血脂及血漿脂蛋白檢驗(yàn)

1、Page 1Page 2第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 血清總膽固醇測(cè)定血清總膽固醇測(cè)定第三節(jié)第三節(jié) 血清三脂酰甘油測(cè)定血清三脂酰甘油測(cè)定第四節(jié)第四節(jié) 血清高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定血清高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定第五節(jié)第五節(jié) 血清低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定血清低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定第六節(jié)第六節(jié) 血清載脂蛋白血清載脂蛋白A1A1和和B B測(cè)定測(cè)定第七節(jié)第七節(jié) 血清脂蛋白電泳分析血清脂蛋白電泳分析第八節(jié)第八節(jié) 血清脂蛋白（血清脂蛋白（a a）測(cè)定）測(cè)定n本章內(nèi)容概要本章內(nèi)容概要3Page 4n血脂及血漿脂蛋白血脂及血漿脂蛋白n脂蛋白代謝紊亂脂蛋白代謝紊亂Page 5 血脂:是指血漿中脂類的總稱。屬于中性脂

2、肪（甘油三酯和膽固醇）和類脂（磷脂、糖脂、固醇、類固醇）的總稱 n定義定義: 脂蛋白:脂類難溶于水,正常血漿脂類物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合成脂蛋白的形式存在。 Page 6超速離心法超速離心法: :根據(jù)脂蛋白在一定根據(jù)脂蛋白在一定的介質(zhì)中漂浮的介質(zhì)中漂浮 速率不同而進(jìn)行分離的方法。速率不同而進(jìn)行分離的方法。 電泳分離法電泳分離法: :根據(jù)不同密度的脂蛋白所含蛋白質(zhì)的根據(jù)不同密度的脂蛋白所含蛋白質(zhì)的 表面表面不同不同, ,利用電泳將其分離利用電泳將其分離, , 并與血漿蛋白質(zhì)的遷移率比較以判斷并與血漿蛋白質(zhì)的遷移率比較以判斷 其部位。其部位。 分離方法分離方法Page 7乳糜微粒乳糜微粒（chylomic

3、ron,chylomicron,CMCM）極低密度脂蛋白極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,very low density lipoprotein,VLDLVLDL）中間密度脂蛋白（中間密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein,intermediate density lipoprotein,IDLIDL）低密度脂蛋白低密度脂蛋白（low density lipoproteinlow density lipoprotein, ,LDLLDL）高密度脂蛋白高密度脂蛋白（high density lipoproteinhi

4、gh density lipoprotein, ,HDLHDL）脂蛋白（脂蛋白（a a）（lipoprotein (a),lipoprotein (a),Lp(a)Lp(a)） 乳糜微粒、前乳糜微粒、前- - 、 和和 四條脂蛋白區(qū)帶四條脂蛋白區(qū)帶 Page 8Page 9u組成組成: 蛋白質(zhì)、三脂酰甘油、磷脂（蛋白質(zhì)、三脂酰甘油、磷脂（PLPL）、游離膽固醇（）、游離膽固醇（FCFC）及膽）及膽固醇酯（固醇酯（CECE）等成分組成。）等成分組成。Page 10其中蛋白質(zhì)部分稱為載脂蛋白（Apo） A ApoA A A B48 ApoB 載脂蛋白（a） B100 C ApoC C C ApoD

5、 近年來,還發(fā)現(xiàn)了Lp（a）Page 11n 1.1.乳糜微粒CM CM 顆粒最大, ,脂類含量高達(dá)98%,98%,密度極低。 由小腸粘膜細(xì)胞在吸收食物脂類（主要是甘油三酯）時(shí)合成, ,經(jīng)乳糜導(dǎo)管, ,胸 導(dǎo)管到血液。 主要功能為運(yùn)輸甘油三酯。n 2.2.極低密度脂蛋白vldl vldl 主要在肝臟利用脂肪酸和葡萄糖合成。 若食物攝取過量糖或體內(nèi)脂肪動(dòng)用過多, ,均可導(dǎo)致血vldlvldl增高。vldlvldl中脂 類占85%-90%,85%-90%,其密度也很低。 主要功能為vLdLvLdL是運(yùn)輸甘油三酯。n 3.3.低密度脂蛋白LdLLdL的結(jié)構(gòu)大致可分為三層: :內(nèi)層 中層 外層 游離膽

