細(xì)胞生物學(xué)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案剖析

1、組織培養(yǎng)2015-1111細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)之植物組織培養(yǎng)鍵入公司名稱|細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)之植物組織培養(yǎng)非.一.非.參考參考、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)和配制植物組織 MS固體培養(yǎng)基;2. 學(xué)習(xí)和使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；3. 了解和掌握無菌操作；4. 將胡蘿卜貯藏組織培養(yǎng)成胡蘿卜幼苗。二、實(shí)驗(yàn)原理:并具有細(xì)胞全能性（cell tot ip ote ncy）：植物體的每一個細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組， 發(fā)育成為完整植株的潛在能力。植物的任何細(xì)胞、 組織和器官，在人工預(yù)知的控制條件下，放在含有營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑等組成的培養(yǎng)基中，使其生長、分化、形成完整植株的過程，稱為植物組織培養(yǎng)。三、實(shí)驗(yàn)器材:1、實(shí)驗(yàn)材料：新鮮的

2、質(zhì)量良好胡蘿卜肉質(zhì)根。2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備（1）儀器設(shè)備：冰箱、普通天平、分析天平、各種型號的試劑瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、搪瓷杯、藥勺、稱量紙、玻棒、標(biāo)簽紙、電磁爐，三角瓶、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（PH5.47.0）、藥勺、封口膜、牛皮紙、橡皮筋、棉線、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精棉 球、小塊紗布、已滅菌濾紙、槍狀鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、酒精棉 球、小塊紗布、滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床（震蕩培養(yǎng)箱）等。其中主要儀器設(shè)備為滅菌鍋，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱等。（2）藥品硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷

3、、乙二胺四乙酸二鈉、 硫酸亞鐵、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆素、煙酸、 肌醇、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸卜NAA （ a -萘乙酸）、6-BA （ 6-芐基腺嘌呤）、KT、濃鹽 酸、氫氧化鈉、濃硫酸、重鉻酸鉀、95%酒精、蒸餾水、MS培養(yǎng)基母液化學(xué)組分、瓊脂、蔗糖、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1mol L-1HCI、1mol - L-1NaOH、胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、無菌水、75 %酒精、0.1%HgCl2。MS培養(yǎng)基母液、瓊脂、蔗糖、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸 餾水、1mol L-1HCl、1mol - L-1NaOH、愈傷組織繼代培養(yǎng)基、75%酒精。四、實(shí)驗(yàn)步驟:實(shí)驗(yàn)總體流程:MS培養(yǎng)基母液的配

4、制與保存MS固體培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基與接種用具的火菌取材與消毒胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)（接種和初代培養(yǎng)）胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)胡蘿卜愈傷組織器官分化培養(yǎng)胡蘿卜幼苗培養(yǎng)10100 倍。1.MS培養(yǎng)基母液的配制與保存化學(xué)藥品1升量10 升量（10X） 50 升量（50X）NH4NO31650 mg16.5gKNOs1900 mg19.0gCaCl2 2fO (CaCl2)440 mg ()4.4gMgSO4 7H2O ( MgSO4)370 mg ()3.7gKH2PO4170 mg1.7g（一）母液的配制：母液是欲配制培養(yǎng)基的濃縮液，一般配成比所需濃度高1、MS大量元素母液

5、（10 X）稱10升量溶解在1升蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液100ml。2、MS微量元素母液（100 X）稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml?；瘜W(xué)藥品1升量10升量100 升量(100X)MnSO4 4H2O22.3mg223mg(MnSO4 H2O)(21.4 mg)(214 mg)ZnSO4 7H2O8.6 mg86mgH3BO36.2 mg62 mgKI0.83 mg8.3 mgNa2MoO 4 2H2O0.25 mg2.5mgCuSO4 5h2O0.025 mg0.25mgC0CI2 6H2O0.025mg0.25mg注意：CoCl2 - 6H2O和 CuS

6、O4 5H2O可按 10 倍量(0.25 mgX 10=2.5 mg )或 100 倍量(25 mg)稱取后，定容于 100ml水中，每次取 10ml或1ml，即含0.25 mg的量。3、1MS鐵鹽母液（100X）稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml?；瘜W(xué)藥品1升量10升量100升量（100X）Na2 EDTA37.3 mg373 mgFeSO4 7HO27.8 mg278 mg注意配制時，兩種成分分別溶解在少量蒸餾水中，其中EDTA鹽較難完全溶解，可適當(dāng)加熱?；旌蠒r，先取一種置容量瓶（燒杯）中，然后將另一種成分逐加逐劇烈震蕩，至產(chǎn)生深黃色溶液，最后定容，保存在棕色試

