5-DNA replication,mutation,injury and repair-2

1、第一節(jié) DNA的復(fù)制一、DNA復(fù)制的一般特征二、原核生物的DNA復(fù)制三、真核生物DNA復(fù)制四、線粒體DNA復(fù)制五、噬菌體和病毒DNA的復(fù)制第四章 DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（一）單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制過(guò)程單鏈環(huán)狀DNA以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行，如大腸桿菌噬菌體X174、M13、G等?，F(xiàn)以X174為例說(shuō)明。1. 第一階段：?jiǎn)捂湱h(huán)狀DNA以親本鏈（正鏈）為模板合成互補(bǔ)的環(huán)狀負(fù)鏈，形成閉合的環(huán)狀復(fù)制型（RF1）。RF1合成的引發(fā)首先由單鏈結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合到單鏈環(huán)上。基因FT TT AT AA.TA.TA.TA.TA.TG.CG.CG.CG.CG.CA.TA GG AC.GC.GC.GC.GA.TA

2、.T5TGATAAAAGATTCACTCTCACCTTATA.TGA.TTTTCTGCTTAGGAGTTTAATCATCTTTCAGACTTT3A CA GG.CG.CG.CA.TA AG.CG.CG基因GX174 pas發(fā)夾結(jié)構(gòu)在F和G基因之間有一個(gè)不完整的回文結(jié)構(gòu)（palindromes），形成兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此部分不與SSB結(jié)合。此結(jié)構(gòu)稱為pas site，即引發(fā)體組裝位點(diǎn)（primosome assembly site），此結(jié)構(gòu)與五種蛋白（priA，priB，DnaT，DnaB，DnaC）結(jié)合形成引發(fā)體。2. 第二階段：通過(guò)成環(huán)滾環(huán)復(fù)制（looping rolling replicati

3、on）產(chǎn)生多個(gè)子代復(fù)制型（RF）。首先， 由噬菌體A基因編碼的A蛋白（gpA）識(shí)別并結(jié)合到環(huán)狀雙螺旋DNA正鏈的復(fù)制原點(diǎn)，打開(kāi)一個(gè)缺口，產(chǎn)生復(fù)制型（RF ），然后gpA的酪氨酸殘基與5端核苷酸共價(jià)連接，保留磷酸二酯鍵打開(kāi)釋放的能量，接著，gpA，DNA螺旋酶和SSB共同參與DNA雙螺旋解旋，形成復(fù)制叉。gpA使打開(kāi)的正鏈5端形成環(huán)（loop），由大腸桿菌的DNA聚合酶以“”鏈為模板，在打開(kāi)的正鏈3端合成一條不斷循環(huán)的的正鏈，即為“滾環(huán)復(fù)制”（rolling circle replication）。（二）線狀DNA的復(fù)制過(guò)程1. 雙鏈線狀DNA復(fù)制起始 線狀DNA復(fù)制起始有兩種類型：一種是從DN

4、A中間開(kāi)始，如T7，另一種是從末端起始如腺病毒。T7噬菌體的復(fù)制起始：T7有39936bp，41個(gè)基因。有三個(gè)啟動(dòng)子PI、P、P，其中P起復(fù)制作用。T7的復(fù)制起始區(qū)位于基因1和基因1.1之間。T7DNA兩端有“末端冗余”，還有一個(gè)基因4產(chǎn)物的識(shí)別位點(diǎn)3CTGGG5。 T7復(fù)制起始必需三個(gè)酶： T7 RNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，基因4蛋白（gene product 4，gp4）。 T7 RNA聚合酶（gp1）是基因1產(chǎn)物，是基因1.1直到最末尾的基因轉(zhuǎn)錄所不可缺少的。 基因4產(chǎn)物是多功能酶： 一是依賴單鏈DNA的核苷-5-三磷酸酯酶活性（dTTP酶活性最高）， 二是螺旋酶活性， 三是引發(fā)酶

