生物化學(xué)3動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1、第三章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥 動(dòng)物細(xì)胞作為一種重要的宿主細(xì)胞，可動(dòng)物細(xì)胞作為一種重要的宿主細(xì)胞，可用以下藥物的生產(chǎn)：用以下藥物的生產(chǎn)：v病毒病毒v疫苗疫苗v其他的各種重組蛋白其他的各種重組蛋白v單克隆抗體單克隆抗體3.1 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性3.2 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得3.3 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基3.4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法3.5 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式3.6 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器3.7 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制

2、造實(shí)例3.8 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望3.1 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài) 離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞主要為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞主要為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 根據(jù)是否需要帖附于支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)，可將動(dòng)物細(xì)根據(jù)是否需要帖附于支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)，可將動(dòng)物細(xì)胞分為胞分為貼壁依賴型貼壁依賴型和和懸浮型懸浮型兩類兩類。1、貼壁依賴型、貼壁依賴型 絕大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)必須貼附在某一固相表面才能生存絕大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)必須貼附在某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。和生長(zhǎng)。 按培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁的形態(tài)主要分為按培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁的形態(tài)主要分為4類類

3、。（1）成纖維細(xì)胞型）成纖維細(xì)胞型 形狀與體內(nèi)成纖維形狀與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似而得名，細(xì)胞形狀相似而得名，細(xì)胞大致呈梭形或不細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則三角形。規(guī)則三角形。（2）上皮細(xì)胞型）上皮細(xì)胞型 形狀為扁平的不規(guī)形狀為扁平的不規(guī)則多角型。則多角型。（3）游走細(xì)胞型）游走細(xì)胞型 在支持物上分散生在支持物上分散生長(zhǎng)，不連接成片，呈長(zhǎng)，不連接成片，呈活躍的游走和變形運(yùn)活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)。動(dòng)。（4）多形性細(xì)胞）多形性細(xì)胞 形態(tài)不規(guī)則。形態(tài)不規(guī)則。 2、懸浮型、懸浮型 少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)呈懸浮生長(zhǎng)，來源于血液、淋巴少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)呈懸浮生長(zhǎng)，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)

4、胞組織的細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞為懸浮型。為懸浮型。 形態(tài)常為球形，可懸浮培養(yǎng)。形態(tài)常為球形，可懸浮培養(yǎng)。3、兼性貼壁細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞 不嚴(yán)格的依賴支持物不嚴(yán)格的依賴支持物 某些情況下可在培養(yǎng)基中良好懸浮生長(zhǎng)某些情況下可在培養(yǎng)基中良好懸浮生長(zhǎng)。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一些基本概念： 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)）。 原代培養(yǎng)是指從機(jī)體取出組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。傳代培養(yǎng)是指從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系。 通過選擇或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的具有特異性質(zhì)或標(biāo)記的細(xì)

5、胞，稱為細(xì)胞株。 不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限的細(xì)胞系或細(xì)胞株稱為有限細(xì)胞系或細(xì)胞株。 可連續(xù)傳代的細(xì)胞系或細(xì)胞株稱為連續(xù)細(xì)胞系或細(xì)胞株。 有限細(xì)胞系（株）可通過自發(fā)、病毒感染、癌基因轉(zhuǎn)移、與其他連續(xù)細(xì)胞融合等方法轉(zhuǎn)化得到連續(xù)細(xì)胞系（株）。動(dòng)物細(xì)胞的生理特征動(dòng)物細(xì)胞的生理特征:1. 細(xì)胞分裂周期長(zhǎng)（細(xì)胞分裂周期長(zhǎng)（ 1248h ） 2. 細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附基質(zhì)，存在接觸抑制細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附基質(zhì)，存在接觸抑制3. 正常二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)壽命有限正常二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)壽命有限二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征4. 對(duì)周圍環(huán)境十分敏感對(duì)周圍環(huán)境十分敏感5. 對(duì)培養(yǎng)基要求高對(duì)培養(yǎng)基要求高 氨基酸、維生素、無

6、機(jī)鹽、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子、血清等。血清等。6. 對(duì)蛋白合成途徑和修飾與細(xì)菌不同（糖基化）對(duì)蛋白合成途徑和修飾與細(xì)菌不同（糖基化）目前，動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，產(chǎn)值約各占一半。目前，動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，產(chǎn)值約各占一半。3.2 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求 原代細(xì)胞原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞 腺病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗事故（錯(cuò)用癌細(xì)胞）腺病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗事故（錯(cuò)用癌細(xì)胞） 皮下注射癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)皮下注射癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 最終產(chǎn)品殘留最終產(chǎn)品殘留DNA

7、嚴(yán)格限制。嚴(yán)格限制。 1986年，從淋巴瘤患者分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞年，從淋巴瘤患者分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞Namalwa細(xì)胞，細(xì)胞，生生產(chǎn)產(chǎn)干擾素干擾素用于臨床。用于臨床。 猴腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞猴腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞Vero生產(chǎn)生產(chǎn)狂犬疫苗狂犬疫苗和和脊髓灰質(zhì)炎疫苗脊髓灰質(zhì)炎疫苗被批被批準(zhǔn)大量用于人群。準(zhǔn)大量用于人群。 1987年，雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)年，雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)OKT3單抗用于臨床排異反應(yīng)。單抗用于臨床排異反應(yīng)。 1988年后，大批異倍體傳代細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白被批準(zhǔn)年后，大批異倍體傳代細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白被批準(zhǔn)上市。上市。 最終產(chǎn)品殘留最終產(chǎn)品殘留DNA嚴(yán)格限制。嚴(yán)格限制。 二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得 1 .

