肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性的論文

1、肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性的論文肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性的論文 【摘要】 目的: 評價酪蛋白裂解酶p6.0 l，dntp2.4 l，p13 l，p23 l，spn dna 1.5 l，la taq 0.4 l. 在pcr儀上按下列條件進行擴增：95預熱5 min后反應30個周期：94 1 min，53 1 min，72 1 min. 末輪后72延伸 5 min. 取5 l反應產(chǎn)物置10 g/l瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，dna膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物. 1.2.2ta克隆載體的構(gòu)建與鑒定將回收純化的12個pcr產(chǎn)物克隆至pmd18t載體，轉(zhuǎn)入dh5感受態(tài)細胞，在amp+l

2、b平板上培養(yǎng)得到多個陽性克隆，單個陽性克隆細菌經(jīng)增菌后進行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒送往重慶醫(yī)科大學感染實驗室做雙向測序. 1.2.3序列比對與氨基酸序列預測利用dnassist軟件，將12個重組克隆質(zhì)粒雙向測序的結(jié)果及預測的氨基酸序列與genbank數(shù)據(jù)庫對已公布的tigr4 spn全基因組序列進行相似性分析. 1.2.4抗原表位預測用抗原表位預測工具antigenic predicted antigenic peptides（ a href=/tools/）分析不同血清型spn target=_blank clpp蛋白的抗原表位及其氨

3、基酸組成. /tools/）分析不同血清型spn clpp蛋白的抗原表位及其氨基酸組成. 1.2.5petclpp重組載體的誘導表達及純化原核表達系統(tǒng)pet32a/clppe.coli bl21在終濃度1 mmol/l iptg，37，250 r/min條件下誘導目的重組蛋白clpp的表達. 收集的菌體超聲波碎菌后，采用ninta柱純化目的蛋白，以sdspage和biorad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白表達與提純效果. 將透析除鹽的純化蛋白溶液經(jīng)bradford法定量后備用. 1.2.6anticlpp抗血清的制備稀釋后重組clpp蛋白溶

4、液與等體積的cfa或ifa充分混勻成乳狀，在小鼠腹腔下接種制備好的抗原蛋白. 初次免疫時小鼠接受含200 l的cfa與重組蛋白混合物；小鼠再次與末次免疫時接受200 l的ifa與重組蛋白混合物. 小鼠經(jīng)3次免疫后，分離小鼠血清，并用elisa法測其anticlpp抗體效價. 1.2.7estern blot檢測將12株spn在c+y培養(yǎng)基中增菌至對數(shù)生長中后期（a620 nm 0.50.6左右），各取2 ml菌液離心取沉淀. 沉淀用pbs洗3次，用1上樣buffer處理后，于100水浴5 min. 全菌裂解物經(jīng)sdspage電泳分離后轉(zhuǎn)膜. 以anticlpp多克隆抗體為一抗（1400)，羊抗

5、鼠hrpigg為二抗（15000），dab為顯色底物，estern blot檢測菌體中clpp蛋白的表達，以金黃色葡萄球菌作為對照. 2結(jié)果 2.1目的基因pcr產(chǎn)物12株細菌的pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見清晰的擴增條帶，產(chǎn)量高，所有pcr產(chǎn)物的分子大小一致，都位于600 bp左右. 2.2ta克隆載體的構(gòu)建與鑒定將12個重組克隆質(zhì)粒雙酶切后，經(jīng)10 g/l的瓊脂糖凝膠電泳，于期望位置上出現(xiàn)目的條帶，證明clpp開放讀碼框架正確克隆入pmd18t載體，同時菌落pcr結(jié)果也證明基因克隆正確. 2.3測序結(jié)果與序列比對不同株的clpp基因編碼區(qū)大小與tigr4菌株中clpp基因一樣，均為59

6、1 bp，起始密碼子為atg，終止密碼子為taa，編碼196個氨基酸，基因序列一致性超過99%. 由于遺傳密碼子的簡并性，預測的氨基酸序列一致性則為99.5%以上. 經(jīng)生物學信息軟件分析結(jié)果顯示，serotype 4，5，6b 三菌株clpp氨基酸序列與tigr4菌株clpp氨基酸序列僅存在著一個氨基酸的差異，serotype 1 spn與tigr4菌株clpp氨基酸序列僅存在著兩個氨基酸的差異，其余血清型與tigr4菌株clpp氨基酸序列完全一致. 2.4抗原表位分析結(jié)果12株spn clpp蛋白的抗原表位數(shù)目相同（分別含7個抗原表位）并且氨基酸組成及分布完全一致. 2.5融合蛋白及其ant

7、iclpp抗體效價轉(zhuǎn)化菌經(jīng)iptg誘導后，較未誘導菌有一條明顯增粗的蛋白條帶，mr約為42103左右，與期望值相符合（clpp蛋白約為mr 21103，再加上mr 21103左右的硫氧還蛋白）. 蛋白溶液經(jīng)鎳離子柱親和層析后透析，sdspage證明純化產(chǎn)物為單一蛋白，純度達90%. 該蛋白免疫小鼠后用elisa法測得的血清效價為168 000（圖3）. 2.6clpp蛋白的表達spn全菌裂解物經(jīng)電泳分離后，與制備的anticlpp血清反應，12型spn全菌裂解物mr均在21103的位置出現(xiàn)特異性反應條帶，而陰性對照未見反應條帶出現(xiàn). 提示不同血清型spn中均有clpp蛋白抗原的表達. 3討論