5、活性。T7 DNA聚合酶由兩個(gè)亞基組成：一個(gè)是T7的基因5蛋白（gp5 ），分子量為84kDa，單獨(dú)存在時(shí)具有單鏈DNA35外切酶活性和進(jìn)行下很低的聚合酶活性，聚合酶在催化1-50個(gè)脫氧核苷酸參入后即與模板脫離。另一個(gè)亞基是噬菌體誘導(dǎo)出來(lái)的寄主基因 trxA 編碼的硫氧還蛋白（thioredoxin），分子量為12kDa。兩個(gè)亞基結(jié)合后（1：1）成為具有很高進(jìn)行性的DNA聚合酶，還具有單鏈、雙鏈DNA的3 5外切酶活性。腺病毒復(fù)制的起始腺病毒DNA為線性雙鏈，長(zhǎng)度約3.6萬(wàn)bp。每個(gè)腺病毒DNA在5末端都共價(jià)連接了一個(gè)55kDa的蛋白質(zhì)，稱末端蛋白質(zhì)（terminal protein），簡(jiǎn)稱T

6、P。TP以絲氨酸羥基通過(guò)磷酸二酯鍵與5端的胞嘧啶共價(jià)連接。腺病毒兩端有反向末端重復(fù)序列，長(zhǎng)度介于103-162bp。在兩末端各有50bp的區(qū)域?yàn)槠鋬蓚€(gè)復(fù)制點(diǎn)其中一個(gè)C-G堿基對(duì)和第9-18堿基對(duì)完全保守核因子NF1的結(jié)合位點(diǎn)也高度保守頭25bp中有一段富含AT的區(qū)域，序列中AT占80%。保守序列NF1結(jié)合位點(diǎn)TP CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAG置換鏈 3 GTAGTAGTTATTATATGGAATAAAACCTAACTTCGGTTATACTATTACT C模板鏈腺病毒復(fù)制原點(diǎn)的序列起始過(guò)程：首先由寄主蛋白質(zhì)-核因子NF1與D

7、NA結(jié)合；在72KDa的腺病毒單鏈DNA結(jié)合蛋白（DBP）和ATP共同存在下由TP催化使末端解鏈；140KDa的腺病毒DNA聚合酶催化80KDa的TP前體蛋白8（pTP）中的絲氨酸殘基與dCTP5磷酸形成磷酸二酯鍵，反應(yīng)除去一分子焦磷酸，形成pTP與dCMP的連接物； C與模板3端的G以氫鍵相結(jié)合形成起始復(fù)合物。dCMP游離的3-OH為DNA聚合酶延伸反應(yīng)提供了引物復(fù)制起始復(fù)合體復(fù)制起始復(fù)合體 引發(fā)復(fù)制引發(fā)復(fù)制 （不需引物）（不需引物） 避免避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG 過(guò)程過(guò)程 SSB + ATP DNA 末端解鏈末端解鏈 TP pTP-Ser + dCT

8、P pTP-Ser-dCMP 3 OH2. 線性DNA復(fù)制的終止：線性DNA復(fù)制完成后，面臨一個(gè)很嚴(yán)重的問(wèn)題即當(dāng)5端引物切除，因沒(méi)有3-OH的存在，無(wú)法將缺少的一段補(bǔ)起來(lái)。這稱5末端隱縮。T7噬菌體如何解決這一問(wèn)題。T7噬菌體DNA兩端各有一段重復(fù)的數(shù)百個(gè)核苷酸稱為末端冗余（terminal redundancy），兩個(gè)子代分子中的單鏈末端可以互補(bǔ)。多余的單鏈部分可以被DNAase切去，然后再由DNA連接酶連接起來(lái)。1992年JD. Walson 提出了串聯(lián)體假說(shuō)。?二聚體二聚體3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌體體的的末末端端復(fù)復(fù)制制專一性核酸專一性核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶

9、3355335533553355互補(bǔ)的3端配對(duì)3535Pol I和連接酶封閉缺口35353553限制性酶交錯(cuò)切割35353535Pol I 3端延伸完成復(fù)制3. 單鏈線狀DNA的復(fù)制嚙齒動(dòng)物中的一種微小病毒（parvovirus），其基因組是一條單鏈線狀DNA。微小病毒一般含有4800bp，只編碼三個(gè)蛋白。轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的蛋白和酶系統(tǒng)都利用宿主細(xì)胞。微小病毒單鏈DNA的兩端具有不同的反向重復(fù)順序，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RepCapITRITRssDNA; inverted terminal repeats (ITR); Rep gene required for DNA replication; C

10、ap gene encodes capsid proteins(-)35abcdabfeghfeabcdab53e f ghfe efghf eabcdba(-)(-)(+)(+)(-)3553 abcdbae f ghfe efghf e(-)(+)abcdab53e f ghfe efghf e(-)(+)abcdba efghf e(+)feghfe(-)(-)(+)(三）逆轉(zhuǎn)錄病毒1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制： 逆轉(zhuǎn)錄病毒即RNA病毒，需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒有三個(gè)基因：gag-編碼核心蛋白；pol-編

11、碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼被膜糖蛋白。 1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。 用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對(duì)一般RNA病毒的復(fù)制無(wú)影響。已知放線菌素D專門抑制以DNA為模板的反應(yīng)，可見(jiàn)致癌RNA病毒的復(fù)制過(guò)程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說(shuō)。逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性： RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性； DNA指導(dǎo)的DNA

12、聚合酶活性； 核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿53方向起核酸外切酶的作用； 無(wú)校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高，易產(chǎn)生變異。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程 a) tRNA與PBS結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄 合成部分DNADNA負(fù)鏈 b) RNase降解病毒RNA5末端 c) 第一次跳躍 d) 負(fù)鏈DNA繼續(xù)合成 e) RNA被降解，U3左邊留下片段 作引物合成部分正鏈DNAf) 第二次跳躍正鏈DNA與負(fù)鏈 的另一端結(jié)合 g) 完成正鏈合成 LTR末端2. 逆轉(zhuǎn)錄病毒與疾?。捍蠖鄶?shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒造成的疾病都是比較慢性的，有些病毒雖然不直接導(dǎo)致疾病，但可以導(dǎo)致癌癥，有些病毒可以在其基因插入細(xì)胞基因內(nèi)而不導(dǎo)致疾病。在

13、人類進(jìn)化的過(guò)程中有許多逆轉(zhuǎn)錄病毒將它們的基因插入人的基因內(nèi)并成為人的基因的一部分。癌基因（oncogene）又叫轉(zhuǎn)化基因（transforming gene）是人類或其他動(dòng)物基因組中含有的一類基因。細(xì)胞癌基因（cellular oncogene， c-onc）原癌基因（proto-oncogene），未活化的c-onc。病毒癌基因（virus oncogene，v-onc）HIV病毒-引起艾滋病的病原體。人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒（Lentivirus），屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。普遍認(rèn)為，人類免疫缺陷病毒

14、的感染導(dǎo)致艾滋?。ˋIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome，“愛(ài)滋病”），艾滋病是后天性細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致嚴(yán)重機(jī)會(huì)感染及/或繼發(fā)腫瘤并致命的一種疾病。自1983年發(fā)現(xiàn)（Luc Montagnier； Robert Gallo） ，HIV全球奪命2500萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)第一次世界大戰(zhàn)，目前艾滋病病毒感染者尚有3300萬(wàn)人。HIV結(jié)構(gòu)及生活史周期3. HIV與藥物 核苷類似物：1985年發(fā)現(xiàn)幾種核苷類似物（nucleoside analgues）能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性，并在逆轉(zhuǎn)錄中終止cDNA鏈的延伸。如3-疊氮脫氧胸苷（azidoth