8、原代細(xì)胞原代細(xì)胞 直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)粉碎、消化得到的細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)粉碎、消化得到的細(xì)胞懸液。懸液。 需要大量動(dòng)物。需要大量動(dòng)物。 雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞。雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞。 2. 二倍體細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系 通過篩選、克隆從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的具有某種特征的有限細(xì)胞株 有限增殖、2n、貼壁、接觸抑制 MRC-5、WI-38 MRC-5： 1966年，14周正常男性胎肺組織中獲得 2n=46 壽命4246代 用于人用疫苗的生產(chǎn) 3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 通過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程形成， 常由于染色體斷裂成為異倍體。 自發(fā)形成，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞多發(fā)； 病

9、毒感染后轉(zhuǎn)化； 直接從動(dòng)物腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有無限生命力，一般倍增時(shí)間短、對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子要求較低。 CHO（中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞）、COS、BHK-21、Namalwa、Vero細(xì)胞等。 COS細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）非洲綠猴腎細(xì)胞）： 1981年，Gluzman用復(fù)制起點(diǎn)缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)轉(zhuǎn)化非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，獲得3個(gè)細(xì)胞系：COS-1、 COS-3 、 COS-7。vCOS細(xì)胞組成性表達(dá)SV40大T抗原，帶有SV40 ori復(fù)制子的質(zhì)粒以附加體的形式高拷貝擴(kuò)增（105 拷貝）v大量擴(kuò)增質(zhì)粒及高表達(dá)mRNA、蛋白質(zhì)，易回收和分析v易培養(yǎng)

10、、易轉(zhuǎn)染。 CHO-K1細(xì)胞： 1957年，Puck等從中國(guó)倉鼠卵巢分離，上皮樣細(xì)胞。 CHO-dhfr- 為二氫葉酸還原酶突變型(培養(yǎng)時(shí)需加入次黃嘌呤、胸苷)，用于工程細(xì)胞構(gòu)建。 4、融合細(xì)胞系 細(xì)胞融合：兩個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程。 主要為雜交瘤細(xì)胞。 細(xì)胞自發(fā)融合的頻率很低，需要采用人工的細(xì)胞自發(fā)融合的頻率很低，需要采用人工的方式進(jìn)行細(xì)胞融合，方法有方式進(jìn)行細(xì)胞融合，方法有3種：種：生物方法（病生物方法（病毒）、化學(xué)方法（毒）、化學(xué)方法（PEG）、）、物理方法（電融合）物理方法（電融合） 目前，常用的為目前，常用的為PEG和和電融合電融合。（1）病毒誘導(dǎo)融合）病毒誘導(dǎo)融合 可促進(jìn)

11、細(xì)胞融合的病毒有：可促進(jìn)細(xì)胞融合的病毒有：皰癥病毒、天花皰癥病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒病毒、副流感病毒、副黏液病毒等等。 仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒為副黏液病毒的一種，對(duì)人危害小為副黏液病毒的一種，對(duì)人危害小而且有效，使用最廣。而且有效，使用最廣。 起融合作用的為病毒被膜上的起融合作用的為病毒被膜上的糖蛋白糖蛋白。 細(xì)胞融合時(shí)加入滅活的仙臺(tái)病毒，兩個(gè)細(xì)胞細(xì)胞融合時(shí)加入滅活的仙臺(tái)病毒，兩個(gè)細(xì)胞在病毒的黏結(jié)作用下靠近，通過病毒與細(xì)胞膜在病毒的黏結(jié)作用下靠近，通過病毒與細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜相互融合。的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜相互融合。 細(xì)胞融合率較低，而且還需病毒，現(xiàn)已很細(xì)胞融合率較低，而且還需病毒，

12、現(xiàn)已很少使用。少使用。（2）PEG融合融合 誘導(dǎo)融合的機(jī)理還不明確。誘導(dǎo)融合的機(jī)理還不明確。 PEG（聚乙二醇）為乙二醇的線性多聚體，結(jié)構(gòu)式為聚乙二醇）為乙二醇的線性多聚體，結(jié)構(gòu)式為H(OCH2CH2)nOH ，分子量分子量1000以上為固體，以上為固體，1000以下為液以下為液體。體。 用于細(xì)胞融合的用于細(xì)胞融合的PEG分子量一般為分子量一般為10006000，濃度為，濃度為3050%。 融合效率最高可達(dá)融合效率最高可達(dá)10% 。3、電融合、電融合 細(xì)胞在強(qiáng)電場(chǎng)脈沖的作用下，細(xì)胞膜上會(huì)短暫出現(xiàn)小孔，細(xì)胞在強(qiáng)電場(chǎng)脈沖的作用下，細(xì)胞膜上會(huì)短暫出現(xiàn)小孔，如果兩個(gè)細(xì)胞貼近，電脈沖時(shí)緊貼的質(zhì)膜會(huì)瞬時(shí)破

