(gè)螺旋夾。將層析柱架至垂直， 夾緊下端膠管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加入蒸餾水(約23柱高)，然后將 預(yù)處理好的離子交換纖維素裝入柱內(nèi)，使其自由沉降至

11、柱的 底部，放松柱下端螺旋夾，讓柱內(nèi)液體慢慢流出。待樹脂沉 降至所需高度(約30cm)后，置一圓形濾紙或尼龍片于膠面， 待膠面只剩下一薄層水時(shí)，夾緊下端夾子，向柱內(nèi)加入數(shù)ml 洗脫起始緩沖液，松開下端夾子，用起始緩沖液滲洗平衡， 先是壓力較小，后增至洗脫時(shí)的壓力(平衡10h左右為宜)。若 平衡壓力過大，柱內(nèi)樹脂被壓迫太緊，影響流速。平衡好的 柱面應(yīng)存留一薄層緩沖液，旋緊下端螺旋夾。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 四、加樣和梯度洗脫四、加樣和梯度洗脫 用滴管將4m1粗

12、酶制劑溶液(總蛋白含量15mg)沿柱內(nèi) 壁徐徐地加到纖維素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夾，使 樣品液面降至纖維素柱表面，再加入少許洗脫起始緩沖液 洗滌柱壁，如上操作，反復(fù)進(jìn)行2次。 梯度洗脫采用圖39.1的裝置實(shí)現(xiàn)。A為貯液瓶，B為混 合瓶，二者容量相等，且置于同一水平面。C為A，B二瓶 連通管的活塞，D為攪拌器，E為混合瓶的通嘴活塞。A盛 高濃度洗脫緩沖液， B盛等體積起始洗脫緩沖液。洗脫前 先開動(dòng)攪拌器，后啟開活塞C和E，B瓶洗脫液濃度呈直線 式遞增。 關(guān)緊活塞C和E，在A瓶中加入110l mo1l pH6.0 磷酸緩沖液150 m1， 在B瓶中加入5103mol/l pH 6.0磷 酸緩沖

13、液150m1，將混合瓶B上的膠管與層析柱連接上之 后，開動(dòng)攪拌器，打開A，B兩瓶之間連通管的活塞C，再 打開B瓶的通嘴活塞E，控制流速在2ml20min。開動(dòng)部 分收集器，分管收集流出液，每管收集2ml。實(shí)驗(yàn)在0 10的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。測定各管流出液的酶活性，同時(shí) 用Fo1in酚試劑法測定，每管流出液的蛋白含量。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 五、酯酶活性的測定五、酯酶活性的測定 底物乙酰2，6二氯酚靛酚被酯酶水 解后生成的2，6二氯酚靛酚在pH8.0的條 件下顯藍(lán)色，底物濃度恒定時(shí)，酶促反應(yīng) 速度取決于酶的活性。測定時(shí)，取4m1 5102mo

14、1l pH 8.0的磷酸緩沖液，加 0.2m1底物(最終濃變?yōu)?.25104mo1l)， 再加適量酶溶液(0.5m1含200g蛋白質(zhì))和水， 使反應(yīng)系統(tǒng)的最終容積為6m1，在30下反 應(yīng)5min后立即在600nm波長處測定A值。本 實(shí)驗(yàn)是各管取0.5m1梯度洗脫液測定酶活性。 若光吸收值越大，表示酶活性越高。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 六、結(jié)果處理六、結(jié)果處理 1. 以梯度洗脫流出液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)流出液的蛋白 含量為縱坐標(biāo)，作出洗脫洗脫曲線圖，峰和為兩個(gè) 主要酶蛋白峰。蛋白含量以1m1梯度洗脫液(Fo1in酚試 劑法測定)在500n

15、m波長處比色的光吸收值表示。 2. 以梯度洗脫流出液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)流出液酶活性 (取0.5m1測定，在600nm波長處的A值)為縱坐標(biāo)，繪制出 酶活性曲線圖，得到兩個(gè)主要酶活性峰I和(見圖)。 3. 以梯度洗脫流出液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，梯度洗脫液濃度為縱 坐標(biāo)，繪制出梯度洗脫液濃度曲線圖。 4. 分別合并峰I和兩個(gè)組分，測定它們的蛋白含量和酶活性， 并計(jì)算比活性。比活性的計(jì)算方法如下： 酯酶比活性=酶作用底物后在600nm波長處的A值/mg蛋白量 最后列出鼠腎粗酶制劑(丙酮粉原抽提液)和層析洗脫液酯 酶比活性的比較以及蛋白回收率（見表）。由表列的數(shù)據(jù) 看出，酯酶集中在峰。 返 回 天水師范