15、ymidine, AZT)，1987年FDA批準(zhǔn)上市的第一個(gè)治療艾滋病有效藥物。本品經(jīng)細(xì)胞中酶的作用轉(zhuǎn)化成活性型三磷酸齊多夫定，后者競(jìng)爭(zhēng)性抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制其DNA的合成、運(yùn)送和整合至宿主細(xì)胞核，而抑制病毒復(fù)制。 類似的還有雙脫氧肌苷/胞苷（DDI/DDC）非核苷類似物：Nevirapine 和 Pyridinone 兩者均可直接抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，對(duì)AZT耐藥株有效；對(duì)HIV-2無(wú)作用，易產(chǎn)生耐藥性。 HIV-1蛋白酶的抑制劑第二節(jié) 基因突變一、突變概念和類型（一）突變概念：突變(mutation)是指遺傳物質(zhì)發(fā)生的可遺傳的變異。 沒(méi)有發(fā)生突變的基因稱為野生型(wild type

16、)基因。自然發(fā)生的突變稱自發(fā)突變（spontaneous mutation）。物理或化學(xué)因素引起的突變稱為誘發(fā)突變（induced mutation）；這些因素叫做誘變劑（mutagen）；由于突變劑的作用而產(chǎn)生突變的過(guò)程或作用稱為突變生成作用（mutagenesis）。帶有突變位點(diǎn)的基因稱為突變基因（mutant gene）；帶有突變基因的生物個(gè)體或群體稱為突變體（mutant）。第四章 DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（二）突變類型：根據(jù)突變的原因和結(jié)果，可從多方面、多角度對(duì)基因突變進(jìn)行分類。1. 堿基置換突變（base substitution mutation）；由于堿基對(duì)的置換或者一個(gè)

17、或多個(gè)堿基的增加或減少而引起的基因突變。根據(jù)DNA堿基序列的不同改變又可分為點(diǎn)突變、堿基插入、堿基缺失等。點(diǎn)突變：通常指堿基替代，點(diǎn)突變又可分為：?jiǎn)吸c(diǎn)突變（point mutation）和多點(diǎn)突變（multiple mutation）?？梢苑譃檗D(zhuǎn)換（transitions）和顛換（transversions）兩類。轉(zhuǎn)換：嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘧啶之間的替換。顛換：嘌呤和嘧啶之間的替換。堿基插入（base inseration）：通常指較長(zhǎng)的堿基序列增加。有時(shí)插入序列本身攜帶遺傳信息，如轉(zhuǎn)座成分。轉(zhuǎn)座成分的插入可使插入位點(diǎn)的基因失活，同時(shí)又帶進(jìn)新的基因。堿基缺失（base deletio

18、n）：通常指較長(zhǎng)的一段堿基序列的缺少。缺失突變的回復(fù)突變率很低移碼突變（frame shift mutation）：插入、缺失一個(gè)或兩個(gè)堿基引起閱讀框架的改變。移碼突變可能產(chǎn)生新的終止密碼，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過(guò)早終止。如果經(jīng)突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)必需基因的改變，將使蛋白質(zhì)功能喪失。根據(jù)對(duì)遺傳信息的改變情況進(jìn)行分類，可分為：同義突變（synonymous mutation）又稱沉默突變（silent mutation）：由于密碼子具有兼并性，單個(gè)堿基置換后未引起編碼氨基酸變化，例如GCG的第三位G被A取代而成GCA，則mRNA中相應(yīng)的密碼子CGC就被轉(zhuǎn)錄為CGU，CGC和CGU都是精氨酸的密碼子。 錯(cuò)義突變