13、裂而導(dǎo)致如果兩個(gè)細(xì)胞貼近，電脈沖時(shí)緊貼的質(zhì)膜會(huì)瞬時(shí)破裂而導(dǎo)致膜的融合，從而形成雜合細(xì)胞。膜的融合，從而形成雜合細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：融合率很高、對(duì)細(xì)胞毒性低、適合各種細(xì)胞、可融合率很高、對(duì)細(xì)胞毒性低、適合各種細(xì)胞、可用于細(xì)胞數(shù)量很少的融合過程用于細(xì)胞數(shù)量很少的融合過程。 細(xì)胞融合需要細(xì)胞融合需要經(jīng)經(jīng)細(xì)胞膜融合、細(xì)胞膜融合、細(xì)胞質(zhì)滲透、細(xì)細(xì)胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合胞核融合等主要等主要步驟。步驟。 預(yù)處理預(yù)處理融合方法融合方法主要應(yīng)用主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞不需不需仙臺(tái)病毒、仙臺(tái)病毒、PEG、電電融合融合生產(chǎn)單克隆生產(chǎn)單克隆抗體抗體植物細(xì)胞植物細(xì)胞脫壁脫壁PEG、電電融合融合創(chuàng)造植物新創(chuàng)造植物新品種品種

14、微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞 脫壁脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)良新高產(chǎn)優(yōu)良新菌種菌種 5、重組工程細(xì)胞系v構(gòu)建含目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體（病毒載體、質(zhì)粒載體）v導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞v通過選擇標(biāo)記篩選工程細(xì)胞 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定表達(dá) 生產(chǎn)上為了獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞株。 三、細(xì)胞庫的建立 除原代細(xì)胞，其他細(xì)胞系或株需要建庫保存。v原始細(xì)胞庫（master cell bank，MCB） 二倍體細(xì)胞：群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞（傳代次數(shù)盡可能少的細(xì)胞） 記錄詳細(xì)檔案v工作細(xì)胞庫（working cell bank，WCB） 生產(chǎn)用細(xì)胞庫（manufacturers working cell bank，MWCB） 生產(chǎn)生產(chǎn)3.

15、3 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗、器材的清洗 新的玻璃：新的玻璃： 泡酸（泡酸（5%鹽酸鹽酸 12h）、刷洗、清潔液泡刷洗、清潔液泡12h（重鉻酸鉀重鉻酸鉀-硫酸洗液硫酸洗液）、）、沖洗沖洗2、水質(zhì)、水質(zhì) 新鮮的超純水、雙蒸水或三蒸水新鮮的超純水、雙蒸水或三蒸水 無熱原無熱原 3、pH值值 最適最適pH為為7.27.4，低于，低于6.8或高于或高于7.6對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利 酚紅酚紅 細(xì)胞代謝產(chǎn)細(xì)胞代謝產(chǎn)乳酸乳酸 Na2HPO4/NaH2PO4 、NaHCO3/ CO2 HEPES(pKa 7.6) 10

16、50mM MOPS、DIPSO等。等。 4 4、滲透壓、滲透壓 理想的滲透壓可保持在理想的滲透壓可保持在290290300 300 mOsm(mOsm(milli - osmol )/kg)/kg，可通過增可通過增減減NaClNaCl的量調(diào)節(jié)的量調(diào)節(jié)。 1mg/ml NaCl NaCl 32 mOsm/kgmOsm/kg 1mol 1mol葡萄糖葡萄糖/kg/kg水水 冰點(diǎn)冰點(diǎn)-1.858-1.858 1000 mOsm/kgmOsm/kg 冰點(diǎn)冰點(diǎn)-0.186-0.186 100 mOsm/kgmOsm/kg 平衡鹽溶液（平衡鹽溶液（balanced salt solutionbalance

17、d salt solution，BSSBSS）維持滲透壓、維持滲透壓、pHpH 5、溫度、溫度 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度為370.5，可在，可在25253535生存和生長(zhǎng)，生存和生長(zhǎng)， 4040以上只能存活幾十分鐘到幾個(gè)小時(shí)。以上只能存活幾十分鐘到幾個(gè)小時(shí)。6 6、氧氣和二氧化碳、氧氣和二氧化碳 二氧化碳主要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的二氧化碳主要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，二氧化碳的比例可值，二氧化碳的比例可為為35% ； 氧氣影響細(xì)胞生長(zhǎng)，溶氧過高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，過低抑氧氣影響細(xì)胞生長(zhǎng)，溶氧過高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，過低抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。制細(xì)胞生長(zhǎng)。 可采用不同比例的可采用不同比例的氧氣、氮?dú)?/p>

18、、二氧化碳和空氣氧氣、氮?dú)?、二氧化碳和空氣加以調(diào)加以調(diào)節(jié)。節(jié)。 7、抗生素、抗生素 防止微生物污染可在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。防止微生物污染可在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。 生產(chǎn)中不準(zhǔn)使用生產(chǎn)中不準(zhǔn)使用青霉素青霉素和和-內(nèi)酰胺類抗生素內(nèi)酰胺類抗生素。 8、器材的消毒滅菌、器材的消毒滅菌 物理方法：物理方法：濕熱、干熱、紫外線、伽馬射線、過濾濕熱、干熱、紫外線、伽馬射線、過濾。 化學(xué)方法：化學(xué)方法：化學(xué)消毒劑，化學(xué)消毒劑，主要用于空氣、表面滅菌消毒、主要用于空氣、表面滅菌消毒、污染物品處理污染物品處理。 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 不同的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，一般無規(guī)不同

19、的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，一般無規(guī)律可循，常需要花費(fèi)很大的時(shí)間和精力確定適合的特定律可循，常需要花費(fèi)很大的時(shí)間和精力確定適合的特定細(xì)胞需要的培養(yǎng)基。細(xì)胞需要的培養(yǎng)基。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基按組成大致可分為三類：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基按組成大致可分為三類：v天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。 成分復(fù)雜、組分不穩(wěn)定、來源有限。成分復(fù)雜、組分不穩(wěn)定、來源有限。v補(bǔ)充血清的合成培養(yǎng)基補(bǔ)充血清的合成培養(yǎng)基 在一些在一些合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基中添加中添加520%血清而成。血清而成。 最常用的血清為最常用的血清為小牛血清、胎牛血清小牛血清、胎牛血清，還有馬血清等。