6、固醇分布于三層之中。n 4.4.高密度脂蛋白HBL HBL 是一組不均一的脂蛋白 HBL HBL主要由合成, ,也可合成 HBL HBL按密度大小又可分為HBL1HBL1、HBL2HBL2和HBL3HBL3。HBL1HBL1又稱為HBLc,HBLc,僅在攝取高膽固醇 膳食后才在血中出現(xiàn), ,健康人血漿中主要含HBL2HBL2和HBL3HBL3。 HBL HBL主要是將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝進(jìn)行代謝。n 5. 5. 脂蛋白（a a） lp(a)lp(a)核心部分由甘油三酯、磷脂、膽固醇、膽固醇酯等脂質(zhì) 和載脂蛋白b100b100組成, ,結(jié)構(gòu)類似LdLLdL lp(a) lp(a)含有兩類載脂

7、蛋白, ,即apoB100apoB100和apo(a)apo(a) lp(a) lp(a)是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因子。 Page 12結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): :大致為球形顆粒,由兩大部分組成即即疏水性的內(nèi)核疏水性的內(nèi)核和和親水性的外殼（圖親水性的外殼（圖10-110-1）。）。內(nèi)核內(nèi)核由不同量的CE與TG組成表層表層由載脂蛋白、PL及FC組成FC及PL的極性基團(tuán)向外露在血漿中,載脂蛋白是兼性化合物,它的疏水部分掩蔽在脂蛋白中,而親水部分突出于脂蛋白顆粒的表面。 Page 13血漿脂蛋白的結(jié)構(gòu)與載脂蛋白的功能有密切的聯(lián)系血漿脂蛋白的結(jié)構(gòu)與載脂蛋白的功能有密切的聯(lián)系脂蛋白的蛋白部分稱為載脂蛋白脂蛋

8、白的蛋白部分稱為載脂蛋白(Apo) (Apo) u種類種類: 按按19721972年年AlaupovicAlaupovic建議的命名方法建議的命名方法, ,用英文字母用英文字母順序編碼順序編碼, ,分為分為ApoAApoA、B B、C C、D D、E E、F F、G G、H H、J J等。由等。由于氨基酸組成的差異于氨基酸組成的差異, ,每一型又可分若干亞型。每一型又可分若干亞型。 Page 14 維持脂蛋白的結(jié)構(gòu)ApoA、ApoC、ApoE調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶ApoA、ApoC能激活磷脂酰膽堿膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶（LCAT） 促進(jìn)膽固醇的酯化,ApoC激活脂蛋白脂肪酶（LPL）,促進(jìn) CM和

9、VLDL中三脂酰甘油降解識(shí)別脂蛋白受體ApoE能識(shí)別肝細(xì)胞CM殘余顆粒受體 ApoB100識(shí)別LDL受體Page 15u定義定義: 脂蛋白受體是一類位于細(xì)胞膜上的脂蛋白受體是一類位于細(xì)胞膜上的糖蛋白糖蛋白。它能以高。它能以高度的親和方式與相應(yīng)的脂蛋白配體作用度的親和方式與相應(yīng)的脂蛋白配體作用, ,從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)脂蛋白的攝取與代謝脂蛋白的攝取與代謝, ,進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外脂蛋白的水平。進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外脂蛋白的水平。 Page 16 不僅是運(yùn)送細(xì)胞所必需的脂蛋白不僅是運(yùn)送細(xì)胞所必需的脂蛋白, ,也能消除血和外周組織中具也能消除血和外周組織中具有潛在致動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白。有潛在致動(dòng)脈粥