19、（missense mutation）：是指DNA分子中的核苷酸置換后導(dǎo)致合成的多肽鏈中一個(gè)氨基酸被另一氨基酸所取代。如鐮刀貧血病，血紅蛋白亞基多肽鏈的第6個(gè)氨基酸是谷氨酸，其mRNA分子正常編碼為：GAA或GAG。如果基因正鏈上GAG中的一個(gè)堿基A變成T，即從GAGGTG，則其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA上密碼子變成了GUG，GUG是代表纈氨酸。這樣谷氨酸被纈氨酸取代。無(wú)義突變（nonsense mutation）：當(dāng)單個(gè)堿基置換導(dǎo)致出現(xiàn)終止密碼子(UAG、UAA、UGA)時(shí)，多肽鏈將提前終止合成，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(或酶)大都失去活性或喪失正常功能。例如，DNA分子模板鏈中ATG的G被T代替時(shí)，相應(yīng)的mR

20、NA上的密碼子便從UAC變成終止信號(hào)UAA，因此翻譯便到此為止，使肽鏈縮短。4. 根據(jù)突變表現(xiàn)型對(duì)外界環(huán)境的敏感性分類非條件性突變（nonconditional mutation）條件性突變（conditional mutation）根據(jù)研究目的選擇一定的條件，使細(xì)胞產(chǎn)生一定的突變，但能正常生長(zhǎng)或近乎正常。最常用的條件是溫度，因?yàn)闇囟纫丝刂?，所以最常?jiàn)的條件型突變?yōu)闇囟让舾型蛔儯╰emperature sensitive mutation）5. 從突變效應(yīng)背離或返回到野生型可分為：正向突變（forward mutation）指由野生型變?yōu)橥蛔冃褪钦蛲蛔儭?回復(fù)突變（backmutation

21、or reverse mutation），回復(fù)到野生型的突變。6. 影響基因調(diào)控序列：突變位點(diǎn)可能存在于負(fù)責(zé)基因調(diào)控的DNA序列中。如突變位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)域，則有可能造成啟動(dòng)子上升突變（promoter up mutation）或下降突變（ promoter down mutation）。如果突變位點(diǎn)發(fā)生在操縱子（operator），使操縱子的阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，則不能結(jié)合阻遏蛋白或突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因上使其不能產(chǎn)生有功能的阻遏蛋白。突變位點(diǎn)位于操縱子或調(diào)節(jié)基因的突變?cè)斐傻膬煞N結(jié)果都使結(jié)構(gòu)基因失去了負(fù)向控制，使細(xì)胞不能根據(jù)需要來(lái)控制蛋白質(zhì)生成，即細(xì)胞產(chǎn)生不依賴于需要的，有固定數(shù)量的蛋白質(zhì)；基

22、因的這種表達(dá)方式叫組成型表達(dá)。產(chǎn)生這種表達(dá)方式的操縱子突變或調(diào)節(jié)基因的突變叫做組成型突變（constitutive mutation）。啟動(dòng)子突變體和組成型突變體是研究基因調(diào)控的重要手段。二、突變?cè)颍ㄒ唬┳园l(fā)突變(spontaneous mutation)， 自然發(fā)生的，無(wú)人為干擾的突變。引起自發(fā)突變的因素主要有DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤和DNA自發(fā)的化學(xué)改變。 DNA復(fù)制錯(cuò)誤：如A與C配對(duì)，這樣在復(fù)制時(shí)將產(chǎn)生該位點(diǎn)為A-T與G-C配對(duì)的兩條子鏈。由于堿基自身存在互變異構(gòu)體，可能形成錯(cuò)誤的堿基配對(duì)。1. 自發(fā)的化學(xué)變化：最常見(jiàn)的是脫嘌呤（depurination）和脫氨基（deamination）D

