流行性腦脊髓膜炎實驗室診斷

1、流行性腦脊髓膜炎實驗室診斷 天津市衛(wèi)生防病中心病原生物學(xué)部 井良義何謂流行性腦脊髓膜炎？流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦），是由腦膜炎奈瑟菌（neisseria meningitides，nm）通過呼吸道傳播所引起的化膿性腦膜炎，常在冬春季節(jié)引起發(fā)病與流行,患者以兒童為多見，現(xiàn)在成年人發(fā)病有增多趨勢。人受nm 感染后大多數(shù)表現(xiàn)為鼻咽部帶菌狀態(tài)，只有少數(shù)成為流腦患者。 正常人群中nm帶菌率可達5 30%。，帶菌者為流腦流行的重要傳染源。細菌經(jīng)飛沫傳播，患者潛伏期1 4天，其發(fā)展經(jīng)過可分為三期：1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有時局部有炎癥。2.少數(shù)細菌侵入血流，造成單純 菌血癥，可有突然發(fā)作的惡

2、寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐等，并可有出血性或紅斑性皮疹，或稱淤血點。3.大量細菌侵入，由血液或淋巴到達腦脊髓膜，引起腦脊髓膜炎的癥狀與體征，如頭痛、嘔吐、頸項強直、發(fā)熱等一般腦膜炎癥狀。適宜的檢測樣品鼻咽拭子、血液、皮膚粘膜出血點擠出液、血清及腦脊液等。其中腦脊液、血液、皮膚粘膜出血點擠出液中檢出腦膜炎奈瑟氏菌可直接作為確診依據(jù)。樣品采集與運送樣品采集與運送 樣品采集（一）樣品采集（一） 腦脊液：無菌操作，吸出csf 35ml，立即放到無菌試管內(nèi)離心(2000 3000r/min，30min)，用滅菌過的毛細管吸取沉淀物直接接種到10羊血巧克力色瓊脂上(csf上清液部分供檢測nm特異抗原，亦可將其置

3、于20待測)，5二氧化碳環(huán)境37培養(yǎng)24 72h，每日檢查細菌生長的情況，及時分離純培養(yǎng)物供鑒定。樣品采集（二）樣品采集（二） 血液：采取病人急性期靜脈血液6ml，無菌操作往盛有30ml增菌用的葡萄糖肉湯三角瓶內(nèi)注入4ml血液(余下的2ml血液同上離心后吸出血清，供檢測nm特異抗原和抗體，亦可將其置于一20待測)，同上述條件培養(yǎng)2472h，每日進行分離培養(yǎng)。 樣品采集（三）樣品采集（三）淤血點：選病人皮膚上的新鮮淤血點或淤斑，消毒后用針頭挑破，擠出組織液，用無菌棉簽蘸取先接種含雙抗的葡萄糖增菌肉湯管中增菌812h后分離培養(yǎng)或直接接種10羊血巧克力色瓊脂；涂片，干后革蘭染色，直接鏡檢。 樣品采集

4、（四）樣品采集（四）咽拭子：用長柄棉拭子采咽后壁兩側(cè)分泌物，立即接種卵黃雙抗培養(yǎng)基或巧克力雙抗平板，也可將咽拭子放入液體雙抗增菌管內(nèi)，增菌8 12h后分離培養(yǎng) 。咽拭子接種咽拭子接種不合格咽拭子接種不合格咽拭子接種樣品的處理和運送樣品的處理和運送 早期采集樣品：應(yīng)盡可能采集病人用藥前的早期樣品，這可以明顯提高病原的檢出水平。及時處理樣品：應(yīng)盡可能地做到床邊接種，若無可能則應(yīng)在最短的時間內(nèi)送到實驗室進行接種培養(yǎng)。保溫運送：應(yīng)盡可能保持樣品處于2036之間，切記不能低溫運送（檢測抗體的血清標(biāo)本除外）。 流腦病原學(xué)檢查方法流腦病原學(xué)檢查方法 生長特性腦膜炎雙球菌為專性需氧菌，初次分離時需510%的二