10、樣硬化的脂蛋白。 已有很多種已有很多種, ,主要有主要有LDLLDL受體、殘粒受體及清道夫受體受體、殘粒受體及清道夫受體。Page 17 不僅能識(shí)別ApoB100、ApoE,在細(xì)胞結(jié)合、攝取和降解LDL及其它含ApoB100的脂蛋白過程中起中介作用,對(duì)維持細(xì)胞和全身膽固醇平衡起重要作用。 能識(shí)別ApoE,是清除血液循環(huán)中CM殘粒和-VLDL殘粒的主要受體,它也能結(jié)合含ApoE的HDL。 主要存在于巨噬細(xì)胞表面,介導(dǎo)修飾LDL(包括氧化LDL和-VLDL)從血液循環(huán)中清除。 Page 18u血漿脂蛋白代謝分類血漿脂蛋白代謝分類:外源性代謝途徑外源性代謝途徑:指食物中攝入的膽固醇和甘油三酯在 小腸

11、中合成CM及CM代謝的過程 。內(nèi)源性代謝途徑內(nèi)源性代謝途徑:指肝臟合成VLDL,然后轉(zhuǎn)變?yōu)镮DL和LDL 并被肝臟或其它器官代謝的過程 膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn):HDLHDL參與將膽固醇從外周組織運(yùn)輸?shù)礁闻K的過程。參與將膽固醇從外周組織運(yùn)輸?shù)礁闻K的過程。 Page 19（一）高脂蛋白血（一）高脂蛋白血癥癥 高脂血癥是指血漿中膽固醇或和甘油三酯水平升高。血漿脂類以血漿脂蛋白形式存在,因此,高脂血癥一定時(shí)會(huì)導(dǎo)致高脂蛋白血癥。 Page 20 1 1表型分型法表型分型法 主要是基于各種血漿脂蛋白升高的程度不同而進(jìn)行分型。該分類法不包括病因?qū)W,故稱表型分類。 （1）型高脂蛋白血癥 又稱家族性高

12、乳糜微粒血癥 （2）a型高脂白血癥 （3）b型高脂蛋白血癥 （4）型高脂蛋白血癥 （5）型高脂蛋白血癥 （6）型高脂蛋白血癥 Page 21Page 22Page 23 繼發(fā)性高脂血癥繼發(fā)性高脂血癥: : 原發(fā)性高脂血癥原發(fā)性高脂血癥: : 繼發(fā)性者由一些全身性疾病引起血脂異常,如糖尿病、腎病綜合征、腎功能衰竭、甲狀腺功能減退癥、肝膽疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肥胖癥、飲酒等。此外,某些藥物如-受體阻斷劑、降壓藥等也可引起血脂異常。 在排除繼發(fā)性高脂血癥后,可診斷為原發(fā)性。已知部分原發(fā)性高脂血癥由先天性基因缺陷所致 Page 24 家族性高脂血癥的臨床特征家族性高脂血癥的臨床特征常 用 名基因缺陷臨

13、床特征表型分類家族性高膽固醇血癥 LDL受體缺陷以膽固醇升高為主,可伴輕度甘油三酯升高,LDL明顯增加,可有肌腱黃色瘤,多有冠心病和高脂血癥家族史。ab家族性Apo B100缺陷癥 ApoB100缺陷同上同上家族性混合型高脂血癥不清楚膽固醇和甘油三酯均升高,VLDL和LDL都增加,無黃色瘤,家族成員中有不同型高脂蛋白血癥,有冠心病家族史。b家族性異常脂蛋白血癥ApoE異常膽固醇和甘油三酯均升高,乳糜微粒和VLDL殘粒以及IDL明顯增加,可有掌皺黃色瘤,多為Apo E2（2/2）表型。家族性高甘油三酯血癥不清楚以甘油三酯升高為主,可有輕度膽固醇升高,VLDL明顯增加。Page 251 1家族性低

14、家族性低-脂蛋白血癥脂蛋白血癥2 2-脂蛋白缺乏血癥脂蛋白缺乏血癥3 3家族性低家族性低-脂蛋白血癥脂蛋白血癥26Page 27n 膽固醇是人體內(nèi)重要的脂類成分,具有重要的生理功能。 游離膽固醇 30% 血清總膽固醇（TC） 膽固醇酯 70% 引起動(dòng)脈粥樣硬化,形成堵塞性血管疾病。 Page 28 一、比色法一、比色法二、酶法二、酶法三、氣相色譜法三、氣相色譜法四、高效液相色譜法四、高效液相色譜法五、同位素五、同位素-稀釋質(zhì)譜法稀釋質(zhì)譜法Page 29n特點(diǎn)特點(diǎn): 常規(guī)測(cè)定中現(xiàn)已廣泛應(yīng)用酶法,酶法具有特異性好,精密度和靈敏度。由于操作簡(jiǎn)便,試劑無腐蝕性,特別適用于自動(dòng)生化分析,目前已成為測(cè)定膽