23、NA復(fù)制錯(cuò)誤 ATGTCTACAGATGTC AT A TCTA TAGTA TAGATGTC TACAG ATGTC TACAG ATGTCTACAG ATGTCTACAG 新鏈 5 3 A G T TT C A A A A A C G 模板鏈 3 5 新合成鏈環(huán)出 5 3 5 T 3 A G T T A G T T T TT C A A A A C G T C A A A A A C G 3 A 5 3 5 模板鏈環(huán)出 新鏈上插入一個(gè)堿基 新鏈上缺失一個(gè)堿基 5 3 5 T 3 A G T T T T G C A G T T T T T G CT C A A A A C G T C A A

24、 A A A C G 3 A 5 3 5 圖214 在 DNA 復(fù)制中由于 DNA 的錯(cuò)誤環(huán)出自發(fā)產(chǎn)生堿基的插入和缺失 (參考 Peter J. Russell: Genetics, 3rd ed.,Fig18-8)脫嘌呤作用：指在DNA雙螺旋鏈上脫氧核糖和嘌呤之間的糖苷鍵斷裂，A或G被切下，成為無(wú)嘌呤位點(diǎn)。脫氨基作用：DNA雙鏈的堿基上去除氨基，如胞嘧啶上有一個(gè)易被氧化的氨基，該氨基變成羰基（去氨基）后，該位點(diǎn)上嘧啶變成了尿嘧啶。如果DNA中有“U”未被細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)除去，那么當(dāng)該突變的DNA復(fù) 制時(shí)，子鏈在該位點(diǎn)將加上一個(gè)A與之配對(duì)，結(jié)果本應(yīng)是C-G對(duì)轉(zhuǎn)變成了T-A對(duì)，產(chǎn)生了堿基轉(zhuǎn)換

25、突變。4. 氧化作用損傷堿基（oxidatively danaged bases）：細(xì)胞代謝產(chǎn)生的一些活性氧集團(tuán)，如過(guò)氧化物（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基(-OH)等，可使DNA氧化損傷，從而導(dǎo)致突變。如胸苷氧化后產(chǎn)生胸苷乙二醇，G氧化后產(chǎn)生8-氧-7，8二氫脫氧鳥嘌呤或8-氧鳥嘌呤（8-O-G，GO），GO可與A錯(cuò)配，導(dǎo)致G-CT-A突變。利用誘變劑增加突變率1. 射線：包括紫外線、X射線、射線及宇宙射線等。UV是所有病毒和細(xì)菌的誘變劑。由于DNA中的嘌呤和嘧啶的雜環(huán)有很強(qiáng)的吸收254-260UV的能力，所以這種波長(zhǎng)的UV能引起DNA堿基變化，造成DNA突變。主要是引起相鄰的兩個(gè)T形

26、成二聚體。TT的緊密連接引起雙螺旋變形，從而阻斷轉(zhuǎn)錄并暫時(shí)阻斷DNA復(fù)制，引起細(xì)胞死亡。（二）誘發(fā)突變（induced mutation）X、和宇宙射線是離子化射線。當(dāng)射線作用于組織時(shí)，產(chǎn)生具有高度反應(yīng)性的自由基。引起DNA損傷。DNA損傷包括三種效應(yīng)：DNA鏈戊糖和磷酸組成組成的骨架被破壞，造成單鏈斷裂；雙鏈斷裂核苷酸堿基改變。2. 化學(xué)誘變劑 堿基類似物：是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA中正常堿基十分相似的化合物。通常指人工合成的，如嘌呤類似物有8-吖鳥嘌呤，6-巰基嘌呤，二氨基嘌呤；嘧啶類似物有5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶等。如5-溴尿嘧啶和T很相似，僅在第5個(gè)碳元子上由Br取代了甲基 5-BU有，