16、學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 蛋白含量、酶活性和梯度洗脫液濃度曲線蛋白含量、酶活性和梯度洗脫液濃度曲線 代表蛋白含量曲線，表示酶活性曲 線，表示洗脫液濃度曲線。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 粗酶制劑和層析洗脫液酯酶比活性的比較 蛋 白量 ( m g ) 蛋 白回 收率比活性提高倍數(shù) 粗 酶制 劑( 丙酮 粉抽 提 液) 4m1 峰 0.21 0.3 峰 7.4 10 比 活性 A ( m g蛋 白 ) CM 纖維 素離 子交 換劑 層析后梯度洗脫液 10.570% 1 15100%0.73 返 回 天水師范學(xué)

17、院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑一、試劑 1丙酮 21102mo1l pH6.0磷酸緩沖 液 35102mo1l pH8.0磷酸緩沖 液 43.75103mo1l乙酰2，6- 二氯酚靛酚丙酮溶液 50.5mo1l NaOH0.5mo1l NaCl溶液 61mo1l HCl溶液 75103mo1l pH6.0磷酸緩沖 液 80.1mo1l pH6.0磷酸緩沖液 9CM纖維素(0.069m mo1g 干粉，PK3.5)。 二、二、器材器材 1waring搗碎器 2布氏漏斗 3抽濾瓶 4表面皿 5離心機(jī) 6國產(chǎn)724型分光光度計(jì) 7梯度混合

18、器 81.540cm玻璃柱 9試管 10自動(dòng)收集器 11移液管 12量簡 13燒杯 14玻璃漏斗。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 酯酶同功酶的垂直板不連酯酶同功酶的垂直板不連 續(xù)

19、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamide gel electrophoresis簡稱PAGE）根據(jù) 其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)與不連續(xù)系統(tǒng)2大類，前者電泳體系中緩沖液PH值及凝 膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；后者電泳體系中 由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳 動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨 率均較前者佳。目前常用的多為垂直的圓盤及板狀兩種。前者凝膠是在玻璃管中聚

20、合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤狀，因而稱為圓盤電泳（disc electrophoresis）, 其裝置如圖87；后者，凝膠是在間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱為板狀電 泳（slab electrophoresis）,其裝置圖見第二部分實(shí)驗(yàn)18。兩者電泳原理完全相 同?，F(xiàn)以R.J.Davis等（1964）用高PH不連續(xù)圓盤PAGE分離血清蛋白為例，闡明各 種效應(yīng)的原理。不連續(xù)體系由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠組成，它們?cè)?直立的玻璃管中（或2層玻璃板中）排例順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下 層分離膠，如示意圖88。樣品膠是核黃素催化聚合而成的大孔膠，T=3%，C=2%， 其中含有一定

21、的樣品及pH6.7 的Tris-HCI,凝膠緩沖液，其作用是防止對(duì)流，促使 樣品濃縮以免被電極緩沖液稀釋。目前一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體 積40%蔗糖，同樣有防止對(duì)流及樣品被稀釋的作用。實(shí)際上，濃縮膠是樣品膠的延 續(xù)，凝膠濃度及PH值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進(jìn)入分離膠前，被濃縮成 窄的扁盤，從而提高分離效果。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，T=7.07.5%，C=2.5%，凝膠緩沖液為 PH8.9Tris-HCI,大部分血清中各種蛋白質(zhì)在此PH條件下，按各自負(fù)電荷量及分子量 泳動(dòng)。此膠主要起分子篩作用。上、下電泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙烯酸（商品 名為Lucite）

22、制作的。將帶有3層凝膠的玻璃垂直放在電泳槽中，在兩個(gè)電極槽 中倒入足夠量PH8.3 Tris- 甘氨酸電極緩沖液，接通電源即可進(jìn)行電泳。在此電 泳體系中，有兩種孔徑的凝膠、2種緩沖體系，3種PH值，因而形成了凝膠孔徑、PH 值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。PAGE具有較高的分辨 率，就是因?yàn)樵陔娪倔w系中集樣品濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)為一體。 原理原理 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 一 凝膠貯備液及電極緩沖液的配制 二 電泳槽的安裝 三 凝膠的制備 四 樣品的制備和點(diǎn)樣 五 電泳 六 染色 返 回 染 色 電