15、固醇的主要方法。 Page 30 膽固醇酯H2O 膽固醇游離脂肪酸 膽固醇O2 膽烷-4-烯-3-酮H2O2 H2O24氨基安替比林酚 醌亞胺4H2O CEH COD PODPage 311、酶應(yīng)用液2、參考血清3、器材 試管、刻度吸管、微量加樣器、分光光度計(jì)、 恒溫水浴箱Page 32實(shí)驗(yàn)操作取3支試管,按下表操作加入物（ml）測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 待測(cè)血清0.02參考血清0.02蒸餾水-0.02酶應(yīng)用液 2.002.00 2.00Page 33混勻,置于37水浴箱,放置15分鐘,以空白管調(diào)零點(diǎn),在510nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,分別讀取各管的吸光度。 測(cè)定管吸光度血清膽固醇（mmol/L）=

16、- 參考膽固醇濃度（mmol/L） 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度3.105.70 mmol/LPage 34主要缺點(diǎn)是主要缺點(diǎn)是:優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):本法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好本法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好,線性范圍寬。線性范圍寬。本法具有氧化酶反應(yīng)途徑的共同缺陷,易受到一些還原性物質(zhì)如尿酸、膽紅素、維生素C和谷胱甘肽等的干擾。 Page 35年齡與性別年齡與性別; ;長(zhǎng)期的高膽固醇、高飽和脂肪酸和高熱量飲食可使長(zhǎng)期的高膽固醇、高飽和脂肪酸和高熱量飲食可使TCTC增高增高; ;遺傳因素遺傳因素; ; 其它其它: :如缺少運(yùn)動(dòng)、腦力勞動(dòng)、精神緊張等可能使如缺少運(yùn)動(dòng)、腦力勞動(dòng)、精神緊張等可能使TCTC升高。升高。u

17、病理性高病理性高TCTC血癥血癥: :見于脂肪肝、肝臟腫瘤、甲狀腺功能亢進(jìn) 嚴(yán)重糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等。u病理性低病理性低TCTC血癥血癥: :見于肝臟疾病如急性肝壞死、肝硬化, 甲狀腺功能亢進(jìn),惡性貧血、溶血性貧血 營(yíng)養(yǎng)不良等36Page 37三酰酯甘油（TG）是由一分子甘油和三分子脂肪酸組成。每一分子三酰酯甘油含有23種不同的脂肪酸。Page 38氣相層析氣相層析高效液相層析高效液相層析紅外分光光度法紅外分光光度法散射比濁法散射比濁法化學(xué)法化學(xué)法酶法酶法Page 39n基本操作基本操作:（一）化學(xué)法（一）化學(xué)法1 1、抽提抽提: :關(guān)鍵是選用合適的抽提劑關(guān)鍵是選用合適的抽提劑, ,既要使甘

18、油三酯提取完全既要使甘油三酯提取完全, ,又要消除磷又要消除磷脂、游離甘油和葡萄糖等干擾物質(zhì)的影響。脂、游離甘油和葡萄糖等干擾物質(zhì)的影響。 2 2、皂化皂化: :甘油三酯水解生成甘油甘油三酯水解生成甘油, ,這一步大都采用這一步大都采用KOHKOH作皂化劑作皂化劑 3 3、氧化氧化: :過碘酸在酸性溶液中將甘油氧化成甲醛和甲酸過碘酸在酸性溶液中將甘油氧化成甲醛和甲酸 4 4、顯色顯色: :甲醛的定量主要有兩種方法甲醛的定量主要有兩種方法: :甲醛與變色酸甲醛與變色酸(4,5-二羥二羥-2,7-萘二磺酸萘二磺酸)在硫酸溶液中加熱生成紫色化合物在硫酸溶液中加熱生成紫色化合物 甲醛與乙酰丙酮在銨離子