27、酮式，烯醇式兩種異構(gòu)體，可分別與A及G配對(duì)結(jié)合 A A G GT BUK BUE C酮式 烯醇式氨基嘌呤（2-aminopurine，2-AP）：也是堿基類似物。它也有二種互變形式，一種是正常狀態(tài)，另一種是稀有形式狀態(tài)，以亞胺形式存在。前一種可與DNA雙鏈中原來(lái)的A-T配對(duì)，轉(zhuǎn)成C-G配對(duì)或原有的G-C對(duì)變成A-T對(duì)。A 2AP 2AP* GT T C C亞硝酸：使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，造成DNA復(fù)制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯(lián)而引起遺傳效應(yīng)。 可使G第二個(gè)碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine，X），黃嘌呤仍能與C配對(duì)，故不產(chǎn)生堿基轉(zhuǎn)換。但若C和A脫氨后分別

28、產(chǎn)生U和次黃嘌呤(H)，U與A配對(duì)， H與C配對(duì)，使C-G轉(zhuǎn)換成A-T或A-T轉(zhuǎn)換成G-C； 堿基修飾劑HNO2AH G G A AT C C C U THNO2 羥胺：只能特意地和胞嘧啶（C）起反應(yīng)。在C上第4個(gè)碳原子加-OH，該產(chǎn)物可和A配對(duì)使G-C轉(zhuǎn)換成T-A；HA C 4-OH-C TG A A 烷化劑：一類使堿基烷基化的化合物，如甲基磺酸乙酯（EMS）、氮芥（NM）、甲基磺酸甲酯（MMS）、亞硝酸胍（NG）等。EMS使G第6位烷基化，使T第4位上甲基化，產(chǎn)生O-6-E-G和O-6-E-T。兩者分別和T，G配對(duì)，是原來(lái)的G-C對(duì)轉(zhuǎn)變成A-T對(duì)，A-T轉(zhuǎn)變?yōu)镚-C。GO-6-E-G A

29、T O-4-E-T CCT T A G G DNA插入劑：又稱插入突變劑（intercalating mutagens），包括原黃素（proflavin）、丫啶橙（acridine orange）、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓（ethidium bramide）和ICR的復(fù)合物等。 (a) 增加堿基 插入劑分子 模板鏈 5ATCAG TTACT3 新合成鏈 3TAGTC G AATGA5 068nm 隨機(jī)選擇堿基 嵌入插入劑處 下一輪復(fù)制 5ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失堿基 模板鏈 5ATCAG T TACT3 新合成鏈 3TAGTC

30、 ATGA5 插入劑失去 后復(fù)制 插入劑 5 ATCAGTACT 3 3 TAGTCATGA 5 圖21-15 插入突變導(dǎo)制堿基的增加(a)和減少 (b) （三）基因的人工誘變：1. 體外定向突變的方法：有目的地進(jìn)行選擇性DNA突變。1985年加拿大的Michael Smith建立，于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。具體方法有三種：（1）聚核苷酸介導(dǎo)的用單鏈模板定點(diǎn)突變；（2）雙引物法定點(diǎn)突變；（3）用摻入U(xiǎn)的單鏈為模板進(jìn)行聚核苷酸介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變。三種方法產(chǎn)生定點(diǎn)突變的原理是一樣的。舉例如下：先合成一條包括被替代的靶堿基及附近序列的一段寡核苷酸，這條寡核苷酸除被替換的靶堿基，其余的序列與野生

31、型DNA分子中的相應(yīng)序列完全一致。將待研究的DNA克隆變性后插入到單鏈?zhǔn)删w（如M13）DNA中。將合成的寡核苷酸與單鏈?zhǔn)删w中DNA克隆的互補(bǔ)單鏈進(jìn)行雜交。以寡核苷酸做引物，DNA克隆的互補(bǔ)單鏈做模板，在DNA聚合酶I Klenow片段的作用下合成完整的互補(bǔ)鏈，再用DNA連接酶連接起來(lái)，將此雙鏈DNA導(dǎo)入大腸桿菌中，經(jīng)修復(fù)和DNA復(fù)制就可以得到可穩(wěn)定遺傳的突變DNA克隆。例如將干擾素的第17位氨基酸Cys變?yōu)镾er，Cys的密碼子為TGT而Ser的密碼子為AGT，因此只需改變一個(gè)堿基對(duì)。ACAAGTTCATGAACTTGAACATGA2. 體外定點(diǎn)突變的應(yīng)用體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和