23、 泳 上 樣 注 濃 縮 膠 濃縮膠制備 注分離膠 分離膠制備 電泳槽安裝 流程圖流程圖 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 一、凝膠貯備液及電極緩沖液的配制一、凝膠貯備液及電極緩沖液的配制 請(qǐng)參見試劑與器材方法所述 配置凝膠貯備液及電極緩沖液 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 二、電泳槽的安裝二、電泳槽的安裝 本實(shí)驗(yàn)使用夾芯式垂直板電泳槽。 將膠板嵌入膠膜，后安裝于垂直槽間。 擰緊螺絲固定，水平放置。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 三、凝膠的制備三、凝膠的制備

24、1 分離膠分離膠: 取上述凝膠貯備液(表71)按A：C：G：水 1：2：4：1的比例配制，先將貯備液A，C和水放在 一小燒杯中另將貯備液G放人另一小燒杯中，一起 放在真空干燥器中，用真空泵抽氣15min,取出將G并 入，混勻，立即將凝膠液緩緩注入已準(zhǔn)備好的干潔 膠室中。膠室兩側(cè)和底部要防止?jié)B漏，注膠過程中 要防止氣泡產(chǎn)生。膠液加至離玻璃板頂部約3cm處， 此時(shí)將電泳槽垂直放置；立即用裝有6號(hào)針頭的注射 器注入蒸餾水使膠的表面覆蓋少量水層。約40min后， 膠和水層之間出現(xiàn)清晰的界面，表明聚合完成。 2 濃縮膠濃縮膠: 取上述凝膠貯備液按B:D:E：F=1：2：1：4 的比例同上法配制濃縮膠。用

25、注射器或吸水紙吸去 分離膠上面的水層，立即將配好的濃縮膠注入已凝 固的分離膠上，膠液加到接近膠室的頂部,插入樣品 梳，置于日光燈下照約 l h , 靜止聚合。膠聚合好后， 小心地取出梳子，用吸水紙吸去樣品室內(nèi)的水分， 加入電極緩沖液。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 四、樣品的制備和點(diǎn)樣四、樣品的制備和點(diǎn)樣 取2g 5d齡的小麥幼苗，剪碎后 放 人研缽內(nèi)，在冰浴中勻漿，勻漿 過程中加入4m1稀釋4倍的濃縮膠緩 沖液。勻漿液在5000g下離心10min, 取2m1上清液與l mL40蔗糖溶液和 半滴01溴酚藍(lán)溶液混合，用微量 注射器吸取0.05m1

26、混合液，注入樣品 槽內(nèi)。按同樣操作提取制備水稻樣品 溶液，將小麥和水稻樣品相間點(diǎn)樣， 點(diǎn)樣量可有所不同。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 五、電泳五、電泳 加樣后，向兩個(gè)電極液槽內(nèi)注入電極緩 沖液，接通電源，并立即電泳。前槽接入 電源的負(fù)極，后槽接入正極。電泳開始后， 電流控制在1520mA，樣品進(jìn)入分離膠后 電流可加大到30mA，這時(shí)電壓一般在100V 左右，此后，維持恒流不變。當(dāng)指示染料 到達(dá)離凝膠底部2cm時(shí)停止電泳，電泳約需 3h 。 電泳到時(shí)后，關(guān)閉電源，吸出電極緩沖 液，取出夾套和玻璃板。用流水沖洗，借 助水的潤滑作用將膠平放入15c

27、m的大培養(yǎng) 皿中。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 六、染色六、染色 將100m1酯酶染色液稱取50mg 醋酸荼酯，50mg-醋酸茶酯，100mg堅(jiān) 牢藍(lán)RR(或堅(jiān)牢藍(lán)B)，先用約5m1丙酮 溶解，再用001mol/LpH50磷酸緩 沖液稀釋到150mol注入培養(yǎng)皿中，于室 溫下顯色約20min，可看到桃紅色的磷 酸酯酶同工酶區(qū)帶。棄去染色液，用蒸 餾水沖洗。同工酶帶采用薄層掃描儀測 定，可用5醋酸固定保存。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑一、試劑 1凝膠貯備液的配制

28、： 各貯備液需于4下 冷藏，由于過硫酸胺 不穩(wěn)定，因而應(yīng)在用 前制備。 2電極緩沖液的配制： Tris 606g，甘氨酸 28.52g,加蒸餾水配成 1000 m1，pH 8.3,用時(shí) 稀釋10倍。 二、二、器材器材 1 垂直板電泳槽 2直流穩(wěn)壓或穩(wěn)流電源 3醫(yī)用注射器 4燒杯 5量筒 6真空抽氣裝置 7研缽 8離心機(jī) 9培養(yǎng)皿 10剪刀 11鑷子 12滴管 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑ABCDEFG HCl (1mol/L) 48ml48ml Tris36.