19、甲醛與乙酰丙酮在銨離子(NH4+)存在下生成黃色的二乙酰二氫二甲基吡啶存在下生成黃色的二乙酰二氫二甲基吡啶 Page 40實(shí)踐步驟實(shí)踐步驟加入物（ml） 測(cè)定管 對(duì)照管 空白管 血清 0.02 - - 標(biāo)準(zhǔn)液 - 0.02 - 蒸餾水 - - 0.02 抽提液 2.5 2.5 2.5 0.04mol/L H2SO4 0.5 0.5 0.5加H2SO4時(shí)邊加邊搖,使其充分混勻,靜置分層后分別準(zhǔn)確吸取上清液于另外3支試管中 上清液 0.3 0.3 0.3 造化劑 1.0 1.0 1.0 混勻,在56恒溫水浴箱中保溫5min 氧化劑 1.0 1.0 1.0 顯色劑 1.0 1.0 1.0Page 4

20、1混勻后,置60 水浴20min,取出冷卻。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)415nm處,空白管調(diào)零,讀取各管吸光度。 測(cè)定管吸光度血清三酰酯甘油（mmol/L）= - 標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mmol/L） 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度0.561.70mmol/LPage 421.每加一次試劑需搖勻。2.皂化、氧化與顯色的溫度和時(shí)間對(duì)吸光度均有影響,因此,每批標(biāo)本都需要做標(biāo)準(zhǔn)管。3.以血漿作標(biāo)本時(shí),應(yīng)注意抗凝劑的影響,通常用EDTA-Na2.4.標(biāo)本應(yīng)及時(shí)分離,無論血清、血漿。Page 43( (二二) )酶法酶法n 原理 TG + 3H2O LPL 甘油 + 3脂肪酸 甘油 + ATP GK 磷酸甘油 + ADP 磷酸甘油 + O

21、2 GPO 磷酸二羥丙酮 + H2O2 2 H2O2 + 4-AAP+4-氯酚 POD 紅色醌類化合物 + 4H2OGOP、4-AAP、4-氯酚三者合稱PAP,故本法稱Page 44三酰酯甘油測(cè)定酶試劑2、三酰酯甘油水溶性標(biāo)準(zhǔn)液3、器材 試管、刻度吸管、微量加樣器、分光光度計(jì)、 37 恒溫水浴箱。Page 45取3支試管,按下表操作加入物（ml）測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 血清0.01標(biāo)準(zhǔn)液0.01蒸餾水-0.01酶試劑 1.001.00 1.00Page 46混勻后,置37 水浴15min,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500nm處,空白管調(diào)零,讀取各管吸光度。 測(cè)定管吸光度血清三酰酯甘油（mmol/L）=

22、 - 標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mmol/L） 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度0.561.70mmol/LPage 471、標(biāo)本必須新鮮,4 放置不宜超過3天,時(shí)間過長(zhǎng),游離 甘油升高。2、需用空腹血清作標(biāo)本。3、11.1mmol/L,需做稀釋。Page 48 TG隨年齡增長(zhǎng)而上升趨勢(shì),體重超標(biāo)往往偏高。 正常成人空腹脂肪餐（脂肪1g/kg體重）后,24h內(nèi)血清混濁程度及TG值高峰,8h后恢復(fù)正常。脂肪清除率較差者,清除時(shí)間延長(zhǎng)。病理性升高 見于原發(fā)性高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝、其他肝病、糖尿病、腎病綜合癥、胰腺炎、甲功能減退、妊娠等。病理性降低 見于原發(fā)性b脂蛋白缺乏癥,肝功能嚴(yán)重低下、甲功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能減退等