32、功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是實(shí)驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。如：將胰高血糖素第21位的氨基酸天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，研究胰高血糖素結(jié)構(gòu)與功能的變化：研究組蛋白脫乙?；?（HDAC1）保守氨基酸中組氨酸的定點(diǎn)突變對(duì)其功能的影響 研究人血紅蛋白99、82位點(diǎn)突變，與血紅蛋白四聚體穩(wěn)定性的關(guān)系。（四）適應(yīng)性突變1988年凱恩斯等人于英國(guó)著名的Nature上，發(fā)表了一篇名為，The origin of mutants的文章， 發(fā)現(xiàn)了適應(yīng)性突變。凱恩斯所用的大腸桿菌的lacZ基因（其產(chǎn)物為半乳糖 ，可分解乳糖為葡萄糖和半乳糖）帶有一個(gè)點(diǎn)突變，稱為琥珀突變（amber mutation），這樣的突

33、變會(huì)使得lacZ基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)譯（translate）不完全，故其產(chǎn)物會(huì)失去正常分解乳糖的功能除非有突變發(fā)生，使得lacZ的產(chǎn)物能完全轉(zhuǎn)譯，否則帶有這種基因的大腸桿菌便無(wú)法生長(zhǎng)在以乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)平板上。凱恩斯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得到兩個(gè)重要的結(jié)論乳糖可誘使Lac +突變種持續(xù)產(chǎn)生，而不是因?yàn)轲囸I所導(dǎo)致； 乳糖誘使細(xì)菌產(chǎn)生特定方向的突變，也就是乳糖只會(huì)誘使大腸桿菌的LacZ基因產(chǎn)生突變，而不影響其他的基因。 三、突變體的分離與分析（一）突變體的分離： 分子生物學(xué)研究中，基因突變可以在體外按照人們的設(shè)計(jì)進(jìn)行，但是仍然有很多不需要的突變體，因此需要分離，方法有：利用遺傳分析方法，篩選、選擇、富集需要的突變

34、體，常見(jiàn)的例子是利用抗性基因，使帶有抗性基因的突變體可以生長(zhǎng)，其它被殺死。（二）突變體的分析：遺傳檢測(cè)法1. 根據(jù)重組載體的抗藥性標(biāo)志篩選：如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)消失。例如質(zhì)粒pBR322含有anpr、和terr兩個(gè)抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓細(xì)菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒DNA的細(xì)胞都不能生

35、長(zhǎng)；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長(zhǎng)的細(xì)菌是含有質(zhì)粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長(zhǎng)、而在四環(huán)素中不能生長(zhǎng)的細(xì)菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。 -半乳糖苷酶法載體含有l(wèi)acZ的藍(lán)白篩選法：藍(lán)白篩選法是一種利用藍(lán)色化合物作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼-半乳糖苷酶的基因。主要是在載體的非必要區(qū)插入一個(gè)大腸桿菌-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。攜帶lacZ 的載體轉(zhuǎn)入lac-的宿主菌后，在含有X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)平板上可形成藍(lán)色菌落。外源基因插入lacZ（或lacZ被取代）后，重組子將喪

36、失分解X-gal的能力。轉(zhuǎn)入lac-的平板上可形成白色菌落。 2. 核酸雜交法：利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是Southern 印跡雜交和斑點(diǎn)雜交等。將轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的菌落復(fù)印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來(lái)，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來(lái)。3. PCR技術(shù)（見(jiàn)書）四、突變與人類疾病突變基因改變了原有的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致原有的遺傳性狀發(fā)生改變，其中一部分基因突變可導(dǎo)致遺傳病或具有遺傳傾向的病甚至腫瘤。如血友病是凝血因子基因的