29、6g5.98g TEMED0.23ml0.46ml Acr 20g10g Bis 0.735g2.5g 核黃素 4mg 蔗糖 40g 過硫酸胺 0.14g 加水至100ml100ml100ml100ml100ml100ml100ml PH8.96.7 A、B、C、D、E、F、G各貯備液的配制各貯備液的配制 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 Fo1in酚法測定血清蛋白質(zhì)含量酚法測定血清蛋白質(zhì)含量 天水師范學(xué)院生物系 主頁

30、 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 原理原理 蛋白質(zhì)濃度可從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸 收等測定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、Fo1in酚 試劑反應(yīng)等方法來求算。其中雙縮脲法和Fo1in 酚法是一般實(shí)驗(yàn)室 中經(jīng)常使用的方法。它們操作簡便、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備， 又能適合一般實(shí)驗(yàn)室的要求，若作一般濃度的測定較為適宜。 Fo1in酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。本實(shí)驗(yàn)采用的是 Fo1in酚法。 Fo1in酚法所用的試劑是由兩部分組成的。試劑甲相當(dāng)于雙縮 脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng)。試劑乙(磷鎢酸和磷鉬酸 混合液)在堿性條件下極不穩(wěn)定，

31、易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng) (鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸，故有此呈 色反應(yīng)。因此，用Fo1in酚法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度較高。 所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的 尿素(約0.5左右)、胍(0.5左右)、硫酸鈉(1)、硝酸鈉(1)、三 氯乙酸(0.5)、乙醇(5)、乙醚(5)、丙酮(0.5)等溶液對(duì)顯色無 影響。這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只需加 濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后色 淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。另外，此法也 適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 本實(shí)驗(yàn)以血清為材料，測定血清

32、的蛋白質(zhì)含量。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 一 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 二 血清樣品的測定 三 計(jì)算 返 回 流程圖流程圖 比色測定比色測定 加加Folin-酚試劑乙酚試劑乙 加加Folin-酚試劑甲酚試劑甲 加標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白加標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白 試管準(zhǔn)備試管準(zhǔn)備 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 一一 、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取12支試管（平行兩份），分別加入0， 0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶 液(500gml)，用水補(bǔ)足1.00ml。 按順序向各管加入5mlFo1i

33、n酚試劑甲， 混勻。室溫下放置10min。 再依次向各管加入0.5mlFolin酚試劑乙， 立即搖勻，在30保溫(或室溫下放置)30min。 然后，在500nm處，在724B型分光光度計(jì) 上進(jìn)行比色測定，多測幾次，并取其平均值。 以光密度(OD)為縱坐標(biāo)，以酪蛋白溶液濃 度為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖，繪制出酪 蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 二、血清樣品的測定二、血清樣品的測定 取2支試管，各加入一定量 的血清稀釋液(應(yīng)使其蛋白質(zhì)含 量在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi))， 本實(shí)驗(yàn)取0.2ml血清稀釋液，再 加入0.8ml蒸餾水使樣品體

34、積達(dá) 到lml。其他操作與“標(biāo)準(zhǔn)曲線 的制作”相同。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 三、計(jì)算三、計(jì)算 將血清樣品的光密度讀數(shù)在 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋 白溶液的濃度，再折算成每毫升 血清稀釋液含蛋白質(zhì)的微克數(shù)。 然后乘以稀釋倍數(shù)，得出每毫升 未稀釋血清含蛋白質(zhì)的克數(shù)。最 后，再折算成臨床化驗(yàn)上通用的 單位g%，即100ml血清中含蛋 白質(zhì)的克數(shù)。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑一、試劑 1 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：稱 取125mg酪蛋白粉末，用 0.1N氫氧化鈉溶液潤

35、濕， 溶解，加蒸餾水到250ml， 則配成500gml的標(biāo)準(zhǔn) 酪蛋白溶液。 2 Fo1in酚試劑甲 3 Fo1in酚試劑乙 4 血清：使用前稀釋100 倍。 二、器材二、器材 1 試管及試管架 2 吸量管(5、1、0.5ml) 3 724B型分光光度計(jì) 4 電熱恒溫水浴 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 Fo1in酚試劑甲的配制酚試劑甲的配制 由下述四種溶液配制： (1)4碳酸鈉溶液； (2)0.2N氫氧化鈉溶液； (3)1硫酸銅(CuS045 H20)溶液； (4)2酒石酸鉀鈉溶液。 在使用前，將(1)與(2)等體積混合配成 碳酸鈉氫氧化鈉溶液，