20、，還有馬血清等。 合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，目前商品化的有幾合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，目前商品化的有幾十種（如十種（如MEM、DMEM、RPMI1640、199等），主要等），主要由成分包括：由成分包括：v氨基酸氨基酸 必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他種類氨必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他種類氨基酸；基酸；v維生素維生素v能源物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酰胺）能源物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酰胺）v無機(jī)鹽無機(jī)鹽v緩沖體系緩沖體系a.其他成分其他成分 如核酸前體物質(zhì)（腺苷、鳥苷等）、脂類物如核酸前體物質(zhì)（腺苷、鳥苷等）、脂類物質(zhì)等質(zhì)等血清的作用：血清的作用：v提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種生長(zhǎng)因子和激素提供細(xì)胞

21、生長(zhǎng)所需的各種生長(zhǎng)因子和激素v提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼附因子和伸展因子提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼附因子和伸展因子v提供可識(shí)別金屬離子、激素、維生素、脂質(zhì)的結(jié)合蛋白提供可識(shí)別金屬離子、激素、維生素、脂質(zhì)的結(jié)合蛋白a.提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的脂肪酸和微量元素。提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的脂肪酸和微量元素。含血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)：含血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)：v血清的來源和批次不同導(dǎo)致培養(yǎng)差異血清的來源和批次不同導(dǎo)致培養(yǎng)差異v血清的保存期有限血清的保存期有限v血清很容易污染雜菌血清很容易污染雜菌v血清可能含病毒和支原體血清可能含病毒和支原體v血清本身所含蛋白增加了產(chǎn)品的分離純化難度血清本身所含蛋白增加了產(chǎn)品的分離純化難度v血清供應(yīng)問題

22、血清供應(yīng)問題a.成本高成本高v無血清的培養(yǎng)基無血清的培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中添加一些特殊成分而成：在合成培養(yǎng)基中添加一些特殊成分而成：v激素和生長(zhǎng)因子激素和生長(zhǎng)因子 (胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等)v結(jié)合蛋白（鐵傳遞蛋白、白蛋白）結(jié)合蛋白（鐵傳遞蛋白、白蛋白）v帖附和伸展因子（纖維結(jié)合蛋白膠原、一些多肽）帖附和伸展因子（纖維結(jié)合蛋白膠原、一些多肽）v其他有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）其他有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)： 提高了細(xì)胞培養(yǎng)的重現(xiàn)性、減少了血清帶來的污染問提高了細(xì)胞培養(yǎng)的重現(xiàn)性、減少了血清帶來的污染問題、

23、供應(yīng)充足、產(chǎn)品易于純化。題、供應(yīng)充足、產(chǎn)品易于純化。3.4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)過程一、動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)過程 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程通常大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程通常包括包括5個(gè)個(gè)時(shí)期：時(shí)期：1、游離期、游離期 又稱懸浮期，細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液為懸浮狀態(tài)，細(xì)胞為球又稱懸浮期，細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液為懸浮狀態(tài)，細(xì)胞為球形。形。 10min4h。2、貼壁期貼壁期 細(xì)胞附著在固體表面，在培養(yǎng)開始后細(xì)胞附著在固體表面，在培養(yǎng)開始后10min4h 貼壁。貼壁。 細(xì)胞貼壁需要特殊的表面或其他物質(zhì)，如細(xì)胞貼壁需要特殊的表面或其他物質(zhì)，

24、如膠原、玻璃、膠原、玻璃、塑料塑料等。等。 血清中含有促進(jìn)細(xì)胞貼壁的球蛋白、膠原、纖黏素等糖血清中含有促進(jìn)細(xì)胞貼壁的球蛋白、膠原、纖黏素等糖蛋白（蛋白（促貼壁因子促貼壁因子），這些蛋白帶正電荷，先吸附于固體表），這些蛋白帶正電荷，先吸附于固體表面，細(xì)胞再吸附在這些促貼壁因子表面。面，細(xì)胞再吸附在這些促貼壁因子表面。 3、潛伏期、潛伏期 細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，但無細(xì)胞分裂。細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，但無細(xì)胞分裂。 6h24h。4、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞活力最高，生長(zhǎng)速度最快。細(xì)胞活力最高，生長(zhǎng)速度最快。5、停止期（平臺(tái)期）、停止期（平臺(tái)期） 固體表面長(zhǎng)滿細(xì)胞，細(xì)胞雖有活力但不再分裂固體表面長(zhǎng)滿細(xì)胞，細(xì)胞雖有

25、活力但不再分裂。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 1、細(xì)胞分離、細(xì)胞分離（1）離心分離離心分離 從含有細(xì)胞體液中分離從含有細(xì)胞體液中分離 低速離心（低速離心（8001000rmp, 510min）（2）消化分離消化分離 組織塊剪碎消化液消化細(xì)胞懸液洗滌組織塊剪碎消化液消化細(xì)胞懸液洗滌細(xì)胞細(xì)胞 消化液：消化液： 胰蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、胰酶胰酶-檸檬酸鹽、胰酶檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶膠原酶等。等。 2、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)（1）自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù) 無法區(qū)分死活細(xì)胞無法區(qū)分死活細(xì)胞 無法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)無法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán) （2）血球計(jì)數(shù)板