23、。49Page 50n 血清高密度脂蛋白（HDL）是密度最大的脂蛋白,由蛋白質(zhì)、磷脂、膽固醇及其酯、三酯酰甘油組成。n HDL中主要脂類是磷脂,以磷脂酰膽堿最多,膽固醇是HDL中含量占第二位的脂類,酯化和游離的膽固醇之比約3:1n HDL所含的蛋白質(zhì)主要是ApoA和ApoA,其中以ApoA更重要。雖然磷脂部分比膽固醇含量多,但測(cè)定膽固醇比測(cè)定磷脂更容易,故常以測(cè)定HDL-C含量代表HDL水平。Page 51 超速離心法超速離心法凝膠過濾層析法凝膠過濾層析法免疫化學(xué)法免疫化學(xué)法電泳法電泳法沉淀法沉淀法 沉淀法中的沉淀法中的林鎢酸林鎢酸- -鎂法鎂法Page 52Page 53沉淀劑2、酶試劑3、

24、參考血清4、器材 試管、刻度吸管、微量加樣器、分光光度計(jì)、 37 恒溫水浴箱。Page 54實(shí)驗(yàn)操作HDL的提取 于小離心管中加血清200uI和沉淀劑200uI,混勻,室溫（20 ,不得高于30 ）放置15min,然后3000rpm離心15min。取3支試管,按下表操作加入物（ml）測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 上清液0.050定值血清0.025蒸餾水-0.0250.050酶試劑2.002.00 2.00Page 55混勻,置于37水浴箱,放置15min,以空白管調(diào)零點(diǎn),在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,分別讀取各管的吸光度。 測(cè)定管吸光度HDL-C（mmol/L）= - 定值血清膽固醇濃度（mmol/L

25、） 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 1.161.42 mmol/L成人女性 1.291.55 mmol/LPage 56n 血清嚴(yán)重混濁時(shí)IDL和VLDL沉淀不完全,此時(shí)用生理鹽水將血清做1:1稀釋后再行沉淀,測(cè)定結(jié)果乘以2。n 血清中高膽紅素、維生素C、溶血都會(huì)有影響。Page 57 HDL-C與冠心病發(fā)病呈負(fù)相關(guān)HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危險(xiǎn)因素HDL-C大于1.55mmol/L被認(rèn)為是冠心病的“負(fù)”危險(xiǎn)因素 HDL-CHDL-C下降下降 多見于腦血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。HDL-CHDL-C增高增高 往往伴以低HDL-C,肥胖者的HDL-C也多偏低。吸煙可使HDL-C下降,適量飲

26、酒、長(zhǎng)期體力勞動(dòng)和運(yùn)動(dòng)會(huì)使HDL-C升高。58Page 59 低密度脂蛋白（LDL）由極低密度脂蛋白（VLDL）在血漿中轉(zhuǎn)變而來,是空腹血漿中含量最多的脂蛋白,約占脂蛋白總量的1/2以上。 LDL中的膽固醇占血漿膽固醇總量的60%70%,其中膽固醇酯占4/5,故有血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）之稱。Page 60LDL-CLDL-C測(cè)定沒有決定性方法。測(cè)定沒有決定性方法。目前多采用聚乙烯硫酸（目前多采用聚乙烯硫酸（PVSPVS）沉淀法）沉淀法Page 61空腹血清中主要含有HDL、LDL、VLDL。用聚乙烯硫酸鹽-聚乙二醇甲醚選擇性地沉淀LDL,離心后上清液中韓HDL、VLD測(cè)定出上清液

27、HDL-C和VLDL-C總和。同時(shí)測(cè)定血清總膽固醇含量。 LDL-C = TC -LDL-C = TC -（HDL-C + VLDL-CHDL-C + VLDL-C）Page 62實(shí)驗(yàn)操作LDL分離 于小離心管中加血清200uI和沉淀劑100uI,混勻,室溫（20 ,不得高于30 ）放置15min,然后3000rpm離心15min,取上清液與血清同時(shí)測(cè)定膽固醇。取3支試管,按下表操作 加入物（ml） 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管1 測(cè)定管2 空白管 標(biāo)準(zhǔn)液 0.03- 上清液 -0.03- 血清 -0.03- 蒸餾水 - 酶試劑 2.00-2.00-2.000.032.00Page 63混勻,置于37水浴箱