36、將(3)與(4)等體積 混合配成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后， 將這兩種溶液按50:1的比例混合，即為 Fo1in酚試劑甲。該試劑只能用一天，過 期失效。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 Fo1in酚試劑乙的配制酚試劑乙的配制 在2000ml的磨口廻流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉(Na2WO42 H20)100g，鉬酸鈉(Na2MoO42 H20)25g，蒸餾水700ml，85 磷酸50ml和濃鹽酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。 再加入硫酸鋰(LiSO4)150g，蒸餾水50ml及數(shù)滴液體溴。 然后，開口繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)除過量的溴。冷卻后定

37、 容到1000ml，過濾，濾液呈綠色。 用Fo1in酚試劑乙滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液(1N左右)， 以標(biāo)定Fo1in酚試劑乙的酸度；以酚酞為指示劑。當(dāng)溶 液顏色由紅色變?yōu)樽霞t、紫灰、再突然轉(zhuǎn)變成墨綠時(shí)，即 為終點(diǎn)。該試劑酸度一般為2N左右，此為貯存液。也可 以用氫氧化鈉去滴定Fo1in酚試劑乙，但終點(diǎn)較不易掌 握。此時(shí)溶液顏色由淺黃變?yōu)闇\綠，再變?yōu)榛易蠟榻K點(diǎn)。 使用前應(yīng)予以適當(dāng)稀釋，使其成為1N的酸，此為 Fo1in酚試劑乙應(yīng)用液。 以上兩液均應(yīng)裝于棕色瓶內(nèi)，貯于冰箱中，可以長期 保存。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主

38、頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 原理原理 在水溶液中，蛋白質(zhì)分子的表面，由于形成水化層和雙電層 而成為穩(wěn)定的膠體顆粒，所以蛋白質(zhì)溶液和其他親水膠體溶液相 類似。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。在 一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至 變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個(gè)過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀 反應(yīng)

39、。這種反應(yīng)可分為以下兩種類型： 一、可逆沉淀反應(yīng)一、可逆沉淀反應(yīng) 在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部 結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去 后，能再溶于原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)，又叫 作不變性沉淀反應(yīng)。屬于這一類的反應(yīng)有鹽析作用；在低溫下， 乙醇、丙酮對(duì)蛋白質(zhì)的短時(shí)間作用以及利用等電點(diǎn)的沉淀等。 二、不可逆沉淀反應(yīng)二、不可逆沉淀反應(yīng) 在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)型遭到破 壞，失去原來的天然性質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋 白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑中的作用叫作不可逆沉淀反應(yīng)。 重金屬鹽、生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、

40、震蕩、超聲波，有 機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)的鹽 析作用 二 、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應(yīng) 三、蛋白質(zhì)可逆沉淀與不可逆沉淀的比較 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)的鹽析作用蛋白質(zhì)的鹽析作用 用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過程稱為蛋白質(zhì) 的鹽析作用。蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下，蛋 白質(zhì)分子被鹽脫去水化層，同時(shí)蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和， 結(jié)

41、果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭受破壞而沉淀析出。析出的蛋白質(zhì)仍 保持其天然蛋白的性質(zhì)，減低鹽的濃度時(shí)，還能溶解。 沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度不同，而鹽類不同也有 差異。例如：向含有清蛋白和球蛋白的雞蛋清溶液中加硫酸鎂或 氯化鈉至飽和，則球蛋白沉淀析出。加硫酸銨至飽和，則清蛋白 沉淀析出。另外，在等電點(diǎn)時(shí)，清蛋白可被飽和硫酸鎂或氯化鈉 或半飽和的硫酸銨溶液沉淀析出。所以在不同條件下，用不同濃 度的鹽類可將各種蛋白質(zhì)從混合溶液中分別沉淀析出，該法稱為 蛋白質(zhì)的分級(jí)鹽析。目前在酶的生產(chǎn)和制備、科研工作和臨床化 驗(yàn)等工作中廣泛應(yīng)用。 取一支試管加入3m1蛋白質(zhì)氯化鈉溶液和3m1飽和硫酸銨溶 液，混勻，靜