26、計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 采用采用臺(tái)盼藍(lán)臺(tái)盼藍(lán)或或苯胺黑苯胺黑染色后計(jì)數(shù)可區(qū)分死活細(xì)胞。染色后計(jì)數(shù)可區(qū)分死活細(xì)胞。（3）結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法 結(jié)晶紫染色液（結(jié)晶紫結(jié)晶紫染色液（結(jié)晶紫+ 檸檬酸檸檬酸）能使細(xì)胞分離破碎，能使細(xì)胞分離破碎，細(xì)胞核細(xì)胞核染成藍(lán)色染成藍(lán)色，在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核即得細(xì)胞數(shù)。，在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核即得細(xì)胞數(shù)。（4）MTT(四甲基偶唑鹽四甲基偶唑鹽)染色計(jì)數(shù)染色計(jì)數(shù) MTT（淡黃淡黃）被活細(xì)胞）被活細(xì)胞線粒體脫氫酶線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿募自绿孓D(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿募自绿妫╢ormazan，紫色紫色），溶于脫色液，比色從標(biāo)準(zhǔn)曲線得細(xì)胞數(shù)。），溶于脫色液，比色從標(biāo)

27、準(zhǔn)曲線得細(xì)胞數(shù)。 3、細(xì)胞傳代、細(xì)胞傳代（1）懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞 稀釋傳代稀釋傳代 （2）貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 消化液（胰酶）消化倒去消化液加入消化液（胰酶）消化倒去消化液加入含血清的培養(yǎng)基傳代含血清的培養(yǎng)基傳代 4、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（1）凍存凍存 液氮（液氮（-196 ）保存）保存 凍存時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好凍存時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好 密度密度1 110106 6 2 10106 6 /ml 加加10%DMSO(二甲基亞砜二甲基亞砜)或甘油或甘油 降溫速度降溫速度 1 /min （2）復(fù)蘇復(fù)蘇 快融快融 從液氮罐中取出立即放入從液氮罐中取出立即放入3740 水浴中。水浴中。 離心換液離心換液 或

28、解凍后直接加培養(yǎng)基培養(yǎng)，或解凍后直接加培養(yǎng)基培養(yǎng)，46h貼壁后立即換貼壁后立即換液。液。 3.5 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模的培養(yǎng)方法一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模的培養(yǎng)方法 分為分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)）等。囊化培養(yǎng)）等。 1、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng) 適用于非貼壁依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。適用于非貼壁依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。 適應(yīng)于兼性貼壁細(xì)胞。適應(yīng)于兼性貼壁細(xì)胞。 Wellcome公司公司 8000L攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)Namalwa細(xì)細(xì)胞產(chǎn)胞產(chǎn)

29、干擾素干擾素。 Celltech公司公司2000L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)單抗。單抗。2、貼壁培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng) 細(xì)胞貼附在固體表面生長(zhǎng)以單層膜的形式生長(zhǎng)，適用于細(xì)胞貼附在固體表面生長(zhǎng)以單層膜的形式生長(zhǎng)，適用于貼壁依賴性細(xì)胞與兼性貼壁細(xì)胞。貼壁依賴性細(xì)胞與兼性貼壁細(xì)胞。 動(dòng)物細(xì)胞一般帶負(fù)電、帶動(dòng)物細(xì)胞一般帶負(fù)電、帶正電荷的固體表面正電荷的固體表面較理想有利較理想有利于粘附細(xì)胞。于粘附細(xì)胞。 貼壁培養(yǎng)的材料可采用貼壁培養(yǎng)的材料可采用玻璃玻璃和和一次性塑料（通常為聚苯一次性塑料（通常為聚苯乙烯）乙烯）等。等。 聚苯乙烯表面疏水，與細(xì)胞的相容性不好，經(jīng)過聚苯乙烯表

30、面疏水，與細(xì)胞的相容性不好，經(jīng)過 射射線、化學(xué)法和放電表面改性增強(qiáng)其表面電荷和浸潤(rùn)性能，線、化學(xué)法和放電表面改性增強(qiáng)其表面電荷和浸潤(rùn)性能，成為細(xì)胞培養(yǎng)的理想材料。成為細(xì)胞培養(yǎng)的理想材料。 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 15L的旋轉(zhuǎn)瓶的旋轉(zhuǎn)瓶 簡(jiǎn)單、比表面積小、勞動(dòng)強(qiáng)度大。簡(jiǎn)單、比表面積小、勞動(dòng)強(qiáng)度大。 以貼壁培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他操作方式可采用采以貼壁培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他操作方式可采用采用其他培養(yǎng)方式如用其他培養(yǎng)方式如微載體培養(yǎng)，中空纖維膜反應(yīng)器微載體培養(yǎng)，中空纖維膜反應(yīng)器培養(yǎng)。培養(yǎng)。3、微載體培養(yǎng)、微載體培養(yǎng) 微載體為直徑為微載體為直徑為100250um，適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的球適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的球狀顆粒

31、。狀顆粒。 微載體培養(yǎng)指將細(xì)胞貼附在微載體上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)指將細(xì)胞貼附在微載體上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v培養(yǎng)體系的比表面積大，可隨載體濃度的改變而改變，細(xì)培養(yǎng)體系的比表面積大，可隨載體濃度的改變而改變，細(xì)胞培養(yǎng)密度較高胞培養(yǎng)密度較高v培養(yǎng)體系均勻，培養(yǎng)重復(fù)性好培養(yǎng)體系均勻，培養(yǎng)重復(fù)性好v培養(yǎng)基的利用率高培養(yǎng)基的利用率高v取樣后很容易通過顯微鏡觀察載體表面的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況取樣后很容易通過顯微鏡觀察載體表面的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況v收獲細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物簡(jiǎn)單收獲細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物簡(jiǎn)單v放大容易放大容易v對(duì)人工和空間的需求低對(duì)人工和空間的需求低 優(yōu)良的微載體一般要具有以下特性：優(yōu)良的微載體一般要具有以下