28、,放置5分鐘,以空白管調(diào)零點(diǎn),在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,分別讀取各管的吸光度。 測(cè)定管1吸光度上清血清膽固醇濃度= - 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液濃度 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 測(cè)定管2吸光度 總膽固醇濃度= - 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液濃度 標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 上清LDL-C = TC - 上清液膽固醇濃度 40歲以上成人 2.703.10 mmol/L合適水平 4.41 mmol/LPage 64 LDL-C水平與冠心病的發(fā)病率呈正相關(guān)LDL-C增高是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要脂類危險(xiǎn)因素由于TC水平同時(shí)也受HDL-C水平的影響,所以最好以LDL-C代替TC作為冠心病危險(xiǎn)因素指標(biāo)。臨床上以LDL-C水平作高脂蛋白血癥的治療決策及其

29、需要達(dá)到的治療目標(biāo)。 65Page 66ApoA 是HDL的主要結(jié)構(gòu)蛋白 約占HDL蛋白總量的64%ApoB100 是LDL的主要結(jié)構(gòu)蛋白 約占LDL蛋白總量的95%因此因此, , ApoAApoA和和 ApoB100ApoB100 可以直接反映可以直接反映HDLHDL和和LDLLDL的含量。的含量。Page 67血清載脂蛋白測(cè)定血清載脂蛋白測(cè)定n免疫化學(xué)法免疫化學(xué)法: : 單向免疫擴(kuò)散（單向免疫擴(kuò)散（RIDRID）電免疫分析（如火箭電泳法）電免疫分析（如火箭電泳法）放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）酶聯(lián)免疫吸附分析（酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISAELISA）免疫濁度法等免疫濁度法等 早

30、期早期目前目前: 目前比較適合于臨床實(shí)驗(yàn)室的是目前比較適合于臨床實(shí)驗(yàn)室的是免疫濁度法免疫濁度法, ,包括包括免疫散射比濁法（免疫散射比濁法（INAINA）和免疫透射比濁法（）和免疫透射比濁法（ITAITA）。）。 Page 68Page 691、磷酸鹽氯化鈉緩沖液2、200g/L 聚乙二醇磷酸鹽緩沖液3、40g/L 聚乙二醇磷酸鹽緩沖液4、8mol/L 尿素溶液5、抗血清6、器材 試管、刻度吸管、微量加樣器、分光光度計(jì)、 離心機(jī)Page 701、稀釋抗血清2、稀釋血清標(biāo)本 用尿素做1:40稀釋取3支試管,按下表操作加入物（ml）測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 1:40稀釋血清0.040.04聚乙二醇磷

31、酸鹽溶液-0.041:40稀釋抗血清1.00-1.0040g/L PEG-PBS -1.00 -Page 71混勻,置于室溫,放置1h,以 40g/L 聚乙二醇磷酸鹽緩沖液零點(diǎn),在340nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,分別讀取各管的吸光度。吸光度差值 = 測(cè)定管吸光度 空白管吸光度 - 抗體空白管吸光度用吸光度差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得結(jié)果。 參考血清用8g/L尿素作1:120、1:60、1:40、1:30、1:20稀釋,按上述操作測(cè)得各管吸光度,以ApoA濃度為橫坐標(biāo),以吸光度差值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Page 721、稀釋抗血清 用40g/L PEG-PBS 1:80稀釋2、稀釋血清標(biāo)本 用聚乙二醇磷酸鹽溶液做1:

32、10稀釋取3支試管,按下表操作加入物（ml）測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 1:10稀釋血清0.040.04聚乙二醇磷酸鹽溶液-0.041:80稀釋抗血清1.00-1.0040g/L PEG-PBS -1.00 -Page 73混勻,置于室溫,放置30min,以 40g/L聚乙二醇磷酸鹽緩沖液零點(diǎn),在340nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,分別讀取各管的吸光度。吸光度差值 = 測(cè)定管吸光度 空白管吸光度 - 抗體空白管吸光度用吸光度差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得結(jié)果。 參考血清ApoB為0.70g/L,各標(biāo)準(zhǔn)管稀釋度1:30、1:20、1:10、1:5、1:4,分別相當(dāng)于ApoB 0.233g/L、 0.35g/L、0.70