7、劑瓶中。4、1MS有機(jī)物母液（100X）稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml?；瘜W(xué)藥品1升量10升量100 升量(100X)煙酸0.5 mg5mg鹽酸吡哆素（VB6 ）0.5 mg5mg鹽酸硫胺素（VB1 ）0.4 mg4 mg肌醇100 mg1 g甘氨酸2 .0mg20mg5、生長調(diào)節(jié)劑單獨(dú)配制，濃度為 1 5 mg/ml （書中為0.5 1 mg/ml），本實(shí)驗(yàn)要求配成 1 mg/ml。 配制培養(yǎng)基母液時注意事項(xiàng)： 一些離子易發(fā)生沉淀，可先少量水溶解，在按配方順序依次混合； 配制母液時用蒸餾水或重蒸餾水； 藥品應(yīng)用化學(xué)純或分析純； 溶解生長素時，可用少量0.1 1

8、 N的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素類用0.11 N的HCI加熱溶解（如再加蒸餾水，易產(chǎn)生白色沉淀，此時可加入熱水）（二）母液的保存組織培養(yǎng)2015-11111、裝瓶：將配制好的母液分別裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，注明各培養(yǎng)基母液的名稱、濃縮倍數(shù)、日期、配制者。（注意將易分解、氧化者，放入棕色瓶中）例如： MS鐵鹽（100 X）2、貯藏：4C冰箱。（三）注意事項(xiàng)1. 6-BA，NAA用量甚微，取用時要使用移液管，移液管越小越精確。2 .注意配制大量元素母液時防止鈣鹽與硫酸鹽和磷酸鹽產(chǎn)生沉淀；3鐵鹽母液用棕色瓶保存。注意pH的調(diào)節(jié)；2.MS固體培養(yǎng)基配制1 L固體MS培養(yǎng)基配制：（1） 用量筒

9、從各種母液中分別取出所需的用量：MS大量元素母液100ml, MS微量元素 母液、MS鐵鹽母液和 MS有機(jī)物母液各10ml。（2）用電子天平稱出 8 g瓊脂粉和30 g蔗糖放在燒杯中，加入少量的蒸餾水在微波爐 中加熱使之溶解。（3）再用移液器取適量的 6- BA和NAA放入組培瓶里。各種類型的培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基：MS0，即：MS +30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉；誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基有 2種，分別為MS0 +0 . 1 mg/L 2,4-D和 MS0 + 2mg/L 2 ,4-D +0.2 mg/L 6-BA （本次實(shí)驗(yàn)采用后者）；（4）最后用蒸餾水定容到 1 L ;用1 mol/L NaO

10、H 或1 mol/LHCL 溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 值至5.86.0。（5） 盡快分裝，培養(yǎng)基占容器的1/5-1/4 為宜（20-25 mL ）,盡量避免培養(yǎng)基沾到容器 內(nèi)壁或容器口，標(biāo)記日期。（6） 用橡皮圈和牛皮紙封口。3培養(yǎng)基與接種器材的滅菌1、洗滌：把組織培養(yǎng)基用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、燒杯等玻璃器皿（根據(jù)實(shí)際需要） 進(jìn)行徹底清洗。自然晾干或烘箱干燥。2、包扎：用牛皮紙、報紙、紗布或錫箔紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。3、無菌水：用洗凈的 2個500mL錐形瓶分別裝取400mL蒸餾水，用牛皮紙封口。4、裝水：在高壓滅菌鍋內(nèi)裝入一定量的水（水要淹沒電熱絲）。（切忌干燒?。?、裝物品：在

11、滅菌鍋內(nèi)放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或三角瓶、裝蒸餾水的錐形瓶，以及包 扎好的玻璃器皿和金屬器械等。6、滅菌：將排氣閥開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣（此時水蒸氣橫向噴出）再關(guān)閉閥們；或者當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至49.0KPa時，開啟排氣閥，將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。當(dāng)鍋內(nèi)壓力達(dá)到108KPa時，溫度為121 C時，維持15-20分鐘，即可達(dá)到滅菌的目的。（若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。）切斷電源，讓滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s。7、70%酒精的制備與75%的酒精棉的制作。注意事項(xiàng)：1. 滅菌時間和壓力、溫度的控制；2. 先打開放氣閥，等到壓力顯示為0時，再打開鍋蓋；3. 分裝要干凈，滅菌時錐形瓶盡可能放