42、置約10min，球蛋白則沉淀析出，過濾后向?yàn)V液中 加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，達(dá) 到飽和為止。析出的沉淀為清蛋白。靜置，倒去上部清液，清蛋 白沉淀，取出部分加水稀釋，觀察它是否溶解，留存部分作透析 用。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 二、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應(yīng)二、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應(yīng) 1重金屬沉淀蛋白質(zhì) 2有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 3無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 4加熱沉淀蛋白質(zhì) 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 1、重金屬沉淀蛋白質(zhì)、重金屬沉淀蛋白質(zhì) 重金屬鹽類易與蛋白質(zhì)結(jié)合成穩(wěn)定的沉淀而

43、析出。蛋白 質(zhì)在水溶液中是酸堿兩性電解質(zhì)，在堿性溶液中(對(duì)蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn)而言)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的金屬離 子結(jié)合成蛋白質(zhì)鹽；在有機(jī)體內(nèi)，蛋白質(zhì)常以其可溶性的鈉 鹽或鉀鹽的形式存在；當(dāng)加入汞、鉛、銅、銀等重金屬鹽時(shí)； 則蛋白質(zhì)形成不溶性的鹽類而沉淀。經(jīng)過這種處理后的蛋白 質(zhì)沉淀不再溶解于水中，說明它已發(fā)生了變性。 重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)通常很完全，特別是在堿 金屬鹽類存在時(shí)。因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體 液中的蛋白質(zhì)；臨床上用蛋白質(zhì)解除重金屬鹽的食物性中毒。 但應(yīng)注意，使用乙酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，試劑不可加 過量，否則可使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。 取3支試管，各

44、加入約1m1蛋白質(zhì)溶液，分別加入3硝 酸銀34滴，0.5乙酸鉛13滴和0.1硫酸銅34滴，觀察 沉淀的生成。第一支試管的沉淀留作透析用，然后向第二、 三支試管再分別加人過量的乙酸鉛和飽和硫酸銅溶液，觀察 沉淀的再溶解。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 2有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 有機(jī)酸能使蛋白質(zhì)沉淀。三 氯乙酸和磺基水楊酸最有效，能 將血清等生物體液中的蛋白質(zhì)完 全除去，因此得到廣泛使用。取 兩支試管，各加入蛋白質(zhì)溶液約 0.5m1，然后分別滴加10三氯 乙酸和0.5磺基水楊酸溶液各 數(shù)滴，觀察蛋白質(zhì)的沉淀。 返 回 天水師范學(xué)院生物系

45、主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 3無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 濃無機(jī)酸(除磷酸外)都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不 可逆的沉淀反應(yīng)。這種沉淀作用可能是蛋白質(zhì) 顆粒脫水的結(jié)果。過量的無機(jī)酸(硝酸除外)可 使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。臨床診斷上，常 利用硝酸沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)，檢查尿中蛋白質(zhì) 的存在。 取3支試管，分別加入濃鹽酸15滴，濃硫 酸、濃硝酸10滴。小心地向3支試管中，沿管 壁加入蛋白質(zhì)溶液6滴，不要搖動(dòng)，觀察各管 內(nèi)兩液界面處有白色環(huán)狀蛋白質(zhì)沉淀出現(xiàn)。然 后，搖動(dòng)每個(gè)試管。蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)在過量的鹽 酸及硫酸中溶解。在含硝酸的試管中，雖經(jīng)振 蕩，蛋白質(zhì)沉淀也不溶解。 返 回 天水師

46、范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 4加熱沉淀蛋白質(zhì)加熱沉淀蛋白質(zhì) 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，變成不可逆的不溶狀態(tài)。 鹽類和氫離子濃度對(duì)蛋白質(zhì)加熱凝固有重要影響。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì) 的加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全、最迅速。在酸 性或堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子帶有正電荷或負(fù)電荷，雖加熱蛋白質(zhì)也不 會(huì)凝固。若同時(shí)有足量的中性鹽存在，則蛋白質(zhì)可因加熱而凝固。 取5支試管、編號(hào)，按下表加入有關(guān)試劑(單位：滴)： 將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸水浴中加熱10min，注意 觀察比較各管的沉淀情況。然后，將第3，4，5號(hào)管分別用10NaOH或10

47、 乙酸中和，觀察并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 將3，4，5號(hào)管繼續(xù)分別加入過量的酸或堿，觀察它們發(fā)生的現(xiàn)象； 然后，用過量的酸或堿中和第3，5號(hào)管，沸水浴加熱10min，觀察沉淀變 化檢查這種沉淀是否溶于過量的酸或堿中，并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 試劑 管號(hào) 蛋白質(zhì) 溶液 0.1%乙酸10%乙酸飽和NaCl10%NaOH蒸餾水 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 5 5 5 2 2 7 2 2 5 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 三、蛋白質(zhì)可逆沉淀與不三、蛋白質(zhì)可逆沉淀與不 可逆沉淀的比較可逆沉淀的比較 (1) 在蛋白質(zhì)可逆沉淀反應(yīng)中，用硫 酸銨鹽析所得

