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文檔簡介
1、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量、實驗?zāi)康?. 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理。2. 掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)。3. 掌握TU-1901紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。、實驗原理1. 紫外-可見分光光度法,是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外光:10-400 nm可見光:400-780 nm (可被人們的眼睛所感覺)特點:帶光譜、分子光譜應(yīng)用:定性分析-最大吸收波長;定量分析-朗伯-比爾定律(標準曲線法和標準加入法)a. 定性分析原理:吸收曲線:吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀
2、b. 定量分析原理:根據(jù)朗伯一比耳定律:A= ebc,當入射光波長 入及光程b 一定時,在一定濃度范圍內(nèi),有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。定量分析常用的方法是標準曲線法即只要繪岀以吸光度A為縱坐標,濃度c為橫坐標的標準曲線,測岀試液的吸光度,就可以由標準曲線查得對應(yīng)的濃度值,即未知樣的含量。c. 儀器組成部件:各種類型的紫外-可見分光光度計,如下圖所示,從總體上來說是由五個部分組成,即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯 示記錄裝置。2. 本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗原理:(1) 蛋白質(zhì)可作定量分析的原因:蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,所以蛋白質(zhì)溶液在
3、275-280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比,服從朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1 1.0mg/mL。(2)此種方法測量的準確度差一點的原因:由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所處的微環(huán)境也不同,所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計,濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在 280nm的吸光度在0.3 3.0之間,平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測量的準確度差一點。(3) 有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式:若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸
4、類吸收紫外光的物質(zhì),在280nm處來測量蛋 白質(zhì)含量時,會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強,但蛋白質(zhì)卻恰恰相反,因此可利用280nm及260nm 的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260(A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在 280nm和260nm處測得的吸光度值)還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算岀溶液中的蛋白質(zhì)的含量:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL ) =F* A280*D*1/d其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度值;d為石英比色皿的厚度(cm) ;D為溶液的稀釋倍數(shù);F為校正因子(4)稀溶液中
5、蛋白質(zhì)濃度測定的經(jīng)驗公式:蛋白質(zhì)的肽鍵在200 250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比,其波長越短,光吸收越強。若選用215nm可減少干擾及光散射,用 215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比,可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差,因此,對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定,可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=0.144 ( A215-A225)(A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在 215nm和225nm處測得的吸光度值三、儀器與試劑儀器:TU-1901紫外-可見分光光度計,比色管(10ml的5個),吸量管。試劑:標準蛋白質(zhì)溶液:5
6、.00 mg/mL溶液、0.9% NaCI溶液,待測蛋白質(zhì)溶液(牛血清白蛋白)。四、實驗步驟1. 基本操作(1) 啟動計算機,打開主機電源開關(guān),啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時。(2)用吸量管分別吸取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL 標準蛋白質(zhì)溶液于 5只10 mL比色管中,用0.9% NaCI溶液稀釋至刻度,搖勻。用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCI溶液為參比(參比溶液不可取出)(3) 在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描,設(shè)置掃描參數(shù)(起點:400nm,終點:250nm,速度:中,間隔:1.0nm,單 次掃描)(4)將兩個均裝有0.9%NaCI溶液的1
7、cm石英比色皿放入測量池中,進行基線掃描,然后選定量測定,校零,在調(diào) 回光譜掃描。2. 吸收曲線的制作:(找出最大吸收波長)將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液,點擊 START進行掃描,得到如下吸收曲線,從曲線中我們可以看出此標準蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為278nm,此波長下的吸光度為 0.1984。3. 標準曲線的制作:在工作界面上選擇測量項目為光度測量設(shè)置測量條件(測量波長:278.00 nm )。用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCI溶液為參比,在 278nm處分別測定以上所配標準溶液的吸光度A278,記錄如下:濃度(mg/mL)0.30.40.50.60.7A
8、2780.19710.25320.32220.37580.4382以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線:4. 樣品測定:配制三份待測蛋白質(zhì)溶液,(取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL比色管中,用0.9% NaCI溶液稀釋至刻度)按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906,0.3765,0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度,從標準曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL ?10 mL/2.0mL=3.0505mg/mL。五、注意事項準備工作:(1) 在測量前
9、應(yīng)把機器預(yù)熱半小時。(2) 溶液一定要配制準確,以防影響實驗效果,保證點在一條直線上。(3) 由于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變,故進行樣品測定時的PH最好與標準曲線制作時的 PH值一致。測量工作:(1) 吸收曲線繪制前必須進行光譜的掃描。(2) .在作標準曲線進行定量前一定要選擇最大的吸收波長,確保靈敏度高。(3) 在實際操作中,比色皿在使用中應(yīng)注意保持干凈,更不能觸摸比色皿的光面,以防摩擦影響通光。六、思考題1. 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的方法有何缺點及優(yōu)點?受哪些因素的影響和限制?答:優(yōu)點:方法操作簡便、迅速、不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備,不消耗樣品,測定后仍能回收使用,低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶 液不干擾測定。缺點:準確度和靈敏度差一點。干擾物質(zhì)多:對于測定那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì),有一定的 誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì),會產(chǎn)生較大干擾2. 若樣品中含有核酸類雜質(zhì),應(yīng)如何校正?答:因為核酸在260nm處的光吸收比280nm更強,但蛋白質(zhì)卻恰恰相反,因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白 質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL )
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