12、正，不要使培養(yǎng)基流出；4. 若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效；5. 開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶儲藏于30C以下的室內(nèi)，最好儲藏在4-10C的條件下。4、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)接種環(huán)境1、先用75%酒精擦拭超凈臺的內(nèi)部 6個面。2、將現(xiàn)配的75%的酒精、0.1%的升汞溶液、刀、鑷子、無菌紙、無菌水、小燒杯、培 養(yǎng)皿、廢液缸、試管架、打火機(jī)等操作用的工具放置到相應(yīng)位置。3、 將酒精燈添加適當(dāng)?shù)木凭ú怀^容積的2/3）,并檢查是否可以點(diǎn)燃。4、先開紫外燈40min，后再通風(fēng)20min。5、進(jìn)入操作臺的物品都要經(jīng)酒精消毒。接種1、在無菌操作臺上操作。2

13、、點(diǎn)燃酒精燈，倒平板。3、 消毒外植體：把清洗好的胡蘿卜塊根放入無菌操作臺，消毒先用70%酒精對胡蘿卜 直根消毒5min，再用0.1%的升汞溶液消毒10min，用無菌水沖洗 3次，放入成有無菌水的 燒杯中待用。4、 拆刀鑷，先放在盛有工業(yè)酒精浸泡的管口瓶中，使用時在酒精燈的火焰上灼燒滅菌。5、 切外植體：用消毒好的小刀沿截面將其橫切成厚度35mm左右的小圓片，然后如 圖所示切，將韌皮部和木質(zhì)部切去，留下形成層。6、接種外植體，45個/培養(yǎng)皿：打開牛皮紙時三角瓶瓶口應(yīng)該傾斜并近酒精燈火焰，接種時，要求懸空放入，不要接觸三角瓶的內(nèi)壁，胡蘿卜在培養(yǎng)基 在揭開封 口和封口時，可以將三角瓶口放在火焰上灼

14、燒一下。7、用橡皮圈和牛皮紙封口。8、貼上標(biāo)簽紙。 注意事項(xiàng)：1. 在接種過程中，手不能接觸外植體；2. 每次接種前做好接種工具的滅菌工作；3. 可以對手進(jìn)行多次的消毒處理；4. 實(shí)驗(yàn)廢液不能隨意處置，需要收集后進(jìn)行專門處理。鍵入公司名稱|細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)之植物組織培養(yǎng)5、胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)1.胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制（1）配方：MS 基本培養(yǎng)基 +2.0mg/L NAA+0.1mg/L 6 BA+200mg/L 水解酪蛋白 +3% 蔗（2）配制流程：（同胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制）。2. 準(zhǔn)備工作接種室的清潔和消毒；超凈工作臺的開機(jī)和消毒；剪刀、鑷子、已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿和 濾紙、待

15、用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備； 材料的準(zhǔn)備（選擇裝有無污染的已經(jīng)分化出愈傷組織的外植體 的三角瓶擺放在干凈工作臺上）3. 愈傷組織的繼代培養(yǎng)將上次接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的無污染的外植體上產(chǎn)生的愈傷組織剝離轉(zhuǎn)移接 到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，放置于25C全黑的暗條件下進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，搖床上震蕩培養(yǎng)以分離得到單細(xì)胞。已獲得足夠的愈傷組織，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。6、愈傷組織器官分化培養(yǎng)（1 ）準(zhǔn)備工作 接種室的清潔和消毒 ； 超凈工作臺的開機(jī)和消毒； 剪刀、鑷子、已滅菌培養(yǎng)皿和濾紙、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備； 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備（選擇裝有無污染的已分化出愈傷組織的外植體的三角瓶擺放于凈 工作臺上）； 無菌條件下

16、，用鑷子夾取胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織，置于一個皿底鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖刀挑取愈傷組織上活躍生長的部分用于接種。（2） 挑選色澤淡黃、松散、生長旺盛的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上，于光暗比14 h : 10h、25 C條件下培養(yǎng)約 30 d,誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。7、蓋,中,（3）配方：MS基本培養(yǎng)基+ 0.1mg/L NAA + 1mg/L 6-BA + 0.7 %瓊脂+ 3 %蔗糖（配制 方法同上）。胡蘿卜幼苗培養(yǎng)待生根植株形成一定量的根系并長至67片葉時，進(jìn)行煉苗。煉苗約7 d后開啟瓶在超凈臺上將其拔出，用無菌水輕輕沖洗除去根系上的培養(yǎng)基，再移入裝有土的盆缽再進(jìn)行常規(guī)栽培管理。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2015.10.212015.11.23胡蘿卜植物組織培養(yǎng)之胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng);組織培養(yǎng)2015-11112015.11.232015.12.胡蘿卜植物組織培養(yǎng)之胡蘿卜愈傷組織分化培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)圖片:2015.11.022015.10.21一 二2015.11.162015.1