32、特性： v載體表面與細(xì)胞相容性良好，帶較低的正電荷，適于細(xì)載體表面與細(xì)胞相容性良好，帶較低的正電荷，適于細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)胞的附著和生長(zhǎng)v微載體的相對(duì)密度略大于培養(yǎng)基，在微載體的相對(duì)密度略大于培養(yǎng)基，在1.031.05之間，之間，輕度攪拌就能時(shí)載體懸浮起來，停止攪拌很很快沉淀輕度攪拌就能時(shí)載體懸浮起來，停止攪拌很很快沉淀v顆粒粒度分布均勻，表面光滑利于細(xì)胞鋪展顆粒粒度分布均勻，表面光滑利于細(xì)胞鋪展v載體透明，容易用顯微鏡直接對(duì)細(xì)胞觀察載體透明，容易用顯微鏡直接對(duì)細(xì)胞觀察v材料無毒性材料無毒性v載體材料為非剛性材料，避免培養(yǎng)過程中相互碰撞損傷載體材料為非剛性材料，避免培養(yǎng)過程中相互碰撞損傷細(xì)胞細(xì)胞

33、v可以高溫滅菌可以高溫滅菌v惰性，不吸收或少吸收培養(yǎng)基組分惰性，不吸收或少吸收培養(yǎng)基組分v能重復(fù)使用，價(jià)廉能重復(fù)使用，價(jià)廉 微載體的材料有微載體的材料有聚苯乙烯、葡聚糖、纖維素、膠原聚苯乙烯、葡聚糖、纖維素、膠原等等。 多孔微載體多孔微載體：極大增大了比表面積：極大增大了比表面積 v加鈦載體（高比重，適用于流化床反應(yīng)器）加鈦載體（高比重，適用于流化床反應(yīng)器）v普通載體普通載體 4、微囊化培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng) 指將動(dòng)物細(xì)胞包裹在親水的球狀半透性薄膜形成的指將動(dòng)物細(xì)胞包裹在親水的球狀半透性薄膜形成的微囊內(nèi)。微囊內(nèi)。 營(yíng)養(yǎng)成分能透過，但細(xì)胞不能出來營(yíng)養(yǎng)成分能透過，但細(xì)胞不能出來。 適用于適用于貼壁依賴性

34、細(xì)胞貼壁依賴性細(xì)胞和和非貼壁依賴性細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v減少了攪拌、通氣對(duì)細(xì)胞的影響減少了攪拌、通氣對(duì)細(xì)胞的影響v細(xì)胞在微小的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，能達(dá)到很高的細(xì)胞密度細(xì)胞在微小的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，能達(dá)到很高的細(xì)胞密度 制備動(dòng)物細(xì)胞微囊的材料通常為制備動(dòng)物細(xì)胞微囊的材料通常為海藻酸鹽海藻酸鹽和和多聚賴多聚賴氨酸（分子量一般在氨酸（分子量一般在40,00080,000）。 海藻酸鹽是由海藻酸鹽是由D-甘露糖醛酸和甘露糖醛酸和L-古羅糖古羅糖醛酸通過醛酸通過1,4糖苷鍵連接而成。糖苷鍵連接而成。 動(dòng)物細(xì)胞微囊化： 海藻酸聚陰離子和聚賴氨酸聚陽離子形成聚電解質(zhì)的膜。 5. 包埋培養(yǎng)包埋培養(yǎng)

35、采用各種凝膠進(jìn)行包埋后培養(yǎng)，主要的凝膠載采用各種凝膠進(jìn)行包埋后培養(yǎng)，主要的凝膠載體為海藻酸凝膠、瓊脂糖等。體為海藻酸凝膠、瓊脂糖等。 動(dòng)物細(xì)胞包埋后細(xì)胞活性不高，很少采用。動(dòng)物細(xì)胞包埋后細(xì)胞活性不高，很少采用。6. 結(jié)團(tuán)培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng) 某些結(jié)團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞某些結(jié)團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞 細(xì)胞本身作為貼附基質(zhì)細(xì)胞本身作為貼附基質(zhì),可加入直徑較小的顆?？杉尤胫睆捷^小的顆粒（20um）促進(jìn)結(jié)團(tuán)促進(jìn)結(jié)團(tuán) 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 分為分為分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、灌流分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)。培養(yǎng)。 1、分批培養(yǎng)、分批培養(yǎng)2、流加培養(yǎng)、流加培養(yǎng) 培

36、養(yǎng)過程中反應(yīng)體積不斷增加。培養(yǎng)過程中反應(yīng)體積不斷增加。 流加培養(yǎng)可以補(bǔ)充細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)胞在較流加培養(yǎng)可以補(bǔ)充細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于較好的環(huán)境中生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)物的形成和細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于較好的環(huán)境中生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)物的形成和細(xì)胞濃度提高。濃度提高。 可避免高濃度基質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用?？杀苊飧邼舛然|(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。3、半連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng) 培養(yǎng)開始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度，取出部分培養(yǎng)開始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度，取出部分培養(yǎng)液，同時(shí)反應(yīng)器中補(bǔ)加相同的體積的培養(yǎng)基，再按分批培養(yǎng)液，同時(shí)反應(yīng)器中補(bǔ)加相同的體積的培養(yǎng)基，再按分批操作的方式進(jìn)行培養(yǎng)。操作的