5、氧化碳環(huán)境才能生長，最適生長溫度為37 。 菌落特征及菌體形態(tài)菌落：nm接種于巧克力色瓊脂平皿上，5%co2，37 培養(yǎng)24小時后，其菌落直徑約1mm ，表面突起、光滑、濕潤、圓整、略帶灰白色、半透明、不溶血、無色素。細菌形態(tài)：為革蘭氏陰性，呈卵圓形和腎形，0.80.6大小。常成對排列，鄰近兩邊扁平凹陷 菌 落 特 征菌 落 特 征腦 脊 液 涂 片 生化特征 分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不分離蔗糖、果糖和乳糖。過氧化酶和氧化酶陽性 血清分群鑒定 檢查從病人分離的疑似nm時，先用多價、多價、多價抗血清檢測，如果陽性再用分群血清（a群、 b群、c群、w135群抗血清等）檢測。不與鹽水發(fā)生凝集

6、，與一種腦膜炎抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，即為某一型的流腦菌。在鹽水中發(fā)生凝集反應(yīng)，不能作為抗血清分群。菌種保存菌種保存 短期保存：保存腦膜炎雙球菌，用卵黃鹽水保存，可保存7天。2長期保存：最好方法是低溫冷凍或冷凍干燥。所有的細菌都可在-70冰箱中冷凍保存。將腦膜炎雙球菌接種巧克力平板中，放二氧化碳培養(yǎng)箱中35 37 孵育18 20小時，收集細菌放到含1ml脫脂牛奶的2ml螺蓋冷凍瓶中。將菌苔在管壁研磨振蕩，使細菌分散在培養(yǎng)基中。-70 低溫冰箱分類保存。 流腦血清學(xué)檢查方法（一）流腦血清學(xué)檢查方法（一） 玻片凝集試驗:應(yīng)用玻片凝集試驗對nm病原菌株或帶菌者菌株進行血清學(xué)分群。nm診斷血清：國產(chǎn)售品有

7、多價（包含a、b、c、d群），多價 含1889（y）、 1890（h）、1892（29e），多價含319（w135）、1916（x）、1486（i）、1811（k）群及各群單價血清，共計14種。（括號內(nèi)為國際編碼） 流腦血清學(xué)檢查方法（二）流腦血清學(xué)檢查方法（二）酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）：應(yīng)用elisa間接法測病人急性期和恢復(fù)期血清中抗a群流腦igg的抗體水平。此方法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測定。若病人恢復(fù)期血清抗體效價較急性期呈現(xiàn)4或4倍以上升高有追溯診斷的意義。 流腦血清學(xué)檢查方法（三）流腦血清學(xué)檢查方法（三）殺菌力試驗：應(yīng)用微量殺菌力試驗(ttc法)測定病人急性期和恢復(fù)期血清中

8、對nm的殺菌抗體水平。此方法也可用于健康人群的血清抗體測定。流腦其它檢查方法（一）流腦其它檢查方法（一）膠乳凝集試驗應(yīng)用膠乳凝集實驗測定病人csf、急性期血清和尿中nm群特異抗原，輔助流腦臨床診斷?？捎檬惺鄣哪X膜炎乳膠凝集試劑盒（如法國梅里埃公司的試劑盒）。方法：一滴乳膠試劑（30l）加上一滴病人的腦脊液，涂勻，在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性。 流腦其它檢查方法（二）流腦其它檢查方法（二） pcr檢測：應(yīng)用pcr檢查病人急性期血清或csf中nm的dna特異片段，對流腦病人進行早期診斷。 培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備巧克力色血液瓊脂： 成份：營養(yǎng)瓊脂（ph7.6） 100ml 脫纖維血 510ml制法：

9、將營養(yǎng)瓊脂溶解，以無菌手續(xù)加入羊血，搖勻。置水浴鍋內(nèi)，維持在902030min。待培養(yǎng)基冷至50 時才傾注平板。如做病人密切接觸者或健康人群帶菌調(diào)查時，則需加雙抗，每1000ml培養(yǎng)基加入多粘菌素4.2mg（或2.5萬單位），萬古霉素3.3mg。卵黃鹽水將新鮮雞蛋洗凈，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋殼，以無菌操作于雞蛋的一端開一小孔，使蛋清全部流盡，蛋黃倒入置有玻璃珠的三個燒瓶中，打碎后，一份蛋黃加一份生理鹽水，再在搖珠瓶中振搖，使其混勻呈乳狀分裝試管，56 加溫30 min ，置37 作無菌試驗。（腦膜炎雙球菌保菌用） 增菌肉湯成份：新鮮牛肉湯 100ml 葡萄糖 0.5g配制： 混合上述成份，調(diào)ph至7.47.6分裝試管，2ml/管或30ml/瓶，高壓滅菌10磅10分鐘，無菌檢驗合格后供增菌用。 診斷試劑診斷試劑1、診斷血清：中國cdc傳控所呼吸道細菌室流