48、的清蛋白沉淀倒入透析 袋內(nèi)，用線繩將透析袋口扎緊，并扎 在玻璃棒上，使透析袋浸入盛有蒸餾 水的燒杯中進(jìn)行透析。每隔半小時(shí)換 水一次，細(xì)心觀察透析現(xiàn)象。 (2)在蛋白質(zhì)不可逆沉淀反應(yīng)中，用硝 酸銀沉淀所得到的蛋白質(zhì)沉淀倒入透 析袋內(nèi)，如前法進(jìn)行透析。 透析1h左右，比較以上兩透析袋中蛋 白質(zhì)沉淀所發(fā)生的變化，并加以解釋。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑一、試劑 1蛋白質(zhì)溶液（取5m1雞或鴨蛋清，用蒸 餾水稀釋至100m1，攪拌均勻后用4 8層紗布過濾，新鮮配制。） 2蛋白質(zhì)氯化鈉溶液取20m1蛋清，加蒸 餾水200m

49、1和飽和氯化鈉溶液100m1， 充分?jǐn)噭蚝螅约啿紴V去不溶物(加入 氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。 3硫酸銨粉末 4飽和硫酸銨溶液 53硝酸銀 60.5乙酸鉛 710三氯乙酸 8濃鹽酸 9濃硫酸 10濃硝酸 110.5磺基水楊酸 120.1硫酸銅 13飽和硫酸銅溶液 140.1乙酸 1510乙酸 16飽和氯化鈉溶 液 1710氫氧化鈉溶液。 二、器材二、器材 1試管 2試管架 3小玻璃漏斗 4濾紙 5玻璃紙 6玻璃棒 7線繩 8500m1燒杯 910ml量筒。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 底物

50、濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的 影響（米氏常數(shù)的測定）影響（米氏常數(shù)的測定） 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 原理原理 早在1913年Michaelis和Menten首先提出了酶促反應(yīng)進(jìn)度和底物濃度 的關(guān)系式。即米氏方程式： v= VS/(Km +S) 式中：v為反應(yīng)初速度，V為最大反應(yīng)速度，S為底物濃度，Km為米 氏常數(shù)，其單位為摩爾濃度。 Km值是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，一般說來，Km可以近似地表示酶與底 物的親合力。測定Km值是酶學(xué)研究中的一個(gè)重要方法。 LineweaverBurk作圖法是用實(shí)驗(yàn)方法則定及Km值的最常用的比較方 便的方法

51、。 Lineweaver和Burk將米氏方程改寫成倒數(shù)形式： 1/v= Km /V S+1/V 實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇不同的S，測定相對(duì)應(yīng)的v。求出兩者的倒數(shù)，以1/v對(duì) 1/S作圖，得到一個(gè)斜率為KmV的直線。將直線外推與橫軸相交，其 橫軸截矩為-1/S=1/Km,由此求出Km值。這個(gè)方法比較簡便。 本實(shí)驗(yàn)以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用LineweaverBurk雙倒數(shù)作 圖法測定Km值。 胰蛋白酶是胰液中的一個(gè)酶，它催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸(L精氨酸 和L賴氨酸)的羧基所形成的肽鍵水解。水解時(shí)生成自由氨基，因此可 以用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)

52、驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 分別向6個(gè)小錐形瓶中加入5ml甲醛溶液和1滴酚酞并滴加01mol/l 標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液直至混合物呈微粉紅色。所有錐形瓶中的顏色應(yīng)當(dāng)一致。 量取100ml酪蛋白溶液，加到一錐形瓶中，在37水浴中保溫10min。 將胰蛋白酶液也在37水浴中保溫10min。然后精確地量取10ml酶液加到 酪蛋白溶液中(同時(shí)記時(shí)！)。充分混合后，隨即取出10ml反應(yīng)混合物(作為 零時(shí)的樣品)至一含甲醛的錐形瓶中。向所取的反應(yīng)混合物中加入酚酞(每 毫升混合物加入1滴酚酞)用0.1mollNaOH滴定直至呈微弱但持續(xù)的粉紅 色，在接近到達(dá)終點(diǎn)之前，再加入指示劑(每毫升氫氧