33、g/L、 0.70g/L、 1.40g/L、 1.75g/L.Page 74ApoA 1.0101.32g/LApoB 0.5980.892g/LPage 751、為了準(zhǔn)確測(cè)定ApoA、 ApoB,必須作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。2、樣品最好不超過3天（4保存）。Page 76 ApoAI是HDL的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其含量可代表HDL的水平。HDL主要參與膽固醇從外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟,故HDL是動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因素。 ApoAI水平與高脂血癥、冠心病危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)。 ApoB是LDL的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其含量可代表LDL的水平。LDL主要功能是將膽固醇由肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織,故血清LDL過高引起動(dòng)脈粥樣硬化。

34、ApoB水平與高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)。77Page 78n 血清脂蛋白電泳分析是利用電泳的原理直接測(cè)定血漿脂蛋白的組成和相對(duì)含量,對(duì)高脂蛋白血癥的分型具有十分重要的意義。n 電泳支持物可選擇用醋酸纖維素薄膜、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等,其中瓊脂糖凝膠電泳為常見。Page 79n 脂類、在血漿中都與蛋白質(zhì)結(jié)合成脂蛋白而粗、存在,根據(jù)在電場(chǎng)中的遷移率不同,以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì),將血漿（血清）脂蛋白分離為-脂蛋白、前-脂蛋白、-脂蛋白和乳糜微粒四個(gè)部分。n 正?？崭寡獫{中應(yīng)不含乳糜微粒。 將血清脂蛋白用脂類染料（如蘇丹黑B或油紅O等）進(jìn)行預(yù)染,再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳分

35、離。n 通電后,可以看出脂蛋白向正極移動(dòng),并分離為幾個(gè)區(qū)帶。 脂蛋白易分解,血液樣品必須新鮮,分離血清后應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行電泳。室溫下放置過久或冷藏過久都會(huì)造成分離不好,尤其是前-脂蛋白帶不清楚或消失。 Page 801 1、試劑、試劑 （1 1）飽和蘇丹黑）飽和蘇丹黑B B染液染液（2 2）電泳緩沖液）電泳緩沖液（3 3）巴比妥）巴比妥- -鹽酸緩沖液（鹽酸緩沖液（pH8.2pH8.2）（4 4）10mmol/L EDTA-Na10mmol/L EDTA-Na2 2（5 5）250g/L 250g/L 蔗糖溶液蔗糖溶液（6 6）5g/L5g/L瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 2 2、器材、器材 (1)

36、(1) 試管、滴管試管、滴管 (2) (2) 水浴鍋水浴鍋 (3) (3) 載玻片載玻片(2.5(2.57.5cm) 7.5cm) (4) (4) 刀片、刀片、X X光片光片 (5) 1ml (5) 1ml注射器注射器 電泳儀電泳儀 Page 81 1、融化融化:將分裝于試管中的0.35%緩沖瓊脂糖置沸水浴中加熱融化。 2、制板制板:稱熱（約55左右）用吸管吸取緩沖瓊脂糖2.5ml,均勻澆于 載玻片上,水平放置于室溫中,冷卻凝固后（約30分鐘）,在 距一端約2.5cm處用雙刃刀片刻一小槽（約1.515mm）,再 用膠片將其中的凝膠挑出,用濾紙條吸干其中的水分,備用。 3、預(yù)染血清預(yù)染血清:取血清0.2ml置于一小試管中,加入預(yù)染液0.02ml,混勻。 4、加樣加樣:先在上述小試管中加入與預(yù)染血清等量的預(yù)熱至55的緩沖瓊 脂糖,混勻。將凝膠板置電泳槽上,加樣端靠近負(fù)極。然后取 混合物約40l加于凝膠板小槽內(nèi)。 5、電泳電泳:將上述加好樣品的瓊脂糖凝膠板兩端分別用四層紗布與電泳槽 緩沖液搭橋,再用電壓120伏,通電約3040分鐘,既可見脂蛋 白各帶清晰分離。 6、結(jié)果描述結(jié)果描述:切斷電源,取出凝膠板,作圖,對(duì)電泳圖譜作定性或半定 量描述