8、蛋白疫苗是spn的第三代疫苗. 目前認為理想的spn蛋白質(zhì)疫苗的標準應包括:能在細胞壁表達或者以分泌方式表達、在人體內(nèi)抗原性高、能誘導殺菌的抗體和具有高度的保守性. 隨著基因組學與蛋白組學的發(fā)展，spn毒力相關(guān)蛋白候選疫苗不斷地被篩選出來. 但是一些蛋白由于等位基因的變異5-7，針對于該蛋白的抗體升高不能識別其等位基因變異的表達產(chǎn)物，從而不能誘導針對不同血清型菌株廣泛的免疫保護. 因此，候選疫苗是否具有誘導高水平、能與不同種類的型或亞型菌株起交*反應的抗體的能力，是很多致力于spn疫苗的專家不斷尋找高保守蛋白疫苗的原因8-9. 我們要評價clpp候選蛋白疫苗的價值就應考慮其在不同血清型spn的

9、保守性，并考慮clpp是否在spn菌體中表達. 本研究選用分離自不同標本并且在中國比較常見的1012株不同血清型spn進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12株菌中clpp基因相當保守，其抗原表位氨基酸組成以及分布完全一致，無抗原位點的突變，而且12株spn菌體蛋白中都有clpp蛋白的表達. 我們的結(jié)果初步表明：clpp在不同血清型spn中高度保守，在不同型菌體中都有表達. 細胞壁表達的高保守性蛋白是首選的疫苗靶點. 目前研究較多的幾個spn蛋白質(zhì)疫苗如pspa11，pspc6和ply12等，pspa和pspc雖在細胞壁表達，但由于等位基因變異，保守性相對較差；ply雖具有較高的保守性，但在細胞內(nèi)表達，其抗

10、體難以透過細胞壁與之結(jié)合，疫苗保護效果難以得到保證. 而clpp在spn熱休克后從細胞內(nèi)向細胞壁易位3，同時具有高度的保守性，因此它是spn很好的疫苗靶點，將其單獨使用或與其他的蛋白疫苗組合使用，可能會使spn蛋白疫苗的研究取得突破性進展，從而為我們自主開發(fā)廣保護范圍的spn疫苗提供理論基礎(chǔ). 另外我們也采用了blast方法分析了spn clpp與鄰近種屬細菌clpp基因序列的相似性，發(fā)現(xiàn)spn clpp與許多其它種屬細菌的clpp基因序列具有高度的同源性，比如spn的clpp與唾液酸鏈球菌clpp的預測氨基酸序列相似程度為87%88%，與無乳鏈球菌clpp的預測氨基酸序列相似程度為91%92

11、%. clpp可能在這些菌屬中存在相同的抗原表位，并可能誘發(fā)交*反應，這應該引起注意. 總之，在大規(guī)模人類免疫接種前對這類高保守蛋白進行徹底的安全性調(diào)查，將是非常必要的.【參考文獻】 1 bogaert d, hermans p, adrian pv, et al. pneumococcal vaccines: an update on current strategiesj. vaccine, 2004,22:2209-2220.2 yu ay, houry a. clpp: a distinctive family of cylindrical energydependent serine

12、 proteasesj. febs lett, 2016,581:3749-3757.3 kon hy, ogunniyi ad, choi mh, et al. the clpp protease of streptococcus pneumoniae modulates virulence gene expression and protects against fatal pneumococcal challengej. infect immun, 2004,72:5646-5653.4 butler sm, festa ra, pearce mj, et al. selfpartmen

13、talized bacterial proteases and pathogenesisj. mol microbiol, 2006,60:553-562.5 moscoso m, obregon v, lopez r, et al. allelic variation of polymorphic locus lytb, encoding a cholinebinding protein, from streptococci of the mitis groupj. appl environ microbiol, 2005,71:8706-8713.6 iannelli f, oggioni

14、 mr, pozzi g. allelic variation in the highly polymorphic locus pspc of streptococcus pneumoniaej. gene, 2002,284:63-71.7 hollingshead sk, becker r, briles de. diversity of pspa: mosaic genes and evidence for past rebination in streptococcus pneumoniaej. infect immun, 2000,68:5889-5900.8 barocchi ma

15、, censini s, rappuoli r. vaccines in the era of genomics: the pneumococcal challengej. vaccine, 2016,25:2963-2973.9 giefing c, meinke al, hanner m, et al. discovery of a novel class of highly conserved vaccine antigens using genomic scale antigenic fingerprinting of pneumococcus ith human antibodiesj. j exp med, 2016,205:117-131.10 liu y, ang h, chen m, et al. serotype distribution and antimicrobial resistance patterns of streptococcus pneumoniae isolated from children in china younger than 5 yearsj. diagn microbiol infect dis, 2016，61：256-263.11 胥文春,曹炬,許頌霄,等. pspa免疫小鼠抗肺炎鏈球菌侵襲性感染研究j.