37、方式進(jìn)行培養(yǎng)。 又稱為又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)反復(fù)分批培養(yǎng)或或換液培養(yǎng)換液培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、可反復(fù)收獲產(chǎn)品操作簡(jiǎn)單、可反復(fù)收獲產(chǎn)品 4、連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng) 培養(yǎng)開始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷培養(yǎng)開始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。 細(xì)胞生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率和稀釋率相同時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率和稀釋率相同時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境良好穩(wěn)定、可連續(xù)不斷獲得產(chǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境良好穩(wěn)定、可連續(xù)不斷獲得產(chǎn)品

38、和細(xì)胞。品和細(xì)胞。5、灌流培養(yǎng)、灌流培養(yǎng) 在細(xì)胞培養(yǎng)至一定程度后，將新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)至一定程度后，將新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，同時(shí)將不含細(xì)胞的培養(yǎng)液不斷取出，細(xì)胞保留在反應(yīng)器器，同時(shí)將不含細(xì)胞的培養(yǎng)液不斷取出，細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)。內(nèi)。 灌注培養(yǎng)可保持細(xì)胞良好的培養(yǎng)條件，灌注培養(yǎng)可保持細(xì)胞良好的培養(yǎng)條件，不斷排出有害代謝不斷排出有害代謝產(chǎn)物產(chǎn)物，培養(yǎng)細(xì)胞能達(dá)到很高的濃度，培養(yǎng)細(xì)胞能達(dá)到很高的濃度，連續(xù)收獲產(chǎn)品連續(xù)收獲產(chǎn)品。3.6 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模較小，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模較小，100L以上即為生產(chǎn)規(guī)模。以上即為生產(chǎn)規(guī)模。1、轉(zhuǎn)瓶、轉(zhuǎn)瓶 仍然用于一

39、些病毒疫苗的生產(chǎn)和細(xì)胞種子培養(yǎng)。仍然用于一些病毒疫苗的生產(chǎn)和細(xì)胞種子培養(yǎng)。2、通氣攪拌式反應(yīng)器、通氣攪拌式反應(yīng)器 動(dòng)物細(xì)胞不耐剪切力，而且培養(yǎng)基容易產(chǎn)生泡沫動(dòng)物細(xì)胞不耐剪切力，而且培養(yǎng)基容易產(chǎn)生泡沫。 用于動(dòng)物細(xì)胞的攪拌式反應(yīng)器的通氣裝置和攪拌槳具用于動(dòng)物細(xì)胞的攪拌式反應(yīng)器的通氣裝置和攪拌槳具有特殊的結(jié)構(gòu)，可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有特殊的結(jié)構(gòu)，可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。 聚丙烯中空纖維膜聚丙烯中空纖維膜 或或 薄硅膠管薄硅膠管 園底、高徑比園底、高徑比11.5:13、氣升式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器 氣體通過反應(yīng)器底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流筒，氣體通過反應(yīng)器底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流筒，使得到流筒中的液體總

40、體密度低于外部區(qū)域，從而一直使得到流筒中的液體總體密度低于外部區(qū)域，從而一直上升，導(dǎo)致液體在反應(yīng)器中循環(huán)。上升，導(dǎo)致液體在反應(yīng)器中循環(huán)。 高徑比大高徑比大10:1。 氣泡直徑氣泡直徑12mm 空氣流速空氣流速0.010.06vvm 剪切力小，混合均一剪切力小，混合均一 氧和營(yíng)養(yǎng)的傳遞好氧和營(yíng)養(yǎng)的傳遞好 有利于設(shè)備的密封有利于設(shè)備的密封 4、中空纖維膜反應(yīng)器、中空纖維膜反應(yīng)器 由很多中空纖維膜（一般為超濾膜）組成的反應(yīng)器。由很多中空纖維膜（一般為超濾膜）組成的反應(yīng)器。 結(jié)構(gòu)上分為管外空間和管內(nèi)空間，細(xì)胞在管外空間生結(jié)構(gòu)上分為管外空間和管內(nèi)空間，細(xì)胞在管外空間生長(zhǎng)，長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞可貼在膜外表

41、面生長(zhǎng)，可貼在膜外表面生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞可管外空間可管外空間懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)基從中空纖維管內(nèi)通過，養(yǎng)分和溶氧通過懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)基從中空纖維管內(nèi)通過，養(yǎng)分和溶氧通過膜的擴(kuò)散到管外，代謝廢物擴(kuò)散至管內(nèi)被帶走。膜的擴(kuò)散到管外，代謝廢物擴(kuò)散至管內(nèi)被帶走。 用途較廣。用途較廣。 細(xì)胞培養(yǎng)密度高細(xì)胞培養(yǎng)密度高 108/ml 細(xì)胞分裂停止細(xì)胞分裂停止 代謝和分化功能可代謝和分化功能可 保持?jǐn)?shù)月保持?jǐn)?shù)月5、平板膜反應(yīng)器、平板膜反應(yīng)器 懸浮細(xì)胞和貼懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞壁細(xì)胞 6、流化、流化床和固床和固定床反定床反應(yīng)器應(yīng)器 3.7 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例一、類淋巴細(xì)胞干擾素一、類淋巴細(xì)胞干擾素(