53、化鈉溶液加入1滴酚 酞)。然后，繼續(xù)滴至終點(diǎn)，記下所用0.1moll氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。 在2、4、6、8和10min時(shí)，分別取出10ml消化樣品，準(zhǔn)確地照上法操 作在每個(gè)樣品中滴定終點(diǎn)的顏色應(yīng)當(dāng)一致的。用增加的滴定度對(duì)時(shí)間作圖， 測定初速度。 配制不同濃度的酪蛋白溶液(7.5、10、15、20、30g/l)測定不同底物濃 度時(shí)的活力。 用實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果，以1/v對(duì)1/S作圖，求出V和Km的數(shù)值。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑和材料一、試劑和材料 140gl酪蛋白溶液(pH8.5)1000ml， (40g酪蛋白

54、溶解在大約900ml水中再 加20mllmollNaOH，連續(xù)振蕩此 懸浮液，微熱直至溶解，最后用 lmollHCl或1mollNaOH調(diào)到 pH8.5，并用水稀釋至l000ml)。 2胰蛋白酶溶液(40gl) 2000ml (可 用由胰臟制備的粗胰蛋白酶制劑配 制并放入冰箱內(nèi)保存。) 3甲醛溶液(400gl) 500ml 4酚酞(2.5gl乙醇) 200ml 5標(biāo)準(zhǔn)NaOH(約0.1moll)溶液 4000ml 二、器材二、器材 150ml及150ml錐形瓶 225ml堿滴定管，滴 定臺(tái)、蝴蝶 310ml及5ml吸管 4100ml量筒 5恒溫水浴 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn)

55、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南注意事項(xiàng) 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定(pH法法) 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 原理原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 。蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài) 和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到 一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等， 在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽極移 動(dòng)，此時(shí)，溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)時(shí)，蛋 白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化

56、；可利用此種變化測定各 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測其溶解度最 低時(shí)的溶液pH值。 本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定 酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與醋酸鈉(醋酸鈉混合在酪 蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩 沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的 pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 蛋白質(zhì)在溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)在溶液中存在下列平衡： 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 操作操作 取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確地加 入各試劑，然后混勻（

57、在測定等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)中，要求各 種試劑的濃度和加入量相當(dāng)準(zhǔn)確）。 向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶1ml；加一管， 搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、 4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10min后，再觀察其混 濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。 返 回 試管號(hào)蒸餾水（m l ） 0.01N 醋酸 （m l） 0.1N 醋酸 （m l） 1.0N 醋酸 （m l） 18.40.6 28.70.3 381 47.41.6 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 試劑與器材試劑與器材 一、試劑一、試劑 1 0.4酪蛋白醋酸鈉溶液 2

58、00ml（取0.4g 酪蛋白，加少量水在乳缽內(nèi)仔細(xì)地研磨， 將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200ml錐形 瓶，用少量4050的溫水洗滌乳缽， 將 洗 滌 液 也 移 入 錐 形 瓶 內(nèi) 。 加 入 10ml1N醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到 50水浴，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到 酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶 液全部移至100ml容量瓶內(nèi)，加水至刻 度，塞緊玻塞，混勻。） 21.00N醋酸溶液 100ml 30.10N醋酸溶液 100ml 40.0lN醋酸溶液 50ml 二、器材二、器材 1水浴鍋 2溫度計(jì) 3200ml錐形瓶 4100ml容量瓶 5吸管 6試管 7試管架 8乳缽 返 回 天水師范學(xué)院生

59、物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 酶的特性酶的特性 溫度對(duì)酶活力的影響 pH對(duì)酶活性的影響 唾液淀粉酶的活化和抑制 酶的專一性 返 回 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 1、溫度對(duì)酶活力的影響、溫度對(duì)酶活力的影響 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 2、pH對(duì)酶活性的影響對(duì)酶活性的影響 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

60、高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 3、 唾液淀粉酶的活化和抑制唾液淀粉酶的活化和抑制 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 返 回 實(shí)驗(yàn)器材、藥品 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)操作 4、 酶的專一性酶的專一性 天水師范學(xué)院生物系 主頁 提高實(shí)驗(yàn) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 高級(jí)實(shí)驗(yàn) 成員 本站指南 1-1原理原理 酶的催化作用受溫度的影響，在 最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。大 多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度為3740， 植物酶的最適溫度為5060。 酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性與其存在形式 有關(guān)。有些酶的干燥制劑，雖加熱到 100其活性并無明顯改變，但在 100的溶液中卻很快地