42、Na-IFN- ，interferon IFN) 由由Namalva細(xì)胞（淋巴瘤患者中分離獲得）生產(chǎn)細(xì)胞（淋巴瘤患者中分離獲得）生產(chǎn) 攪拌罐生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（攪拌罐生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（8000L） 80% IFN-(多種亞型多種亞型) 20% IFN-細(xì)胞逐級(jí)擴(kuò)大細(xì)胞逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)（培養(yǎng)（8000L）10%小牛血清小牛血清RPMI16401 110106 6 / /mlml丁酸鈉或丁酸鈉或IFNIFN啟動(dòng)啟動(dòng) 仙臺(tái)病毒誘生仙臺(tái)病毒誘生單抗或單抗或多抗親多抗親和層析和層析TCA沉淀沉淀超濾濃縮超濾濃縮收獲離心收獲離心Na-IFN-48h18hSephadex G75二、組織型纖溶酶原激活劑（二、

43、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA） 人人t-PA基因位于第基因位于第8號(hào)染色體號(hào)染色體p12q11.2區(qū)區(qū) 14個(gè)外顯子和個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子個(gè)內(nèi)含子 全長(zhǎng)全長(zhǎng)36,594bp t-PA為單鏈為單鏈 527aa MW 67,00072,000 等電點(diǎn)等電點(diǎn)7.88.6, pH 5.88.0穩(wěn)定穩(wěn)定 17對(duì)二硫鍵對(duì)二硫鍵 三個(gè)糖基化位點(diǎn)三個(gè)糖基化位點(diǎn) 275Arg- 276Ile 能被纖溶酶、組織激肽釋放酶作用裂解成雙鏈。能被纖溶酶、組織激肽釋放酶作用裂解成雙鏈。作用機(jī)理：作用機(jī)理： 游離游離t-PA對(duì)纖溶酶原親和力很低，不產(chǎn)生激活作用。對(duì)纖溶酶原親和力很低，不產(chǎn)生激活作用。 t-PA對(duì)血栓中纖

44、維蛋白有很強(qiáng)親和力，與纖維蛋白結(jié)對(duì)血栓中纖維蛋白有很強(qiáng)親和力，與纖維蛋白結(jié)合后的合后的t-PA能夠激活纖溶酶原，形成纖溶酶，纖溶酶在能夠激活纖溶酶原，形成纖溶酶，纖溶酶在血栓部位水解纖維蛋白，使血栓溶解。血栓部位水解纖維蛋白，使血栓溶解。 少量進(jìn)入血液的纖溶酶能可被少量進(jìn)入血液的纖溶酶能可被2-抗纖溶酶抗纖溶酶作用失活。作用失活。纖維蛋白纖維蛋白t-PAt-PAt-PA纖溶酶原纖溶酶原纖溶酶纖溶酶纖溶酶纖溶酶2抗纖溶酶抗纖溶酶t-PA 的生產(chǎn)：的生產(chǎn)： 采用采用CHO工程細(xì)胞株生產(chǎn)工程細(xì)胞株生產(chǎn) 微載體微載體 攪拌式灌流培養(yǎng)攪拌式灌流培養(yǎng) 、流化床灌流培養(yǎng)、流化床灌流培養(yǎng) Verax 2000

45、(24L)流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器 灌流灌流 330L/d，20g/d, 27d t-PA 的純化：的純化：螯合鋅瓊脂糖螯合鋅瓊脂糖層析層析ConA瓊脂糖瓊脂糖層析層析 凝膠過濾凝膠過濾Streamline SP陽離子擴(kuò)張床陽離子擴(kuò)張床賴氨酸賴氨酸-Sepharose 4B 賴氨酸可與賴氨酸可與t-PA 的的Kringle結(jié)構(gòu)區(qū)（結(jié)構(gòu)區(qū)（K2）結(jié)合結(jié)合 t-PA 用量用量 一般一般100mg（15mg/2min + 50mg/30min + 35mg/60min ） 90min內(nèi)再通率內(nèi)再通率 75% 顱內(nèi)出血率顱內(nèi)出血率 0.6%t-PA 的改造：的改造： 體內(nèi)半衰期很短體內(nèi)半衰期很短(3.

46、5+1.5min) Reteplase（r-PA） Tenecteplase（TNK-t-PA）(17 +7min) TNK-t-PA采用采用CHO工程細(xì)胞表達(dá)，生產(chǎn)工藝與工程細(xì)胞表達(dá)，生產(chǎn)工藝與t-PA基本基本相同，用藥量由相同，用藥量由100mg下降至下降至40mg。 Asn103 (Thr)Gln117 (Asn)Ala296 -Ala -Ala -Ala(Lys-His-Arg-Asp)PAI-1 纖溶纖溶酶原激活酶原激活劑抑制物劑抑制物3.8 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望一、改進(jìn)表達(dá)載體一、改進(jìn)表達(dá)載體 提高表達(dá)水平和產(chǎn)量提高表達(dá)水平和產(chǎn)量1、采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子2、利用擴(kuò)增系統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_(dá)位點(diǎn)、利用擴(kuò)增系統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_(dá)位點(diǎn) 提高基因拷貝數(shù)：提高基因拷貝數(shù)：v與篩選標(biāo)記基因共擴(kuò)增與篩選標(biāo)記基因共擴(kuò)增 二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶dhfr基因，防止氨甲蝶呤基因，防止氨甲蝶呤MTX毒害毒害v自我復(fù)制型載體，以附加體形式存在自我復(fù)制型載體，以附加體形式存在 pCEP4(190) pABWN (50100) 整合到染色體整合到染色體“熱點(diǎn)熱點(diǎn)”: 篩選基因和報(bào)告基因兩側(cè)加入人工重組酶位點(diǎn)篩選基因和報(bào)告基因兩側(cè)加入人工重組酶位點(diǎn) 目的基